Uma abordagem baseada em microscopia intravital para avaliar a permeabilidade intestinal e o desempenho do derramamento de células epiteliais

O intestino é um órgão altamente especializado com uma função fortemente regulamentada que permite processos conflitantes, ou seja, nutrição e proteção contra substâncias luminais nocivas. Forro entre o corpo humano e o ambiente, o epitélio intestinal atua como uma barreira física e imunológica e contribui para a manutenção da homeostase mucosa no intestino^1,,2. A perda de integridade epitelial e o aumento da permeabilidade da junção apertada é bem conhecido por estar associado à Doença Inflamatória Intestinal (DII)^3,,4,,5,6. Alterações epiteliais são então consideradas como causas e amplificadores secundários para inflamação intestinal crônica no DII. Assim, uma melhor compreensão das alterações epiteliais precoces no intestino dos pacientes com IBD seria de imenso valor para o desenvolvimento de novas estratégias para restaurar a integridade epitelial para previsão confiável e posterior prevenção de recaídas do IBD.

O epitélio intestinal segue um processo de rotatividade complexo e bem regulado. A partir do fundo da cripta, as células epiteliais intestinais (IECs) terminantemente diferenciadas derivadas de células-tronco pluripotentes migram para cima para a ponta villus, onde células envelhecidas/danificadas são derramadas no lúmen⁷. O equilíbrio entre divisão e extrusão celular permite a manutenção dos números de células epiteliais intestinais, evitando a formação de lacunas e vazamentos, bem como o acúmulo de células epiteliais potencialmente levando a massas celulares e tumorigênese^8,,9,,10. Apesar do papel fundamental do derramamento de células epiteliais na renovação fisiológica do epitélio intestinal, o conhecimento sobre os mecanismos moleculares que conduzem a extrusão das células na ponta villus é limitado. Assim, há a necessidade de pesquisas básicas fornecendo uma descrição precisa da sequência de eventos moleculares envolvidos no derramamento de células epiteliais.

Interações complexas entre diferentes tipos de células dentro da mucosa intestinal são fundamentais para entender os mecanismos moleculares que regulam a rotatividade epitelial e a homeostase intestinal. Assim, estudos in vivo oferecem altas vantagens sobre abordagens in vitro e ex vivo nesse contexto. Além disso, as técnicas de imagem em tempo real permitem a descrição da sequência de eventos que controlam fenômenos específicos. Nesse contexto, o estudo de processos altamente dinâmicos exige o uso de técnicas otimizadas de alta resolução para a observação direta do tecido. As técnicas de imagem intravital aparecem como ferramentas únicas e adequadas para o estudo do derramamento de células epiteliais no intestino.

O termo “microscopia intravital” refere-se a abordagens experimentais que aproveitam técnicas de imagem de alta resolução (microscopia multifotícola ou confocal) para visualizar diretamente células e tecidos em seus ambientes nativos dentro de um animal vivo¹¹. Permite a aquisição em tempo real de informações in vivo até a resolução unicelular, e implica vantagens claras sobre métodos estáticos ou de baixa resolução. A microscopia intravital fornece informações complementares e supera algumas limitações de técnicas clássicas e/ou high-end, como artefatos devido ao processamento de tecidos. Em contrapartida, a principal limitação da microscopia intravital é que o tecido deve ser diretamente exposto ao microscópio, que na maioria dos casos requer cirurgia. Embora abordagens sofisticadas preservem a vitalidade e minimizem o impacto do tecido imageado (câmaras de dobras cutâneas e janelas de imagem)^12,13, na maioria dos casos é realizada uma simples incisão cutânea para a externalização do tecido (retalhos de pele)¹⁴. Na última década, essas abordagens contribuíram com evidências fundamentais sobre processos altamente dinâmicos, antes inescrutáveis. Traduzindo, a imagem em tempo real forneceu novas percepções biológicas sobre células-tronco e leucócitos^15,bem como a disseminação do câncer e a formação de metástases^13,16. No contexto clínico, a endomicroscopia é atualmente explorada como ferramenta diagnóstica de câncer¹⁷ e doenças gastrointestinais, como o IBD^18,19; enquanto a microscopia confocal mosaico tornou-se uma ferramenta de patologia rápida durante a cirurgia²⁰. Juntas, a microscopia intravital tem emergido recentemente como uma ferramenta valiosa e versátil para pesquisa biomédica e futura aplicação na clínica.

A microscopia intravital está aqui implementada para visualização em tempo real de vazamento epitelial intestinal e observação de eventos de derramamento de células epiteliais. O vazamento da permeabilidade intestinal pode ser identificado por outras técnicas in vivo não invasivas, como a quantificação da administração oral de rastreadores fluorescentes no soro²¹. No entanto, essa técnica não permite a observação direta do desempenho de derramamento nem a segregação entre permeabilidade para-e transcelular. A combinação de experimentos de rastreador padrão e microscopia intravital representa uma abordagem adequada para: i) identificar distúrbios na permeabilidade intestinal, e ii) segregar entre permeabilidade epitelial para e transcelular. Além do derramamento de células, a microscopia intravital em combinação com a rotulagem de fluorescência in vivo permite o estudo de outros mecanismos celulares e moleculares (por exemplo, redistribuição de junção apertada durante o derramamento de células usando camundongos repórteres fluorescentes²² ou interações entre IECs e outras células dentro da mucosa intestinal²³).

O método aqui apresentado representa uma adaptação da microscopia intravital para permitir a observação em tempo real da mucosa intestinal, utilizando microscopia de escaneamento a laser confocal (CLSM). Portanto, usamos camundongos eliminatórios condicionais de GGTase (Geranylgeranyltransferase) em células epiteliais intestinais (IECs) em(camundongos Pggt1b^iΔIEC), uma vez que sofrem de uma doença intestinal grave e aumento da permeabilidade epitelial²⁴. São descritas a preparação cirúrgica do camundongo e a coloração da mucosa intestinal, bem como as configurações adequadas utilizadas para aquisição de imagens e análise pós-aquisição. Este protocolo poderia permitir estudos futuros contribuindo para o conhecimento atual sobre dinâmica e cinética do derramamento de células epiteliais intestinais. Além disso, o protocolo poderia servir de base para várias adaptações para estudar outros fenômenos que ocorrem na superfície da mucosa intestinal, e até mesmo em outros tecidos.