Ein intravitaler, auf Mikroskopie basierender Ansatz zur Bewertung der Darmdurchlässigkeit und der Epithelzellvergießen-Performance

Der Darm ist ein hochspezialisiertes Organ mit einer streng regulierten Funktion, die widersprüchliche Prozesse ermöglicht, nämlich Ernährung und Schutz vor schädlichen Leuchtstoffen. Das Darmepithel wirkt als physikalische und immunologische Barriere und trägt zur Aufrechterhaltung der Schleimhautostase im Darm^1,2bei. Verlust der epitheliale Integrität und erhöhte enge Knotendurchlässigkeit ist bekannt, mit entzündlichen Darmerkrankungen (IBD) verbunden sein^3,4,5,6. Epithelveränderungen werden dann als Ursachen und Sekundärverstärker für chronische Darmentzündungen bei IBD betrachtet. Somit wäre ein verbessertes Verständnis der frühen epitheliale Veränderungen im Darm von IBD-Patienten von immensem Wert für die Entwicklung neuer Strategien zur Wiederherstellung der Epithelintegrität für eine zuverlässige Vorhersage und anschließende Prävention von IBD-Rückfällen.

Das Darmepithel folgt einem komplexen und streng regulierten Umsatzprozess. Vom Kryptaboden wandern endlos differenzierte Darmepithelzellen (IECs), die aus pluripotenten Stammzellen abgeleitet sind, nach oben zur Villusspitze, wo gealterte/geschädigte Zellen in das Lumen⁷vergossen werden. Das Gleichgewicht zwischen Teilung und Zellextrusion ermöglicht die Aufrechterhaltung von Darmepithelzellzahlen, wodurch die Bildung von Lücken und Leckagen vermieden wird, sowie die Ansammlung von Epithelzellen, die potenziell zu Zellmassen und Tumorgenese^8,9,10führen. Trotz der Schlüsselrolle des Epithelzellvergießens bei der physiologischen Erneuerung des Darmepithels ist das Wissen über die molekularen Mechanismen, die die Extrusion von Zellen an der Villusspitze vorantreiben, begrenzt. Daher ist eine Grundlagenforschung erforderlich, die eine genaue Beschreibung der Abfolge molekularer Ereignisse liefert, die an der Epithelzellvergießen beteiligt sind.

Komplexe Wechselwirkungen zwischen verschiedenen Zelltypen innerhalb der Darmschleimhaut sind der Schlüssel zum Verständnis der molekularen Mechanismen, die den Epithelumsatz und die Darmhomöostase regulieren. In-vivo-Studien bieten in diesem Zusammenhang hohe Vorteile gegenüber In-vitro- und Ex-vivo-Ansätzen. Darüber hinaus ermöglichen Echtzeit-Bildgebungstechniken die Beschreibung der Abfolge von Ereignissen, die bestimmte Phänomene steuern. In diesem Zusammenhang erfordert die Untersuchung hochdynamischer Prozesse den Einsatz optimierter hochauflösender Techniken zur direkten Beobachtung des Gewebes. Intravitale bildgebende Verfahren erscheinen als einzigartige geeignete Werkzeuge für die Untersuchung von Epithelzellvergießen im Darm.

