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Bioengineering

Cibler l’intestin grêle du rat : perfusion à long terme dans l’artère mésentérique supérieure

Published: April 08, 2021
doi:
10.3791/60787
, , , ,
1Department of Emergency Surgery,Università Cattolica del S. Cuore

Summary

L’accès pour perfusion à long terme dans l’artère mésentérique supérieure (SMA) des rats est une intervention chirurgicale qui consiste en la canulation d’une branche proximale de la SMA. La canule sort de la plaie abdominale et est creusée dans un tunnel à travers l’espace sous-cutané jusqu’au pli interscapulaire.

Abstract

L’artère mésentérique supérieure peut être canulée chez l’homme par cathétérisme radiologique mini-invasif de l’artère fémorale ou axillaire. La canulation SMA est plus difficile chez le rat en raison de ses petites dimensions anatomiques. L’objectif de l’étude est de décrire une technique chirurgicale de canulation de l’AS chez le rat pour effectuer une perfusion à long terme de médicaments dans le lit vasculaire de l’AS chez des animaux sans restriction, ce qui entraînera un taux élevé de perméabilité du cathéter après la récupération post-chirurgicale pendant 24 heures.

Pour éviter le risque de thrombose ou de saignement de l’AMS par accès direct, une branche proximale de l’AMS est isolée, ligaturée distalement et canulée à l’aide d’un tube capillaire en polyuréthane de 0,25 mm dont l’extrémité est avancée près de l’origine de l’AMS de l’aorte. La canule est ensuite creusée par voie sous-cutanée à l’arrière du cou de l’animal et à travers la peau via une valve artificielle. La partie externe de la canule est insérée dans un système de support semi-rigide et connectée à la pompe à perfusion continue à l’extérieur de la cage où le rat est libre de se déplacer.

Le positionnement correct de la canule a été démontré par les résultats de l’angiographie post-chirurgicale et de l’autopsie. La perméabilité du cathéter après 24 heures de perfusion de solution saline dans la région SMA était assurée chez la plupart des rats par la décharge totale de la pompe et la reconnaissance d’une canule fonctionnelle pour le prélèvement sanguin ou la perfusion saline.

Introduction

L’artère mésentérique supérieure (AMS) chez l’homme comme chez le rat provient de l’aorte abdominale et alimente l’intestin en sang artériel du duodénum au côlon transverse proximal. SMA donne lieu à de nombreuses succursales.

Après perfusion capillaire, la circulation mésentérique est drainée par la veine porte vers le foie, où elle subit un métabolisme hépatique avant d’être réadmise dans la circulation systémique. La canulation de l’AS est utile à des fins diagnostiques, d’embolisation thérapeutique et de perfusion de médicaments de manière sélective ou continue pour évaluer l’effet sur l’intestin ou, surtout, le métabolisme hépatique et la clairance chimique. Chez l’homme, le cathétérisme radiologique mini-invasif de l’AMS est effectué pour le traitement endovasculaire1 ou la perfusion sélective de médicament2 en utilisant plusieurs approches percutanées comme la ponction transfémorale ou transaxillaire et la canulation.

Il existe des rapports de littérature sur différentes techniques de canulation des petits vaisseaux abdominaux: la veine mésentérique supérieure (SMV)3, l’artère mésentérique inférieure (IMA)4, le canal lymphatique mésentérique5, l’artère hépatique6 ou des études ex vivo sur perfusion intestinale7 chez le rat. En comparaison avec le côté veineux, la canulation de la SMA chez le rat est beaucoup plus exigeante en raison des risques simultanés de thrombose et de saignement, à condition qu’elle soit à haute pression. En particulier, des problèmes surviennent dans le cas où la canulation est en opération lorsque le rat se réveille de l’anesthésie sur le lit chirurgical et plus si l’expérience nécessite un animal libre dans une cage après la chirurgie.

