Een intravitale microscopie-gebaseerde benadering om darmdoorlatendheid en epitheelcelvergieten prestaties te beoordelen

De darm is een zeer gespecialiseerd orgaan met een strak gereguleerde functie die conflicterende processen mogelijk maakt, namelijk voeding en bescherming tegen schadelijke luminale stoffen. Voering tussen het menselijk lichaam en het milieu, het darmeptheel fungeert als een fysieke en immunologische barrière en draagt bij aan het behoud van mucosale homeostase in de darm^1,2. Verlies van epitheliale integriteit en verhoogde nauwe verbindingdoorlaatbaarheid is bekend te worden geassocieerd met inflammatoire darmziekte (IBD)^3,4,5,6. Epitheelveranderingen worden vervolgens beschouwd als oorzaken en secundaire versterkers voor chronische darmontsteking in IBD. Zo zou een beter begrip van vroege epitheliale veranderingen in de darm van IBD-patiënten van onschatbare waarde zijn voor de ontwikkeling van nieuwe strategieën om epitheelintegriteit te herstellen voor betrouwbare voorspelling en latere preventie van IBD-terugval.

Darmeptheel volgt een complex en strak gereguleerd omzetproces. Vanaf de cryptebodem migreren terminaal gedifferentieerde darmeptropepitheelcellen (IECs) afkomstig van pluripotente stamcellen naar boven naar de villuspunt, waar verouderde/beschadigde cellen in het lumen⁷worden vergoten. Het evenwicht tussen deling en celextrusie maakt het behoud van darmeppitheelcelnummers mogelijk, waardoor de vorming van hiaten en lekkage wordt vermeden, evenals de accumulatie van epitheliale cellen die mogelijk leiden tot celmassa’s en tumorigenese^8,9,10. Ondanks de sleutelrol van epitheelcelvergieten in de fysiologische vernieuwing van het darmeptheel, is de kennis over de moleculaire mechanismen die de extrusie van cellen op de villus-tip stimuleren beperkt. Zo is er behoefte aan fundamenteel onderzoek dat een nauwkeurige beschrijving geeft van de volgorde van moleculaire gebeurtenissen die betrokken zijn bij epitheliale celvergieten.

Complexe interacties tussen verschillende celtypen binnen het darmslijmvlies zijn essentieel om de moleculaire mechanismen te begrijpen die epitheliale omzet en darmhomeostase reguleren. In vivo studies bieden in deze context dus hoge voordelen ten opzichte van in vitro- en ex vivo-benaderingen. Bovendien maken real-time beeldvormingstechnieken de beschrijving mogelijk van de volgorde van gebeurtenissen die specifieke verschijnselen beheersen. In deze context vereist de studie van zeer dynamische processen het gebruik van geoptimaliseerde hogeresolutietechnieken voor de directe observatie van het weefsel. Intravital imaging technieken verschijnen als unieke geschikte instrumenten voor de studie van epitheelcel vergieten in de darm.

De term “intravitale microscopie” verwijst naar experimentele benaderingen die gebruik maken van beeldvormingstechnieken met hoge resolutie (multifoton of confocale microscopie) om cellen en weefsels in hun eigen omgeving direct te visualiseren binnen een levend dier¹¹. Het maakt real-time verwerving van in vivo informatie tot single-cell resolutie, en brengt duidelijke voordelen ten opzichte van statische of lage resolutie methoden. Intravital microscopie biedt aanvullende informatie en overwin enkele beperkingen van klassieke en/of high-end technieken, zoals artefacten als gevolg van weefselverwerking. De belangrijkste beperking van intravitale microscopie daarentegen is dat het weefsel direct aan de microscoop moet worden blootgesteld, wat in de meeste gevallen een operatie vereist. Hoewel geavanceerde benaderingen de vitaliteit behouden en de impact van het afgebeelde weefsel minimaliseren (huidplooikamers en beeldvensters)^12,13, wordt in de meeste gevallen een eenvoudige huidincisie uitgevoerd voor de externalisatie van het weefsel (huidflappen)¹⁴. In de afgelopen tien jaar hebben deze benaderingen belangrijke bewijzen geleverd over zeer dynamische processen, die voorheen ondoorgrondelijk waren. Translationally, real-time imaging leverde nieuwe biologische inzichten op over stamcel en leukocyten homing¹⁵, evenals kanker verspreiding en metastase vorming^13,16. In de klinische context wordt endomicroscopie momenteel gebruikt als diagnostisch instrument voor kanker¹⁷ en maag- en darmziekten, zoals IBD^18,19; terwijl confocale mozaïeken microscopie een snelle pathologie tool werd tijdens de operatie²⁰. Intravital microscopie is de laatste tijd samen uitgegroeid tot een waardevol en veelzijdig hulpmiddel voor biomedisch onderzoek en toekomstige toepassing in de kliniek.

Intravital microscopie wordt hier geïmplementeerd voor real-time visualisatie van darmeppitheellekkage en observatie van epitheliale celvergietende gebeurtenissen. Lekkage van darmpermeabiliteit kan worden geïdentificeerd door andere in vivo niet-invasieve technieken, zoals kwantificering van orale toediening van fluorescerende tracers in serum²¹. Deze techniek staat echter niet toe dat de prestaties direct worden waargenomen, noch de segregatie tussen para- en transcellulaire doorlaatbaarheid. De combinatie van standaard tracerexperimenten en intravitale microscopie is een geschikte benadering van: i) het identificeren van verstoringen in darmdoorlatendheid, en ii) scheiden tussen para- en transcellulaire epitheelpermeabiliteit. Naast celvergieten maakt intravitale microscopie in combinatie met in vivo fluorescentie-etikettering de studie van andere cellulaire en moleculaire mechanismen mogelijk (bijvoorbeeld een strikte verbindingsherverdeling tijdens celvergieten met tl-reportermuizen²² of interacties tussen IDC’s en andere cellen binnen het darmslijmvlies²³).

De hier gepresenteerde methode vertegenwoordigt een aanpassing van intravitale microscopie om real-time observatie van darmslijmvlies mogelijk te maken, met behulp van confocale laser scanning microscopie (CLSM). Daarom gebruiken we voorwaardelijke knock-out muizen van GGTase (Geranylgeranyltransferase) in darmeppitheelcellen (IECs) in (Pggt1b^iΔIEC muizen), omdat ze lijden aan een ernstige darmziekte en verhoogde epitheliale permeabiliteit²⁴. Chirurgische voorbereiding van de muis en kleuring van het darmslijmvlies, evenals de juiste instellingen die worden gebruikt voor het verwerven van beeldvorming en analyse na de overname worden beschreven. Dit protocol zou toekomstige studies mogelijk kunnen maken die bijdragen aan de huidige kennis over dynamiek en kinetiek van darmepitheelcelvergieten. Bovendien zou het protocol kunnen dienen als basis voor verschillende aanpassingen om andere verschijnselen te bestuderen die zich voordoen aan het oppervlak van het darmslijmvlies, en zelfs bij andere weefsels.