Der Begriff “Intravitale Mikroskopie” bezieht sich auf experimentelle Ansätze, bei denen hochauflösende bildgebende Verfahren (Multiphotonen- oder Konfokalmikroskopie) genutzt werden, um Zellen und Gewebe in ihrer heimischen Umgebung innerhalb eines lebenden Tieres direkt zu visualisieren¹¹. Es ermöglicht die Echtzeiterfassung von In-vivo-Informationen bis hin zur Einzelzellauflösung und bringt klare Vorteile gegenüber statischen oder niedrig auflösenden Methoden mit sich. Die Intravital-Mikroskopie bietet ergänzende Informationen und überwindet einige Einschränkungen klassischer und/oder High-End-Techniken, wie z. B. Artefakte aufgrund der Gewebeverarbeitung. Im Gegensatz dazu besteht die Hauptbeschränkung der intravitalen Mikroskopie darin, dass das Gewebe direkt dem Mikroskop ausgesetzt werden sollte, was in den meisten Fällen einer Operation bedarf. Obwohl ausgeklügelte Ansätze die Vitalität bewahren und die Auswirkungen des abgebildeten Gewebes (Hautkammern und bildgebende Fenster)^12,13minimieren, wird in den meisten Fällen ein einfacher Hautschnitt für die Externalisierung des Gewebes (Hautklappen) durchgeführt¹⁴. In den letzten zehn Jahren haben diese Ansätze wichtige Beweise für hochdynamische Prozesse beigesteuert, die zuvor undurchschaubar waren. Übersetzt lieferte die Echtzeit-Bildgebung neue biologische Erkenntnisse über Stammzell und Leukozyten mit¹⁵, sowie Krebsverbreitung und Metastasenbildung^13,16. Im klinischen Kontext wird die Endomikroskopie derzeit als diagnostisches Instrument für Krebs¹⁷ und Magen-Darm-Erkrankungen wie IBD^18,19genutzt; während konfokale Mosaikmikroskopie wurde ein schnelles Pathologie-Werkzeug während der Operation²⁰. Gemeinsam hat sich die intravitale Mikroskopie in letzter Zeit zu einem wertvollen und vielseitigen Werkzeug für die biomedizinische Forschung und zukünftige Anwendung in der Klinik entwickelt.

Die Intravital-Mikroskopie ist hier für die Echtzeit-Visualisierung der Darmepithel-Leckage und die Beobachtung von Epithelzellabwurfereignissen implementiert. Die Leckage der Darmdurchlässigkeit kann durch andere in vivo nichtinvasive Techniken identifiziert werden, wie die Quantifizierung der oralen Verabreichung von fluoreszierenden Tracern im Serum²¹. Diese Technik erlaubt jedoch weder die direkte Beobachtung der Abwurfleistung noch die Segregation zwischen para- und transzellulärer Durchlässigkeit. Die Kombination von Standard-Tracer-Experimenten und intravitaler Mikroskopie stellt einen geeigneten Ansatz dar, um: i) Störungen der Darmdurchlässigkeit zu identifizieren und ii) zwischen para- und transzellulärer Epithelpermeabilität zu trennen. Neben dem Zellabwurf ermöglicht die intravitale Mikroskopie in Kombination mit der In-vivo-Fluoreszenzkennzeichnung die Untersuchung anderer zellulärer und molekularer Mechanismen (z. B. enge Umverteilung der Verbindung beim Zellabwurf mit fluoreszierenden Reportermäusen²² oder Wechselwirkungen zwischen IECs und anderen Zellen innerhalb der Darmschleimhaut²³).

Die hier vorgestellte Methode stellt eine Anpassung der intravitalen Mikroskopie dar, um die Echtzeitbeobachtung der Darmschleimhaut mittels konfokaler Laserscanmikroskopie (CLSM) zu ermöglichen. Daher verwenden wir bedingte Knock-out-Mäuse von GGTase (Geranylgeranyltransferase) in Darmepithelzellen (IECs) bei (Pggt1b^{i-IEC-Mäusen),} da sie an einer schweren Darmerkrankung und erhöhter epithelialen Permeabilität leiden²⁴. Die chirurgische Präparation der Maus und die Färbung der Darmschleimhaut sowie geeignete Einstellungen für die bildgebende Erfassung und Nacherfassungsanalyse werden beschrieben. Dieses Protokoll könnte zukünftige Studien ermöglichen, die zum aktuellen Wissen über Dynamik und Kinetik des Darmepithelzellabwurfs beitragen. Darüber hinaus könnte das Protokoll als Grundlage für verschiedene Anpassungen dienen, um andere Phänomene zu untersuchen, die an der Oberfläche der Darmschleimhaut und sogar an anderen Geweben auftreten.