Targeting dell'intestino tenue del ratto: infusione a lungo termine nell'arteria mesenterica superiore
Summary
L’accesso per infusione a lungo termine nell’arteria mesenterica superiore (SMA) dei ratti è una procedura chirurgica che consiste nella cannulazione di un ramo prossimale della SMA. La cannula esce dalla ferita addominale e viene tunnelizzata attraverso lo spazio sottocutaneo fino alla piega interscapolare.
Abstract
L’arteria mesenterica superiore può essere cannulata nell’uomo attraverso il cateterismo radiologico minimamente invasivo dell’arteria femorale o ascellare. La cannulazione della SMA è più difficile nei ratti a causa delle piccole dimensioni anatomiche. Lo scopo dello studio è quello di descrivere una tecnica chirurgica per la cannulazione della SMA nei ratti per eseguire l’infusione a lungo termine di farmaci nel letto vascolare SMA in animali senza restrizioni, che si tradurrà in un alto tasso di pervietà del catetere dopo il recupero post-chirurgico per 24 ore.
Per evitare il rischio di trombosi SMA o sanguinamento da accesso diretto, un ramo prossimale della SMA viene isolato, legato distalmente e cannulato con un tubo capillare in poliuretano da 0,25 mm la cui punta è avanzata vicino all’origine della SMA dall’aorta. La cannula viene quindi tunnelizzata per via sottocutanea verso la parte posteriore del collo dell’animale e attraverso la pelle attraverso una valvola artificiale. La porzione esterna della cannula viene inserita in un sistema di supporto semirigido e collegata alla pompa di infusione continua all’esterno della gabbia dove il ratto è libero di muoversi.
Il corretto posizionamento della cannula è stato dimostrato dall’angiografia post-chirurgica e dai risultati dell’autopsia. La pervietà del catetere dopo 24 ore di infusione salina nella regione SMA è stata assicurata nella maggior parte dei ratti dallo scarico totale della pompa e dal riconoscimento di una cannula funzionale per il prelievo di sangue o l’infusione salina.
Introduction
L’arteria mesenterica superiore (SMA) nell’uomo come nei ratti proviene dall’aorta addominale e fornisce all’intestino sangue arterioso dal duodeno al colon trasversale prossimale. SMA dà origine a numerosi rami.
Dopo la perfusione capillare, la circolazione mesenterica viene drenata attraverso la vena porta al fegato, dove subisce il metabolismo epatico prima di essere riammessa alla circolazione sistemica. La cannulazione della SMA è utile a fini diagnostici, embolizzazione terapeutica e infusione di farmaci in modo selettivo o continuo per valutare l’effetto sull’intestino o, soprattutto, sul metabolismo epatico e sulla clearance chimica. Nell’uomo, il cateterismo radiologico minimamente invasivo della SMA viene eseguito per il trattamento endovascolare1 o l’infusione selettiva di farmaci2 utilizzando diversi approcci percutanei come la puntura transfemorale o transascellare e la cannulazione.
Esistono segnalazioni in letteratura di diverse tecniche di cannulazione dei piccoli vasi addominali: la vena mesenterica superiore (SMV)3, l’arteria mesenterica inferiore (IMA)4, il dotto linfatico mesenterico5, l’arteria epatica6 o studi per ex vivo sulla perfusione intestinale7 nei ratti. Rispetto al lato venoso, la cannulazione della SMA nei ratti è molto più impegnativa a causa dei rischi simultanei di trombosi e sanguinamento, a condizione che la sua alta pressione. In particolare, i problemi sorgono nel caso in cui la cannulazione sia in funzione quando il ratto si sveglia dall’anestesia sul letto chirurgico e di più se l’esperimento richiede un animale libero in una gabbia dopo l’intervento chirurgico.