Un article récent a décrit la canulation de SMA dans le cadre de l’expérience (mesure de la pression artérielle) chez un animal sous anesthésie8. Cependant, aucune technique n’est décrite sur la canulation chirurgicale du SMA pour perfusion à long terme chez un animal sans restriction. Le but de ce manuscrit est de décrire étape par étape une technique chirurgicale pour la canulation à long terme de la SMA à travers une branche proximale, qui permet l’infusion sélective de médicaments dans le lit mésentérique pendant au moins 24 heures (et plus). Comme une canulation stable et robuste nécessite une ligature et une fermeture permanentes du vaisseau où le cathéter est inséré, cette technique évite plutôt d’insérer le cathéter directement dans le SMA9 et s’approche du vaisseau par la canulation d’une branche proximale, aussi proximale que possible à l’origine même de l’AMM de l’aorte. La perfusion proximale permet au médicament infusé d’atteindre le lit anatomique le plus large possible, sans fermer le flux sanguin à travers le vaisseau principal.

La technique de canulation SMA du rat a de nombreuses applications. Il serait possible d’administrer des médicaments de manière sélective dans le compartiment artériel mésentérique pour obtenir une action locale au niveau gastro-intestinal et éviter les effets systémiques et le métabolisme hépatique des médicaments. Le modèle de rat cannulé SMA présente des avantages par rapport aux modèles animaux plus grands: il est moins coûteux, il est éthiquement acceptable et il est plus facile à réaliser et à apprendre. La chirurgie de canulation SMA est également plus facile à effectuer dans le modèle de rat par rapport au modèle de souris.

