ויזואליזציה של עמידות בקטריאלי באמצעות הפלורסנט אנטיביוטי רגשים

1. סינתזה של אלקין-fluorophores סינתזה של NBD-אלאלקין (7-ניטרו-N-(אביזר 2-yn-1-yl) benzo [ג] [1, 2, 5] oxadiazol-4-אמין) התמוססות 1,031 מ”ג של 4-כלורט-7-ניטרו-בנזיל (5.181 ממול) ב-60 מ ל של טטרהידרופורונה (THF). הוסף 1,857 מ”ג של CsCO3 (5.696 mmol), ולאחר מכן 0.39 mL של propargylamine (6.1 mmol). לחמם את התגובה 50 ° c עבור 2 h, אשר יהפוך מחום לירוק, ואז קריר טמפרטורת החדר (RT). מסננים את התגובה באמצעות הסיוע סינון (ראה טבלת חומרים), ולשטוף עם אתיל אצטט (EA). לרכז את פילטרט תחת לחץ מופחת, ואז לפזר את השאריות ב 150 ml של EA ולעבור 500 ml הפרדת משפך. לשטוף את הפתרון EA עם 100 mL עם מים מלח בהתאמה. ואז לשלב את השלבים מימית ולשטוף 2x עם 100 mL של EA. מייבשים את השלבים האורגניים המשולבים באמצעות מגנזיום גופרתי, ואז מסננים ומתרכזים תחת לחץ מופחת. לטהר את המוצר גולמי על ידי פלאש כרומטוגרפיה על סיליקה ג’ל (20 – 30% EA באתר הנפט [PE]), בדיקת טוהר על ידי כרומטוגרפיה מאסיבית ספקטרומטר המסה (LCMS, [M + H]+ = 219.1) ו/או תהודה מגנטית גרעינית (nmr) ספקטרוסקופיית, שינויים כימיים כדלקמן:מיכל בן H NMR (תקליטור3OD, 600 MHz) δ 8.54 (d, j = 8.7 hz, 1h), 6.35 (d, j = 8.4 hz, 1h), 4.31 (dd, j = 5.7 Hz, j = 2.5 Hz, 2H), 2.43 (t, j = 2.5 hz, 1h); מיכל בן 13 C NMR (תקליטור3OD, 150 MHz) δ 144.3, 143.7, 142.2, 135.8, 125.7, 100.0, 76.5, 74.2, 33.4.הערה: כאשר מבצעים טיהור בעזרת כרומטוגרפיה של סיליקה ג’ל, הכינו את הטור בעזרת הקוטביות הפחות של הממיסים המפורטים. תרכובת גולמי ניתן לטעון כפתרון מרוכז או נספחת על סיליקה אם מסיסות אינו מאפשר את זה. לאחר התרכובת נוספה לחלק העליון של סיליקה, לרוץ דרך 1-2 כרכים העמודה של הממס אותו בשימוש עבור הרטבה סיליקה. לאחר מכן להתחיל עם יחס הממס המפורטים, ריצה דרך לפחות 1 העמודה היקף של כל הממס, והקפד לא לעשות קפיצות גדולות הרכב ממס. לאסוף שברים, ולבדוק טוהר/זהות על ידי LCMS או אל-החום (כרומטוגרפיה שכבה דקה). לשלב שברים טהורים להתרכז תחת לחץ מופחת על ידי התאיידות רוטרי. סינתזה של דמקא-אלקין (2-(7-(דימאמילמינו) -2-אוקסו-2H-כרומאן-4-yl)-N-(אביזר 2-yn-1-yl) מרחמיד).