نهج المجهر الداخلي القائم على تقييم نفاذية المعوية وخلية الظهارية ذرف الأداء
Summary
الاستفادة من المجهر داخل مدينة، طريقة المقدمة هنا تمكن التصور في الوقت الحقيقي من الظهارية الأمعاء سفك الخلايا في الحيوانات الحية. لذلك ، يتم تصوير الغشاء المخاطي المعوي الملون موضعيًا (acriflavine و rhodamineB-dextran) من الفئران المُضنِع إلى دقة خلية واحدة باستخدام المجهر confocal.
Abstract
يسمح المجهر الداخلي للأمعاء باستخدام التصوير confocal الملاحظة في الوقت الحقيقي من سفك الخلايا الظهارية وتسرب الحاجز في الحيوانات الحية. ولذلك ، فإن الغشاء المخاطي المعوي للفئران المُجَنَّبة مُلطّخة موضعيًا بصبغ غير محدد (acriflavine) وتتبع فلوري (رودامين – ب ديكستران) ، مثبتًا على لوحة مشطفة بالمحلول الملحي ومصوّرة مباشرة باستخدام مجهر confocal. يمكن لهذه التقنية أن تكمل تقنيات أخرى غير الغازية لتحديد تسرب نفاذية الأمعاء، مثل مرور transmucosal من المقتفيات تدار شفويا. بالإضافة إلى هذا، النهج المعروض هنا يسمح بالمراقبة المباشرة للأحداث تسليط الخلية في الوقت الحقيقي. في تركيبة مع الفئران مراسل الفلورسنت المناسبة، وهذا النهج هو مناسبة لتسليط الضوء على الآليات الخلوية والجزيئية التي تتحكم في قذف الخلايا الظهارية المعوية، وكذلك لعمليات بيولوجية أخرى. في العقود الماضية، ساهمت دراسات مثيرة للاهتمام باستخدام المجهر داخل الرحم في المعرفة حول نفاذية الأمعاء البطانية، واتصال الأمعاء في الخلايا المناعية، والتواصل بين المناعة والظهارية، وغزو المكونات اللماحية، من بين أمور أخرى. معا، فإن البروتوكول المقدم هنا ليس فقط تساعد على زيادة فهم آليات التحكم في قذف الخلايا الظهارية، ولكن يمكن أيضا أن يكون أساسا للتنمية من النهج الأخرى لاستخدامها كأدوات لتصور عملية أخرى الخلوية ديناميكية للغاية، حتى في الأنسجة الأخرى. ومن بين القيود التقنية، فإن الخصائص البصرية للأنسجة المحددة، فضلا عن تكنولوجيا التصوير المختارة وتكوين المجهر، من شأنها أن تحدد بدورها مسافة عمل التصوير، ودقة الصور المكتسبة.
Introduction
الأمعاء هي جهاز متخصص للغاية مع وظيفة منظمة بإحكام تمكين العمليات المتضاربة، وهي التغذية والحماية من المواد الإنارة الضارة. بطانة بين الجسم البشري والبيئة، وظهارة المعوية بمثابة حاجز المادية والمناعية ويساهم في الحفاظ على التوازن المخاطي في القناة الهضمية1،2. ومن المعروف جيدا فقدان النزاهة الظهارية وزيادة نفاذية تقاطع ضيق أن تكون مرتبطة مع مرض التهاب الأمعاء (IBD)3,4,5,6. ثم تعتبر التعديلات الظهارية كمسببات ومكبرات الصوت الثانوية لالتهاب الأمعاء المزمن في IBD. وهكذا، فإن تحسين فهم التعديلات الظهارية المبكرة في القناة الهضمية لمرضى IBD ستكون ذات قيمة هائلة لتطوير استراتيجيات جديدة لاستعادة السلامة الظهارية للتنبؤ الموثوق بها والوقاية اللاحقة من الانتكاسات IBD.
يتبع ظهارة الأمعاء عملية دوران معقدة ومنظمة بإحكام. من أسفل سرداب، الخلايا الظهارية المعوية المتمايزة بشكل نهائي (IECs) المستمدة من الخلايا الجذعية متعددة القدرات تهاجر صعودا إلى طرف villus، حيث يتم إلقاء الخلايا القديمة / التالفة في تجويف7. يمكن التوازن بين الانقسام وبثق الخلية الحفاظ على أرقام الخلايا الظهارية المعوية ، وتجنب تشكيل الثغرات والتسرب ، وكذلك تراكم الخلايا الظهارية التي يحتمل أن تؤدي إلى كتل الخلايا و ورمريجنيس8،9،10. على الرغم من الدور الرئيسي للخلية الظهارية ذرف في التجديد الفسيولوجي للظهارة القناة الهضمية، والمعرفة حول الآليات الجزيئية التي تقود قذف الخلايا في طرف villus محدودة. وهكذا، هناك حاجة للبحوث الأساسية التي توفر وصفا دقيقا لسلسلة من الأحداث الجزيئية التي تنطوي عليها الخلايا الظهارية ذرف.