Protocol

Les études décrites dans ce manuscrit ont été approuvées par le Comité local d’éthique animale (Università Cattolica del Sacro Cuore, Roma) et ont été menées conformément au ministère italien de la Santé. 1. Préparation de la canule pour insertion dans la branche proximale du SMA Couper la plus grande canule de 0,93 mm O.D, 0,5 mm I.D. à la longueur requise (environ 30 cm). Coupez la plus petite canule (0,4 mm O.D, 0,25 mm I.D.) à environ 5 cm de longueur et insérez-la de 1 cm dans la plus grande canule. Fixez les deux canules ensemble par de la colle cyanoacrylate, en évitant l’occlusion de la lumière. Connectez l’extrémité libre d’une canule plus grande à un adaptateur de tige Luer (23 G) monté sur une seringue de 1 mL remplie de solution saline. Aiguisez l’extrémité libre de la plus petite canule avec des ciseaux pour faciliter l’insertion du cathéter dans la branche du SMA. Vérifiez la perméabilité de la canule en rinçant avec une solution saline.REMARQUE: L’extrémité pointue de la canule n’endommagera pas l’artère pendant le mouvement de l’animal, car elle sera fixée et ne glissera pas le long du vaisseau. 2. Préparation du rat à l’intervention chirurgicale Effectuer une anesthésie intramusculaire avec de la kétamine/xylazine (100/10 mg/kg).REMARQUE: Une profondeur d’anesthésie suffisante est jugée par l’absence ou la quasi-absence du réflexe de pincement de la patte. Rasez la fourrure des régions chirurgicales: l’abdomen pour la branche de la canule SMA et l’arrière du cou pour la sortie de la canule. Nettoyez les régions chirurgicales de manière aseptique à l’aide d’un réflexe chirurgical de pincement de la patte.REMARQUE: Toute préparation doit être effectuée avec une technique aseptique. gommage ou solution appliquée dans un mouvement circulaire, suivi d’une solution saline stérile ou d’éthanol à 70%, 3 fois. Placez l’animal en position couchée, en immobilisant les quatre membres. 3. Canulation d’une branche proximale de la SMA Assurez-vous d’une profondeur d’anesthésie appropriée en testant le réflexe de pincement de la patte avant l’incision. Appliquez un drap chirurgical stérile résistant à l’eau. Avec une lame de scalpel, ouvrez la paroi abdominale avec une incision droite de 3 cm sur la ligne médiane de la région mésogastrique à travers tous les plans abdominaux dans le péritoine. Placez des gazes, imbibées de solution saline, autour de l’incision de laparotomie sur le dessus du drap chirurgical. Utilisez des sutures pour garder l’incision chirurgicale ouverte.REMARQUE: Tous les écouvillons et les instruments chirurgicaux doivent être stériles. Utilisez des cotons-tiges pour identifier et exposer l’intestin grêle. Suivez sa disposition naturelle pour identifier le mésentère. Extraire le mésentère de la coupe laparotomique et le déposer vers le bas sur les gazes (Figure 1A). Identifiez le SMA en sentant la pulsation. Utilisez les cotons-tiges pour « faire place » entre la graisse mésentérique et découvrir le SMA et 2-3 de ses branches proximales. Choisissez une branche proximale de la SMA suffisamment grande pour permettre les manœuvres chirurgicales de canulation. Attachez cette branche (avec une suture de soie 4-0) à 3-4 cm en aval de son origine pour permettre son expansion en gardant les extrémités de suture assez longtemps pour être manipulées plus tard. Placez un support rigide sous la branche de la SMA. La poignée des pinces chirurgicales est suffisante ici. Tenez l’extrémité de la plus petite canule (reliée à la plus grande canule à l’extrémité opposée) avec la main dominante à l’aide d’une pince et tirez les extrémités de suture avec l’autre main pour forcer le vaisseau et faciliter l’entrée du cathéter (Figure 1B). Maintenez l’extrémité de la canule à un angle de 20° par rapport au plan du vaisseau dans la direction opposée au flux sanguin. Appuyez légèrement sur la pointe pour pénétrer dans la paroi de l’artère et insérez la canule.REMARQUE: La canulation est effectuée sans couper l’artère; l’extrémité du cathéter brisera la paroi du vaisseau et facilitera l’entrée. Le sang qui retourne dans la canule confirme l’insertion correcte. Poursuivre l’insertion de la canule sur 1 cm supplémentaire dans la branche artérielle proche de l’origine de la SMA. Fixez la canule à l’artère avec un nœud chirurgical (soie 4-0) et vérifiez son bon fonctionnement en rinçant 1 mL de solution saline stérile ou avec un prélèvement sanguin. 4. Creusement d’un tunnel de la canule et placement dans le système de support de perfusion Placez un drap chirurgical stérile sur l’incision avant de changer la position de l’animal.REMARQUE: Le tunnel du dos à l’abdomen est créé en exerçant une pression dans l’espace sous-cutané avec un instrument chirurgical pointu. Un drap chirurgical stérile sur l’abdomen et les incisions dorsales doit être utilisé. Faites une incision de 1 cm de la région postérieure du cou et accueillez une valve sphérique. Passer la canule de l’accès de la laparotomie à la valve placée dans le cou à travers les tissus sous-cutanés (Figure 2A). Fermez l’extrémité distale de la canule avec un bouchon de cathéter pour éviter l’entrée d’air. Remplacez l’intestin grêle dans la cavité abdominale. Fermez la paroi abdominale et fermez les incisions cutanées avec une suture de soie continue 3-0. Fixez la valve à la peau du cou avec des points de suture. Fermez les incisions cutanées avec une suture de soie continue 3-0. 5. Gestion postopératoire Habillez le rat avec une veste pour protéger la valve bouton. Protéger la partie exposée de la canule avec une tige d’acier pendant la perfusion et la fixer à la valve (Figure 2B).REMARQUE: Étant donné que la chirurgie est effectuée sous technique aseptique, les antibiotiques ne sont pas indiqués. Les AINS doivent être administrés en préopératoire pour le contrôle de la douleur (5 mg/mL de méloxicam injectable, 1 mg/kg une fois par jour pendant 3 jours maximum). Après l’opération, stabiliser le rat dans une cage métabolique pendant le temps de la perfusion (24h). Ensuite, ré-anesthésier le rat avec l’inhalation d’isoflurane pendant le temps nécessaire pour démonter le système de perfusion. Par la suite, il est possible de loger le rat dans une cage normale avec un cycle lumière/obscurité de 12 heures et un accès libre à la nourriture et à l’eau. Stabiliser le rat dans une cage métabolique pendant le temps de la perfusion. Le rat est maintenant éveillé et libre de bouger et de manger dans la cage. Raccorder l’extrémité distale de la canule à une pompe élastomère (volume max de 100 mL, débit de 5,0 mL/h) remplie de 50 mL de solution saline stérile. Procéder à la perfusion pendant 24 heures (Figure 2C). Le premier jour, administrer des antibiotiques intramusculaires (enrofloxacine 10 mg/kg pendant les 24 premières heures) puis passer à l’administration orale (enrofloxacine 100 mg dans 500 mL dans l’eau potable). Administrer un traitement analgésique par voie intramusculaire pendant le réveil (kétoprofène 5,0 mg / kg) et dans les jours suivants par voie orale (paracétamol 200 mg dans l’eau potable).REMARQUE: Diluer la thérapie orale administrée dans l’eau potable pour obtenir un goût supportable. Surveillez la mesure du poids corporel et l’hydratation. À la fin du temps de perfusion (24 heures), démontez le système de perfusion externe de l’animal en retirant la pompe, la gaine, la tige d’acier et la valve du rat. Fermez et coupez la canule lorsqu’elle sort du cou, en laissant cette extrémité sous la peau du cou après la suture de la plaie.REMARQUE: Dans cette phase, il peut être nécessaire d’anesthésier les rats pendant quelques minutes par inhalation d’isofluorane. Hébergez le rat, individuellement, dans une cage normale avec un cycle lumière/obscurité de 12 heures et un accès libre à la nourriture et à l’eau.REMARQUE: L’apport alimentaire initial post-opératoire est d’environ 30 g / jour L’apport initial en eau est d’environ 50 ml / jour. Le poids moyen devrait être d’environ 400 mg.

