גישה תוך-ויטאלית המבוססת על מיקרוסקופיה להערכת חמלה במעיים וביצועי שפיכת תאים אפיתל

המעי הוא איבר מיוחד מאוד עם פונקציה מוסדרת היטב המאפשרת תהליכים סותרים, כלומר תזונה והגנה מפני חומרים זוהרים מזיקים. רירית בין גוף האדם לסביבה, אפיתל המעי פועל כמחסום פיזי ואימונולוגי ותורם לתחזוקה של הומאוסטאזיס רירית בבטן^1,,2. אובדן שלמות אפיתל וחחלת צומת הדוקה מוגברת ידוע להיות קשור עם מחלות מעי דלקתיות (IBD)^3,,4,,5,,6. שינויים אפיתל נחשבים לאחר מכן כגורמים ומדלקים משניים לדלקת מעיים כרונית בIBD. לכן, הבנה משופרת של שינויים אפיתל מוקדם בבטן של חולי IBD יהיה בעל ערך עצום לפיתוח אסטרטגיות חדשות כדי לשחזר את שלמות האפיתל לחיזוי אמין ומניעה שלאחר מכן של נסיגה IBD.

אפיתל מעיים עוקב אחר תהליך תחלופה מורכב ומוסדר היטב. מתחתית הקריפטה, תאי אפיתל מעיים מובחן סופני (IECs) המופקים מתאי גזע פלורופוטנטיים נודדים כלפי מעלה אל קצה הווילוס, שם נשפכים תאים^{בגילאים/פגומים לתוך}הלומן 7 . שיווי המשקל בין החלוקה לבין שברי התא מאפשר תחזוקה של מספרי תאי אפיתל מעיים, הימנעות היווצרות של פערים ודליפה, כמו^{גם הצטברות}של תאי אפיתל שעלולים להוביל להסימת תאים^{ותאי גידולים 8,9,}10 . למרות התפקיד המרכזי של שפיכת תאי אפיתל בחידוש הפיזיולוגי של אפיתל הבטן, הידע על המנגנונים המולקולריים המניעים את ההבלטה של תאים בקצה villus מוגבל. לכן, יש צורך במחקר בסיסי המספק תיאור מדויק של רצף האירועים המולקולריים המעורבים בהזלת תאים אפיתל.

אינטראקציות מורכבות בין סוגי תאים שונים בתוך ררית המעיים הם המפתח כדי להבין את המנגנונים המולקולריים ויסות תחלופת אפיתל והונוסטרזיס מעיים. כך, במחקרי vivo מציעים יתרונות גבוהים על פני גישות vio ex ו-ex בהקשר זה. יתר על כן, טכניקות הדמיה בזמן אמת מאפשרות את התיאור של רצף האירועים השולטים בתופעות ספציפיות. בהקשר זה, המחקר של תהליכים דינמיים מאוד דורש את השימוש בטכניקות ברזולוציה גבוהה אופטימיזציה להתבוננות ישירה של הרקמה. טכניקות הדמיה תוך-ויטאליות מופיעות ככלים מתאימים ייחודיים לחקר שפיכת תאי האפיתל בבטן.