Un recente articolo ha descritto la cannulazione della SMA come parte dell’esperimento (misura della pressione sanguigna) in un animale in anestesia8. Tuttavia, non viene descritta alcuna tecnica sulla cannulazione chirurgica della SMA per infusione a lungo termine in un animale senza restrizioni. Lo scopo di questo manoscritto è quello di descrivere passo dopo passo una tecnica chirurgica per la cannulazione a lungo termine della SMA attraverso un ramo prossimale, che consente l’infusione selettiva di farmaci nel letto mesenterico per almeno 24 ore (e oltre). Poiché una cannulazione costante e robusta richiede la legatura permanente e la chiusura del vaso in cui è inserito il catetere, questa tecnica evita invece di inserire il catetere direttamente nella SMA9 e si avvicina al vaso attraverso la cannulazione di un ramo prossimale, il più prossimale possibile all’origine stessa della SMA dall’aorta. L’infusione prossimale consente al farmaco infuso di raggiungere il letto anatomico più ampio possibile, senza chiudere il flusso sanguigno attraverso il vaso principale.
La tecnica di cannulazione SMA del ratto ha molte applicazioni. Sarebbe possibile somministrare farmaci in modo selettivo nel compartimento arterioso mesenterico per ottenere un’azione locale a livello gastrointestinale ed evitare effetti sistemici e metabolismo epatico dei farmaci. Il modello di ratto cannulato SMA presenta vantaggi rispetto ai modelli animali più grandi: è meno costoso, è eticamente accettabile ed è più facile da eseguire e imparare. La chirurgia di cannulazione SMA è anche più facile da eseguire nel modello di ratto rispetto al modello murino.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il vantaggio principale di questo modello di infusione SMA su ratto è la sua fermezza e durata per almeno 24 ore nella stragrande maggioranza degli animali. L’infusione di anticoagulante potrebbe allungare questo intervallo di tempo. Il modello consente un’infusione affidabile di farmaci selettivamente nella regione mesenterica, mirando all’intestino tenue e alla parte prossimale del colon.
Diversi passaggi sono fondamentali per il successo della tecnica. Per ottenere la cannulazione in una nave molto piccola è importante selezionare ratti di peso di almeno 400 g; il sesso e l’età non sono rilevanti. È anche importante scegliere gli strumenti chirurgici corretti e il tipo di cannula. Qui, una cannula in poliuretano più piccola (0,4 mm O.D, 0,25 mm I.D.) viene inserita 1 cm nella cannula più grande (0,93 mm O.D, 0,5 mm I.D.) per ottenere un catetere funzionale e utile per consentire sia i collegamenti alla piccola arteria che al sistema di infusione più grande.
Il primo passo critico chirurgico è la pulizia della SMA e del ramo identificato per la cannulazione dal tessuto adiposo circostante (fase 3.5). Questo aiuta ad evitare l’inserimento della cannula tra il tessuto e l’arteria, che è un errore comune. Tuttavia, questa fase di pulizia è difficile in quanto il piccolo ramo della SMA è fragile e facile da danneggiare. Se il ramo è ferito, è possibile fermare l’emorragia per legatura e scegliere un ramo prossimale diverso, in modo da non sprecare l’animale.
Per prevenire la formazione di bolle d’aria all’interno della cannula ed evitare l’embolia gassosa, la cannula deve essere riempita con soluzione salina fino alla punta prima dell’inserimento nel ramo. Per fissare la cannula in posizione, l’applicazione del filo chirurgico (seta 4-0) deve essere tra il punto di inserimento nell’arteria e la punta della cannula, direttamente sulla parte superiore del vaso attorno al catetere. Il nodo chirurgico deve essere abbastanza stretto da fissare la cannula ma non troppo stretto da occluderlo (passaggio 3.12).
Il modo migliore per garantire una corretta cannulazione è quello di vedere il flusso sanguigno indietro attraverso la cannula (passo 3.10). In termini di risoluzione dei problemi, se ciò non avviene, potrebbe essere dovuto ai seguenti motivi:
la cannula non è stata inserita correttamente nell’arteria;
la cannula si trova all’interno dell’arteria ma occlusa dal nodo in una posizione errata;
la cannula è all’interno dell’arteria e una bolla d’aria nella cannula sta rallentando il flusso;
un coagulo si è formato all’interno della cannula.
