Une approche à base de microscopie intravitale pour évaluer la perméabilité intestinale et la performance épithéliale de l’excrétion cellulaire

L’intestin est un organe hautement spécialisé avec une fonction étroitement réglementée permettant des processus contradictoires, à savoir la nutrition et la protection contre les substances luminaires nocives. Doublure entre le corps humain et l’environnement, l’épithélium intestinal agit comme une barrière physique et immunologique et contribue au maintien de l’homéostasie muqueuse dans^{l’intestin 1,2}. La perte de l’intégrité épithéliale et la perméabilité accrue de jonction serrée sont bien connues pour être associées à la maladie intestinale inflammatoire (IBD)^3,,4,,5,,6. Les altérations épithéliales sont alors considérées comme des causes et des amplificateurs secondaires pour l’inflammation intestinale chronique dans les MII. Ainsi, une meilleure compréhension des altérations épithéliales tôt dans l’intestin des patients d’IBD serait d’une valeur immense pour le développement de nouvelles stratégies pour reconstituer l’intégrité épithéliale pour la prévision fiable et la prévention suivante des rechutes d’IBD.

L’épithélium intestinal suit un processus complexe et étroitement régulé de rotation. À partir du fond de la crypte, les cellules épithéliales intestinales différenciées en phase terminale (IECs) dérivées de cellules souches pluripotentes migrent vers le haut jusqu’à la pointe villus, où les cellules âgées/endommagées sont jetées dans le lumen⁷. L’équilibre entre la division et l’extrusion cellulaire permet le maintien des nombres de cellules épithéliales intestinales, en évitant la formation de lacunes et de fuites, ainsi que l’accumulation de cellules épithéliales conduisant potentiellement à des masses cellulaires et tumorigenesis^8,9,10. En dépit du rôle clé de l’excrétion épithéliale de cellules dans le renouvellement physiologique de l’épithélium d’intestin, les connaissances au sujet des mécanismes moléculaires conduisant l’extrusion des cellules à la pointe villus sont limitées. Ainsi, il est nécessaire que la recherche fondamentale fournisse une description précise de la séquence des événements moléculaires impliqués dans l’excrétion épithéliale des cellules.

Les interactions complexes entre les différents types de cellules au sein de la muqueuse intestinale sont essentielles pour comprendre les mécanismes moléculaires régulant le renouvellement épithélial et l’homéostasie intestinale. Ainsi, les études in vivo offrent des avantages élevés par rapport aux approches in vitro et ex vivo dans ce contexte. De plus, les techniques d’imagerie en temps réel permettent de décrire la séquence des événements contrôlant des phénomènes spécifiques. Dans ce contexte, l’étude de processus hautement dynamiques exige l’utilisation de techniques optimisées à haute résolution pour l’observation directe du tissu. Les techniques d’imagerie intravitale apparaissent comme des outils appropriés uniques pour l’étude de l’excrétion épithéliale des cellules dans l’intestin.

Le terme « microscopie intravitale » désigne les approches expérimentales utilisant des techniques d’imagerie à haute résolution (microscopie multiphoton ou confocale) pour visualiser directement les cellules et les tissus dans leurs environs indigènes au sein d’un animal vivant¹¹. Il permet l’acquisition en temps réel d’informations in vivo jusqu’à la résolution d’une seule cellule, et comporte des avantages évidents par rapport aux méthodes statiques ou à basse résolution. La microscopie intravitale fournit des informations complémentaires et surmonte certaines limitations des techniques classiques et/ou haut de gamme, telles que les artefacts dus au traitement des tissus. En revanche, la principale limitation de la microscopie intravitale est que le tissu doit être directement exposé au microscope, qui dans la plupart des cas nécessite une intervention chirurgicale. Bien que des approches sophistiquées préservent la vitalité et minimisent l’impact du tissu imageur (chambres skinfold et fenêtres d’imagerie)^12,13, dans la plupart des cas une incision simple de peau est effectuée pour l’extérialisation du tissu (volets de peau)^14. Au cours de la dernière décennie, ces approches ont fourni des preuves clés de processus hautement dynamiques, qui étaient auparavant insondables. Translationnellement, l’imagerie en temps réel a fourni de nouvelles perspectives biologiques sur les cellules souches et les leucocytes homing¹⁵, ainsi que la diffusion du cancer et la formation de métastases^13,16. Dans le contexte clinique, l’endomicoscopie est actuellement exploitée comme outil diagnostique du cancer¹⁷ et des maladies gastro-intestinales, comme les^{MII 18,19}; tandis que la microscopie confoccale de mosaïque est devenue un outil rapide de pathologie pendant la^{chirurgie 20.} Ensemble, la microscopie intravitale est récemment apparue comme un outil précieux et polyvalent pour la recherche biomédicale et l’application future dans la clinique.

La microscopie intravitale est ici mise en œuvre pour la visualisation en temps réel des fuites épithéliales intestinales et l’observation des événements épithéliales d’excrétion cellulaire. La fuite de perméabilité intestinale peut être identifiée par d’autres techniques non invasives in vivo, telles que la quantification de l’administration orale des traceurs fluorescents dans le sérum^21. Toutefois, cette technique ne permet pas l’observation directe de la performance de l’excrétion ni la ségrégation entre la perméabilité para et transcellulaire. La combinaison d’expériences de traceurs standard et de microscopie intravitale représente une approche appropriée pour : i) identifier les perturbations de la perméabilité intestinale, et ii) séparer entre la perméabilité épithéliale para et transcellulaire. Outre l’excrétion cellulaire, la microscopie intravitale en combinaison avec l’étiquetage de fluorescence in vivo permet l’étude d’autres mécanismes cellulaires et moléculaires (p. ex., redistribution des jonctions serrées pendant l’excrétion cellulaire à l’aide de souris fluorescentes^{reporter 22} ou interactions entre les CCI et d’autres cellules dans la muqueuse intestinale^23).

La méthode présentée ici représente une adaptation de la microscopie intravitale pour permettre l’observation en temps réel de la muqueuse intestinale, à l’aide de microscopie à balayage laser confocal (CLSM). Par conséquent, nous utilisons des souris conditionnelles knock-out de GGTase (Géranylgeranyltransferase) dans les cellules épithéliales intestinales (IECs) dans (Pggt1b^{souris iΔIEC),} car ils souffrent d’une maladie intestinale grave et une perméabilité épithéliale^{accrue 24}. La préparation chirurgicale de la souris et la coloration de la muqueuse intestinale, ainsi que les paramètres appropriés utilisés pour l’acquisition d’imagerie et l’analyse post-acquisition sont décrits. Ce protocole pourrait permettre de futures études contribuant aux connaissances actuelles sur la dynamique et la cinétique de l’excrétion intestinale des cellules épithéliales. En outre, le protocole pourrait servir de base à diverses adaptations pour étudier d’autres phénomènes se produisant à la surface de la muqueuse intestinale, et même à d’autres tissus.