Representative Results

Dans cette étude, la procédure a été effectuée sur 15 rats. Au bout de 24 heures de perfusion de solution saline, aucun signe de solution saline ou de perte de sang n’a été observé dans les cages métaboliques et la plaie abdominale était propre chez tous les animaux, tout comme les cages. Dans les cages normales, des rats ont été observés pendant 5 jours avec une surveillance quotidienne du poids et de l’apport en eau / nourriture. Au cours de cette période, l’état général des animaux à l’examen général était bon sans aucune indication d’anomalies comportementales. Tous les rats immédiatement après la chirurgie ont recommencé à se nourrir. La consommation quotidienne moyenne de nourriture et d’eau a augmenté progressivement jusqu’à la normale après 3 jours, comme le montrent les figures 3A et 3B, respectivement. Dans la figure 3C, il est possible de voir que la prise de poids était régulière, augmentant progressivement jusqu’à la fin de la période d’observation. Aucune altération des selles n’a eu lieu et les excréments quotidiens et la production d’urine étaient normaux. Après 24 heures, il y avait des résidus salins (respectivement, 40 mL et 20 mL) dans seulement 2 pompes remplies de 50 mL de solution saline tandis que toutes les autres (86,7%) étaient vides. De plus, après cette période de perfusion, 12 canules (80 %) étaient encore fonctionnelles pour le prélèvement sanguin et la perfusion de solution saline (5 mL), tandis que 3 canules n’étaient plus brevetées (2 d’entre elles étaient les canules reliées aux pompes avec des résidus) (tableau 1). Lors de la nécropsie, 100 % des canules (n = 15) étaient encore situées dans la branche de l’AMS et aucun rat ne présentait de signes d’ischémie intestinale (figure 4B) ou de saignement intrabdominal. Les 3 canules occluses ont été retrouvées pliées respectivement à 0,5 cm, 1 cm et 1,5 cm de l’insertion dans la branche SMA. Ce phénomène est probablement dû aux mouvements des animaux dans les cages. Chez 5 rats, immédiatement après la procédure et avant le raccordement de la pompe, 2 mL de produit de contraste iodé ont été injectés dans la canule mésentérique, pour obtenir une angiographie par un intensificateur d’image (l’angiographie a été réalisée en peropératoire). Chez chaque rat (n = 5), il était possible de voir le cercle artériel mésentérique et le SMA et ses branches principales sans que le produit de contraste ne se propage dans l’abdomen, comme le montre la figure 4A. Cela a confirmé que la canule était bien placée et fixée à la branche de la SMA. Figure 1 : Photographies expérimentales. (A) L’intestin grêle suivant sa disposition naturelle sur une gaze (il est possible de visualiser le SMA avec toutes les branches); B) L’opérateur insérant la canule dans la branche SMA. Il est nécessaire d’avoir un support solide sous le récipient pour garantir l’insertion du tube. La suture distale en soie ferme le vaisseau et la suture proximale fixe le cathéter à l’intérieur de la branche. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure. Figure 2 : Système de support de perfusion. (A) Une fois creusée par voie sous-cutanée, la canule émerge de la région postérieure du cou par la valve blanche; (B) Un rat portant une veste pour stabiliser la valve blanche. Une tige d’acier protège le cathéter pendant la perfusion. (C) Représentation schématique d’un rat logé dans une cage métabolique lors de l’infusion d’une solution saline avec une pompe élastomère reliée à la canule sortant de la tige d’acier. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure. Figure 3 : Données représentatives de l’apport alimentaire, de la consommation d’eau et de la prise de poids des rats (n = 15) au cours d’une période d’observation de 5 jours. L’apport quotidien moyen en nourriture (A) et en eau (B) augmente progressivement et se stabilise aux niveaux physiologiques après 3 jours. La prise de poids moyenne (C) augmente progressivement jusqu’à la fin de la période d’observation. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure. Figure 4: Photographies (A) de l’angiographie de contraste de la région artérielle mésentérique après perfusion de contraste à travers la canule (preuve d’une canule correctement placée) et (B) de la canule encore bien positionnée pendant l’autopsie. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. Pompe élastomère Canule Vide Avec résidu Brevet Pas de brevet n=15 13 2 12 3 % 86.7 13.3 80 20 Tableau 1 : Décharge de la pompe en élastomère et perméabilité de la canule après 24 heures de perfusion saline. La perméabilité a été testée en prélevant du sang avec une seringue et en injectant 5 mL de solution saline dans la canule.