המונח “מיקרוסקופ תוך ויטאל” מתייחס גישות ניסיוניות ניצול של טכניקות הדמיה ברזולוציה גבוהה (multiphoton או מיקרוסקופית confocal) כדי לדמיין ישירות תאים ורקמות בסביבה המקומית שלהם בתוך בעל חיים^{חי 11.} הוא מאפשר רכישה בזמן אמת של מידע vivo עד רזולוציה של תא יחיד, וכרוך יתרונות ברורים על פני שיטות סטטיות או ברזולוציה נמוכה. מיקרוסקופ תוך-ויטאל מספק מידע משלים ומתגבר על כמה מגבלות מטכניקות קלאסיות ו/או מתקדמות, כגון חפצים עקב עיבוד רקמות. לעומת זאת, המגבלה העיקרית של מיקרוסקופ תוך וינטלי היא כי הרקמה צריכה להיות חשופה ישירות למיקרוסקופ, אשר ברוב המקרים דורש ניתוח. למרות גישות מתוחכמות לשמר את החיוניות ולמזער את ההשפעה של הרקמה הדמיית (תאי skinfold וחלונות הדמיה)^12,,13, ברוב המקרים חתך עור פשוט מבוצע עבור החיצוניזציה של הרקמה (מגני העור)^14. בעשור האחרון, גישות אלה תרמו ראיות מפתח על תהליכים דינמיים מאוד, שהיו בעבר בלתי מובנים. תרגום, הדמיה בזמן אמת סיפקה תובנות ביולוגיות חדשות על תאי גזע וleukocytes^{ביות 15}, כמו גם^{סרטן הפצת גרורות היווצרות 13,16}. בהקשר הקליני, אנדומיקרוסקופיה מנוצלת כיום ככלי אבחון^{של סרטן 17} ומחלות במערכת העיכול, כגון IBD^18,19; בעוד מיקרוסקופים confocal הפך כלי פתולוגי מהיר במהלך ניתוח²⁰. יחד, מיקרוסקופ תוך ויטאל התגלה לאחרונה ככלי רב ערך ורב-תכליתי למחקר ביו-רפואי ויישום עתידי במרפאה.

מיקרוסקופ תוך ויטאל מיושם כאן להדמיה בזמן אמת של דליפת אפיתל מעיים והתבוננות של אירועי שפיכת תאים אפיתל. דליפה של חרנטיות מעיים ניתן לזהות על ידי אחרים בטכניקות vivo פולשניות, כגון כימות של ניהול דרך האלי של מעקבי פלורסנט בסרום²¹. עם זאת, טכניקה זו אינה מאפשרת תצפית ישירה של ביצועים שפיכה או את ההפרדה בין חירנות para-ו trans-תאי. השילוב של ניסויי מעקב סטנדרטיים ומיקרוסקופיה תוך-ויטאלית מייצג גישה מתאימה: i) לזהות הפרעות חחלל מעיים, ו- ii) לבודד בין חירנות אפיתל para-ו טרנס-תאי. מלבד שפיכת תאים, מיקרוסקופ תוך-וייטל בשילוב עם תיוג פלואורסצנטי vivo מאפשר מחקר של מנגנונים תאיים ומולקולריים אחרים (למשל, צומת הדוק הפצה מחדש במהלך שפיכת תאים^{באמצעות עכברים כתב פלורסנט 22} או אינטראקציות בין IECs ותאים אחרים בתוך רירית העיכול²³).

השיטה המוצגת כאן מייצגת התאמה של מיקרוסקופ תוך-ויטאלי כדי לאפשר תצפית בזמן אמת על רירית מעיים, באמצעות מיקרוסקופ סריקת לייזר קונקודלי (CLSM). לכן, אנו משתמשים בעכברים מותנה נוק-אאוט של GGTase (Geranylgeranyltransferase) בתאי אפיתל מעיים (IECs) ב (Pggt1b^i大IEC עכברים), מאז הם סובלים ממחלת מעיים חמורה וחדירות אפיתל^{מוגברת 24}. הכנה כירורגית של העכבר והכתמים של ררית המעיים, כמו גם הגדרות מתאימות המשמשות לרכישת הדמיה וניתוח לאחר הרכישה מתוארים. פרוטוקול זה יכול לאפשר מחקרים עתידיים התורמים לידע הנוכחי על דינמיקה וקינטיים של שפיכת תאי אפיתל מעיים. יתר על כן, הפרוטוקול יכול לשמש בסיס לתאמות שונות כדי ללמוד תופעות אחרות המתרחשות על פני השטח של ררית המעיים, ואפילו ברקמות אחרות.