التفاعلات المعقدة بين أنواع الخلايا المختلفة داخل الغشاء المخاطي المعوي هي المفتاح لفهم الآليات الجزيئية التي تنظم دوران الظهارية والأمعاء. وهكذا، في الدراسات الحية تقدم مزايا عالية على الأساليب في المختبر و السابقين في هذا السياق. وعلاوة على ذلك، تسمح تقنيات التصوير في الوقت الحقيقي بوصف تسلسل الأحداث التي تتحكم في ظواهر معينة. وفي هذا السياق، تتطلب دراسة العمليات ذات الحيوية العالية استخدام تقنيات عالية الدقة الأمثل للمراقبة المباشرة للأنسجة. تقنيات التصوير داخل الأتصال تظهر كأدوات فريدة مناسبة لدراسة الخلايا الظهارية التي تسيل في الأمعاء.
يشير مصطلح المجهر داخلة في المنشآت إلى الأساليب التجريبية التي تستفيد من تقنيات التصوير عالية الدقة (المجهر متعدد الصور أو المجهر) لتصور الخلايا والأنسجة مباشرة في محيطها الأصلي داخل حي11. فإنه يتيح الحصول في الوقت الحقيقي من المعلومات في الجسم الحي تصل إلى قرار خلية واحدة، وينطوي على مزايا واضحة على أساليب ثابتة أو منخفضة القرار. يوفر المجهر داخل الواجهة معلومات تكميلية ويتغلب على بعض القيود من التقنيات الكلاسيكية و/أو الراقية، مثل القطع الأثرية الناتجة عن معالجة الأنسجة. في المقابل ، فإن القيد الرئيسي للمجهر داخل الرحم هو أن الأنسجة يجب أن تتعرض مباشرة للمجهر ، والتي تتطلب في معظم الحالات الجراحة. على الرغم من أن النهج المتطورة الحفاظ على حيوية وتقليل تأثير الأنسجة المصورة (غرف الجلد والنوافذ التصوير)12،13، في معظم الحالات يتم تنفيذ شق بسيط الجلد لال خارجية من الأنسجة (الجلد اللوحات)14. وفي العقد الماضي، أسهمت هذه النهج بأدلة رئيسية عن عمليات شديدة الدينامية كانت في السابق غير قابلة للإثبات. ترجمة, التصوير في الوقت الحقيقي قدمت رؤى بيولوجية جديدة على الخلايا الجذعية و الكريات البيض توجيه15, فضلا عن نشر السرطان وتشكيل الانبثاث13,16. في السياق السريري, يتم حاليا استغلال التنظير الداخلي كأداة تشخيصية للسرطان17 وأمراض الجهاز الهضمي, مثل IBD18,19; في حين أصبح الفسيفساء المجهرية confocal أداة علم الأمراض السريعة أثناء الجراحة20. معًا، ظهر الفحص المجهري داخل الرحم مؤخرًا كأداة قيمة ومتعددة الاستخدامات للبحث الطبي الحيوي والتطبيق المستقبلي في العيادة.
يتم هنا تنفيذ المجهر داخل الرحم للتصور في الوقت الحقيقي من تسرب الظهارية المعوية ومراقبة الخلايا الظهارية ذرف الأحداث. يمكن التعرف على تسرب نفاذية الأمعاء من قبل تقنيات أخرى في الجسم الحي غير الباضع، مثل القياس الكمي للإدارة شفويا من التتبع الفلورسنت في المصل21. ومع ذلك، فإن هذه التقنية لا تسمح بالمراقبة المباشرة لأداء السفك ولا الفصل بين نفاذية شبه الخلوية. يمثل الجمع بين تجارب التتبع القياسية والمجهرية داخل الرحم منهجًا مناسبًا لما يلي: 1) تحديد الاضطرابات في نفاذية الأمعاء، و ii) الفصل بين نفاذية الظهارية شبه الخلوية. بالإضافة إلى سفك الخلايا، المجهر داخل الرحم في تركيبة مع في وضع العلامات الفلورية في الجسم الحي تمكن دراسة الآليات الخلوية والجزيئية الأخرى (على سبيل المثال، ضيق تقاطع إعادة توزيع أثناء سفك الخلية باستخدام الفئران مراسل الفلورسنت22 أو التفاعلات بين IECs والخلايا الأخرى داخل الغشاء المخاطي المعوي23).