Discussion

Le principal avantage de ce modèle d’infusion de SMA de rat est sa constance et sa durabilité pendant au moins 24 heures chez la grande majorité des animaux. La perfusion d’anticoagulant pourrait allonger cet intervalle de temps. Le modèle permet une perfusion fiable de médicaments de manière sélective dans la région mésentérique, ciblant l’intestin grêle et la partie proximale du côlon.

Plusieurs étapes sont essentielles au succès de la technique. Pour obtenir la canulation dans un très petit récipient, il est important de sélectionner des rats pesant au moins 400 g; le sexe et l’âge ne sont pas pertinents. Il est également important de choisir les bons instruments chirurgicaux et le type de canule. Ici, une canule en polyuréthane plus petite (0,4 mm O.D, 0,25 mm I.D.) est insérée à 1 cm dans la plus grande canule (0,93 mm O.D, 0,5 mm I.D.) pour obtenir un cathéter fonctionnel et utile permettant à la fois les connexions à la petite artère et au plus grand système de perfusion.

La première étape chirurgicale critique consiste à nettoyer l’AMS et la branche identifiée pour la canulation du tissu adipeux environnant (étape 3.5). Cela permet d’éviter l’insertion de la canule entre le tissu et l’artère, ce qui est une erreur courante. Cependant, cette étape de nettoyage est difficile car la petite branche du SMA est fragile et facile à endommager. Si la branche est blessée, il est possible d’arrêter le saignement par ligature et de choisir une branche proximale différente, afin de ne pas gaspiller l’animal.

Pour éviter la formation de bulles d’air à l’intérieur de la canule et éviter l’embolie gazeuse, la canule doit être remplie de solution saline jusqu’à la pointe avant l’insertion dans la branche. Pour maintenir la canule en place, l’application de fil chirurgical (soie 4-0) doit se faire entre le point d’insertion dans l’artère et l’extrémité de la canule, directement sur le dessus du vaisseau autour du cathéter. Le nœud chirurgical doit être suffisamment serré pour fixer la canule mais pas trop serré pour l’obstruer (étape 3.12).

La meilleure façon d’assurer une canulation correcte est de voir le sang refluer à travers la canule (étape 3.10). En termes de dépannage, si cela ne se produit pas, cela peut être dû aux raisons suivantes:

la canule n’a pas été correctement insérée dans l’artère;

la canule est à l’intérieur de l’artère mais obstruée par le nœud dans une position incorrecte;

la canule est à l’intérieur de l’artère et une bulle d’air dans la canule ralentit l’écoulement;

un caillot s’est formé dans la canule.