Un inserimento errato può essere dovuto al posizionamento della cannula nello spazio tra l’arteria e il tessuto adiposo. In questo caso è necessario reinserire. Quando il nodo sopra la nave occlude la cannula, è possibile slegarla con molta attenzione e rifarla. Piccole bolle d’aria nel catetere generalmente non compromettono la cannulazione e non sono pericolose per la vita; ma se c’è una grande bolla d’aria nella cannula è necessario attingere alla cannula usando la siringa o riposizionare il catetere in un ramo diverso. Di solito, è possibile evitare la formazione di coaguli e mantenere il brevetto della cannula infondendo 0,2 ml di boli di soluzione salina di tanto in tanto durante il funzionamento.
Un limite di questo studio è una sottovalutazione della pervietà della cannula in tempi di infusione più lunghi: qui, un’infusione di 24 ore è stata eseguita mentre i ratti erano alloggiati in una gabbia metabolica. Per ottenere un periodo di infusione più lungo, può essere utile utilizzare la terapia anticoagulante, non somministrata in questo studio. Tuttavia, durante l’infusione, il ratto deve essere alloggiato nella gabbia metabolica perché è l’unico che supporta il sistema di infusione. Questa posizione è scomoda per l’animale che potrebbe essere stressato se trattato per un periodo più lungo. Inoltre, per l’infusione è stata utilizzata solo una soluzione salina, quindi non ci sono risultati sulla somministrazione specifica del farmaco. Una limitazione del metodo è l’impossibilità di infondere nei rami arteriosi (se presenti) superiori a quelli utilizzati per il catetere. Per questo motivo si consiglia di cannulare il ramo più vicino dall’aorta.
Nessun altro modello di infusione a lungo termine di SMA di ratto per animali non restrained è presente in letteratura. Rispetto al modello di cannulazione IMA descritto molti anni fa4, la tecnica qui descritta ha un obiettivo sperimentale più ampio perché consente l’infusione di farmaci nell’area di perfusione SMA e non è limitata al colon. Recentemente, per la prima volta, la cannulazione selettiva di un ramo della SMA è stata utilizzata per l’infusione di tossina botulinica direttamente nella regione mesenterica arteriosa per studiare l’effetto sulla muscolatura liscia intestinale10, ma molti altri farmaci potrebbero essere testati in futuro. Ad esempio, gli anticoagulanti possono essere infusi per studiare la trombosi mesenterica, o farmaci con un’azione microbiota intestinale11 o anche farmaci per malattie infiammatorie intestinali12. L’infusione intra-arteriosa è utile per gli studi sul metabolismo intestinale in particolare, perché l’effetto del farmaco è valutabile prima che il sangue passi attraverso la circolazione portale dove è soggetto al metabolismo epatico.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori riconoscono il Cen.Ri.S. (Centro di ricerche sperimentali) dell’Università Cattolica del Sacro Cuore di Roma per i permessi.
Materials
| Crile-Wood Needle Holder | 2Biological Instruments | Tip Shape: Straight; Tip Width: 2 mm; Clamping Length: 14 mm; Lock: Yes; Scissors: No; Alloy / Material: Stainless Steel; Length: 15 cm; Serrated: Yes | |
| Extra Fine Graefe Forceps | 2Biological Instruments | Tip Width: 0.5 mm; Tip Dimensions: 0.5 x 0.5 mm; Alloy / Material: Stainless Steel; Length: 10 cm | |
| Luer Stub Adapter | BD Intramedic | 23 gauge for use with 427410 tubing | |
| Membrane valve | Biomed | Mod 617 | |
| Poliurethane Catheter | ENKI | external diameter: 0.4 mm, internal diameter: 0.25 mm | |
| Silastic Catheter Laboratory tubing | Healthcare industries | 508-002 | |
| Spring Scissors | 2Biological Instruments | Tip Shape: Angled; Tips: Sharp; Alloy / Material: Stainless Steel | |
| Student Surgical Scissors | 2Biological Instruments | Tip Shape: Straight; Alloy / Material: Student Stainless Steel; Serrated: No; Feature: Student Quality |
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