الطريقة المعروضة هنا تمثل تكييف المجهر داخلة لتمكن من المراقبة في الوقت الحقيقي من الغشاء المخاطي المعوي، وذلك باستخدام المجهر الليزر confocal (CLSM). ولذلك، فإننا نستخدم الفئران خروج المغلوب المشروط من GGTase (Geranylgeranyltransferase) في الخلايا الظهارية المعوية (IECs) في (Pggt1biΔIEC الفئران)، لأنها تعاني من مرض الأمعاء الحاد وزيادة نفاذيةالظهارية 24. يتم وصف الإعداد الجراحي للفأر وتلطيخ الغشاء المخاطي المعوي ، وكذلك الإعدادات المناسبة المستخدمة في الحصول على الصور وتحليل ما بعد الاستحواذ. يمكن أن يمكّن هذا البروتوكول الدراسات المستقبلية التي تساهم في المعرفة الحالية حول ديناميات وحركيات الخلايا الظهارية المعوية التي تسفك. وعلاوة على ذلك، يمكن أن يكون البروتوكول بمثابة أساس للتكيفات المختلفة لدراسة الظواهر الأخرى التي تحدث على سطح الغشاء المخاطي في الأمعاء، وحتى في الأنسجة الأخرى.
Protocol
Representative Results
Discussion
على الرغم من أن تحديا من الناحية الفنية، منهجية تستند إلى المجهر intravital يمثل نهجا تجريبيا فريدة من نوعها لتصور دينامية عالية عملية الخلوية في الوقت الحقيقي، مثل سفك الخلية الأداء. حتى الآن، لا يوجد نهج تجريبي بديل لتصور البثق الخلية في الجسم الحي. ونحن نعتقد أن هذا البروتوكول يمكن أن تسهم ف…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد تلقى البحث الذي أدى إلى هذه النتائج تمويلاً من برنامج الأشخاص (Marie Curie Actions) بموجب اتفاقية منحة REA رقم 302170 من البرنامج الإطاري السابع للاتحاد الأوروبي (FP7/2007-2013)؛ مركز البحوث السريرية المتعدد التخصصات (IZKF) التابع لجامعة إرلانغن – نورمبرغ؛ مركز البحوث التعاونية TRR241 ومجموعة البحوث السريرية KFO257 من مجلس البحوث الألماني (DFG)؛ وDFG.
Materials
| Acriflavine hydrochloride | Sigma Aldrich | A8251 | 1 mg/mL solution in PBS |
| Deltaphase isothermal pad | BrainTree | B-DP-PAD | – |
| Gemini Cautery System | BrainTree | B-GEM-5917 | – |
| Ketamin | WDT | 9089.01.00 | |
| LAS X | Leica | – | – |
| LSM microscope SP8 | Leica | – | – |
| PBS | Biochrom | L182 | |
| Rhodamine B dextran | Invitrogen | D1824 | 10,000 kDa MW; 2 mg/mL solution |
| Standard forceps (Dumont SS) | Fine Science Tools | 11203-23 | – |
| Straight fine scissors | Fine Science Tools | 14060-10 | – |
| Tamoxifen | Sigma Aldrich | T5648 | 50 mg/mL in ethanol |
| Xylazin | Bayer | 1320422 |
References
- Buhner, S., et al. Genetic basis for increased intestinal permeability in families with Crohn’s disease: role of CARD15 3020insC mutation?. Gut. 55 (3), 342-347 (2006).
- Pastorelli, L., De Salvo, C., Mercado, J. R., Vecchi, M., Pizarro, T. T. Central Role of the Gut Epithelial Barrier in the Pathogenesis of Chronic Intestinal Inflammation: Lessons Learned from Animal Models and Human Genetics. Frontiers in Immunology. 4, 280 (2013).
- Kiesslich, R., et al. Local barrier dysfunction identified by confocal laser endomicroscopy predicts relapse in inflammatory bowel disease. Gut. 61 (8), 1146-1153 (2012).
- Dourmashkin, R. R., et al. Epithelial patchy necrosis in Crohn’s disease. Human Pathology. 14 (7), 643-648 (1983).
- Soderholm, J. D., et al. Augmented increase in tight junction permeability by luminal stimuli in the non-inflamed ileum of Crohn’s disease. Gut. 50 (3), 307-313 (2002).
- Wittkopf, N., Neurath, M. F., Becker, C. Immune-epithelial crosstalk at the intestinal surface. American Journal of Gastroenterology. 49 (3), 375-387 (2014).