Une insertion incorrecte peut être due au positionnement de la canule dans l’espace entre l’artère et le tissu adipeux. Dans ce cas, une réinsertion est nécessaire. Lorsque le nœud au-dessus du récipient obstrue la canule, il est possible de la dénouer très soigneusement et de la refaire. Les petites bulles d’air dans le cathéter ne compromettent généralement pas la canulation et ne mettent pas la vie en danger; mais s’il y a une grosse bulle d’air dans la canule, il est nécessaire de remonter sur la canule à l’aide de la seringue ou de repositionner le cathéter dans une branche différente. Habituellement, il est possible d’éviter la formation de caillots et de garder la canule patente en infusant des bolus de 0,2 mL de solution saline de temps en temps pendant le fonctionnement.

Une limitation de cette étude est une sous-évaluation de la perméabilité de la canule dans des temps de perfusion plus longs: ici, une perfusion de 24 heures a été effectuée alors que les rats étaient logés dans une cage métabolique. Pour obtenir une période de perfusion plus longue, il peut être utile d’utiliser un traitement anti-coagulant, non administré dans cette étude. Cependant, pendant la perfusion, le rat doit être logé dans la cage métabolique car c’est le seul qui soutient le système de perfusion. Cet endroit est inconfortable pour l’animal qui pourrait être stressé s’il était traité pendant une période plus longue. En outre, seule une solution saline a été utilisée pour la perfusion, de sorte qu’il n’y a pas de résultats sur l’administration de médicaments spécifiques. Une limitation de la méthode est l’impossibilité d’infuser dans les branches artérielles (le cas échéant) au-dessus de celle utilisée pour le cathéter. Pour cette raison, il est recommandé de canuler la branche la plus proche de l’aorte.

Aucun autre modèle de perfusion à long terme de SMA de rat pour les animaux non retenus n’est présent dans la littérature. Par rapport au modèle de canulation IMA décrit il y a de nombreuses années4, la technique décrite ici a une cible expérimentale plus large car elle permet la perfusion de médicaments dans la zone de perfusion de SMA et ne se limite pas au côlon. Récemment, pour la première fois, la canulation sélective d’une branche du SMA a été utilisée pour l’infusion de toxine botulique directement dans la région mésentérique artérielle afin d’étudier l’effet sur le muscle lisse intestinal10, mais de nombreux autres médicaments pourraient être testés à l’avenir. Par exemple, des anticoagulants peuvent être perfusés pour étudier la thrombose mésentérique, ou des médicaments ayant une action de microbiote intestinal11 ou même des médicaments pour les maladies inflammatoires de l’intestin12. La perfusion intra-artérielle est utile pour les études du métabolisme intestinal en particulier, car l’effet du médicament est évaluable avant que le sang ne passe par la circulation porte où il est soumis au métabolisme hépatique.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Les auteurs tiennent à remercier le Cen.Ri.S. (Centro di ricerche sperimentali) de l’Università Cattolica del Sacro Cuore à Rome pour les permis.

Materials

Crile-Wood Needle Holder 2Biological Instruments Tip Shape: Straight; Tip Width: 2 mm; Clamping Length: 14 mm; Lock: Yes; Scissors: No; Alloy / Material: Stainless Steel; Length: 15 cm; Serrated: Yes
Extra Fine Graefe Forceps 2Biological Instruments Tip Width: 0.5 mm; Tip Dimensions: 0.5 x 0.5 mm; Alloy / Material: Stainless Steel; Length: 10 cm
Luer Stub Adapter BD Intramedic 23 gauge for use with 427410 tubing
Membrane valve Biomed Mod 617
Poliurethane Catheter ENKI external diameter: 0.4 mm, internal diameter: 0.25 mm
Silastic Catheter Laboratory tubing Healthcare industries 508-002
Spring Scissors 2Biological Instruments Tip Shape: Angled; Tips: Sharp; Alloy / Material: Stainless Steel
Student Surgical Scissors 2Biological Instruments Tip Shape: Straight; Alloy / Material: Student Stainless Steel; Serrated: No; Feature: Student Quality
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References

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Borrello, A., Agnes, A. L., Pellegrino, E., Magalini, S., Gui, D. Targeting the Rat’s Small Bowel: Long-Term Infusion into the Superior Mesenteric Artery. J. Vis. Exp. (170), e60787, doi:10.3791/60787 (2021).
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