- van der Flier, L. G., Clevers, H. Stem cells, self-renewal, and differentiation in the intestinal epithelium. Annual Review of Physiology. 71, 241-260 (2009).
- Fan, Y., Bergmann, A. Apoptosis-induced compensatory proliferation. The Cell is dead. Long live the Cell!. Trends in Cell Biology. 18 (10), 467-473 (2008).
- Ryoo, H. D., Gorenc, T., Steller, H. Apoptotic cells can induce compensatory cell proliferation through the JNK and the Wingless signaling pathways. Developmental Cell. 7 (4), 491-501 (2004).
- Rosenblatt, J., Raff, M. C., Cramer, L. P. An epithelial cell destined for apoptosis signals its neighbors to extrude it by an actin- and myosin-dependent mechanism. Current Biology. 11 (23), 1847-1857 (2001).
- Coste, A., Oktay, M. H., Condeelis, J. S., Entenberg, D. Intravital Imaging Techniques for Biomedical and Clinical Research. Cytometry A. , (2019).
- Sorg, H., Krueger, C., Vollmar, B. Intravital insights in skin wound healing using the mouse dorsal skin fold chamber. Journal of Anatomy. 211 (6), 810-818 (2007).
- Ritsma, L., et al. Intravital microscopy through an abdominal imaging window reveals a pre-micrometastasis stage during liver metastasis. Science Translational Medicine. 4 (158), 158ra145 (2012).
- Nakasone, E. S., et al. Imaging tumor-stroma interactions during chemotherapy reveals contributions of the microenvironment to resistance. Cancer Cell. 21 (4), 488-503 (2012).
- Sipkins, D. A., et al. In vivo imaging of specialized bone marrow endothelial microdomains for tumour engraftment. Nature. 435 (7044), 969-973 (2005).
- Kienast, Y., et al. Real-time imaging reveals the single steps of brain metastasis formation. Nature Medicine. 16 (1), 116-122 (2010).
- Nguyen, V. X., Nguyen, C. C., De Petris, G., Sharma, V. K., Das, A. Confocal endomicroscopy (CEM) improves efficiency of Barrett surveillance. Journal of Interventional Gastroenterology. 2 (2), 61-65 (2012).
- Kiesslich, R., Goetz, M., Neurath, M. F. Confocal laser endomicroscopy for gastrointestinal diseases. Gastrointestinal Endoscopy Clinics of North America. 18 (3), 451-466 (2008).
- Kiesslich, R., et al. Chromoscopy-guided endomicroscopy increases the diagnostic yield of intraepithelial neoplasia in ulcerative colitis. Gastroenterology. 132 (3), 874-882 (2007).
- Krishnamurthy, S., et al. Confocal Fluorescence Microscopy Platform Suitable for Rapid Evaluation of Small Fragments of Tissue in Surgical Pathology Practice. Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 143 (3), 305-313 (2019).
- Li, B. R., et al. In vitro and In vivo Approaches to Determine Intestinal Epithelial Cell Permeability. Journal of Visualized Experiments. (140), (2018).
- Marchiando, A. M., et al. The epithelial barrier is maintained by in vivo tight junction expansion during pathologic intestinal epithelial shedding. Gastroenterology. 140 (4), 1208-1218 (2011).
- Hoytema van Konijnenburg, D. P., et al. Intestinal Epithelial and Intraepithelial T Cell Crosstalk Mediates a Dynamic Response to Infection. Cell. 171 (4), 783-794 (2017).
- Lopez-Posadas, R., et al. Rho-A prenylation and signaling link epithelial homeostasis to intestinal inflammation. Journal of Clinical Investigation. 126 (2), 611-626 (2016).
- Duckworth, C. A., Watson, A. J. Analysis of epithelial cell shedding and gaps in the intestinal epithelium. Methods in Molecular Biology. 763, 105-114 (2011).
- Watson, A. J., et al. Epithelial barrier function in vivo is sustained despite gaps in epithelial layers. Gastroenterology. 129 (3), 902-912 (2005).
- Haep, L., et al. Interferon Gamma Counteracts the Angiogenic Switch and Induces Vascular Permeability in Dextran Sulfate Sodium Colitis in Mice. Inflammatory Bowel Diseases. 21 (10), 2360-2371 (2015).
- Lopez-Posadas, R., et al. Inhibiting PGGT1B Disrupts Function of RHOA, Resulting in T-cell Expression of Integrin alpha4beta7 and Development of Colitis in Mice. Gastroenterology. , (2019).
- Fischer, A., et al. Differential effects of alpha4beta7 and GPR15 on homing of effector and regulatory T cells from patients with UC to the inflamed gut in vivo. Gut. 65 (10), 1642-1664 (2016).