לפזר 5.02 g של 3-(dimethylamino) פנול (36.6 mmol) ב 30 מ ל של אתנול, ולאחר מכן להוסיף 6.7 mL של diאתיל 1, 3-acetonedicarboxylate אוחר (36 mmol). הוסף 10.5 g שללש2 (77.2 mmol), ולאחר מכן ריפלוקס את הפתרון האדום עבור 42 h. ה9.20 וסיפו תוספת של כ-2 מהתוספות של המשחק (67.6 mmol), ואז ריפלוקס עבור 8 h. לצנן את התגובה ולהתרכז תחת לחץ מופחת. לפזר מוצק אדום כתוצאה ב 200 mL של EA, מסנן, ולאחר מכן להעביר 500 mL הפרדת משפך. לשטוף את EA עם 200 mL כל המים והמלח, ולאחר מכן יבש מעל הלחות מגנזיום סולפט. מסננים את שלב אורגני מיובש ולהתרכז תחת לחץ מופחת. לטהר את אדום מוצק (אתיל 2-(7-(dimethylamino) -2-אוקסו-2H-chromen-4-yl) על ידי פלאש כרומטוגרפיה על סיליקה ג’ל (0 – 100% EA ב PE), בדיקת טוהר על ידי lcms ([M + H]+ = 275.1) ו/או nmr, שינויים כימייםמיכל בן H NMR (CDCl3, 600 מגה-הרץ) δ 7.30 (d, j = 8.9 hz, 1h), 6.52 (dd, j = 8.9 hz, j = 2.6 hz, 1H), 6.40 (ד, j = 2.6 Hz, 1h), 5.87 (ז, 1h), 2.96 (ז, 8H), 2.25 (ד, J = 1.2 Hz, 3h). לפזר 488 מ”ג של אתיל 2-(7-(dimethylamino) -2-אוקסו-2H-chromen-4-yl) אצטט (1.18 mmol) ב 10 מ ל של thf, ולאחר מכן להוסיף פתרון של 157 Mg של lioh · H2O (3.74 mmol) בתוך 15 מ ל של מים. מערבבים את התגובה ב RT עבור 3 h, ואז לעבור משפך הפרדה לדלל עם תוספת 50 mL של מים. לשטוף את תערובת התגובה 2x עם 50 mL של דיאתיל אתר (Et2O), ולאחר מכן לשטוף את השלב האורגני המשולב 2x עם 25 מ ל של מים. קחו את כל הזרז צהוב עם השכבה האורגנית. לרכז את השלב האורגני תחת לחץ מופחת באמצעות מאייד רוטרי. Acidify השלב מימית ל-pH = 2 עם HCl מרוכז, וקריר עד 4 ° c ללילה. לסנן את השלב acidified ימית ולהוסיף את הצבע הצהוב מוצק לשלב אורגני מרוכז.הערה: 2-(7-(dimethylamino) -2-אוקסו-2H-chromen-4-yl) חומצה אצטית ניתן להשתמש ללא טיהור נוסף, אבל זה יכול להיבדק על ידי lcms ([M + H]+ = 247.1) ו/או nmr, משמרות כימיות כדלקמן:מיכל בן H NMR (CDCl3, 600 MHz) δ 7.41 (d, J = 9.0 Hz, 1h), 6.62 (dd, j = 9.2 Hz, j = 2.8 hz, 1h), 6.52 ( d, j = 2.8 Hz, 1h), 5.98 (ד, j = 0.9 hz, 1h), 3.05 (ד, י =, 1 בחודש), ב (d , j = 2.35 hz, 2h); מיכל בן 13 C NMR (CDCl3, 150 MHz) δ 162.2, 155.7, 152.9, 152.8, 125.3, 109.7, 109.3, 109.1, 108.8, 98.3, 40.2, 18.5. לפזר 466 מ”ג של 2-(7-(dimethylamino) -2-אוקסו-2H-chromen-4-yl) חומצה אצטית (1.89 mmol) ב 7 מ ל של יבש n,n-דימתיתיל (dmf) ומקום תחת אווירה של חנקן. התמוססות 0.33 mL של propargylamine (5.1 mmol) ב 7 מ ל של יבש DMF תחת חנקן. הוסף 1.30 מ ל של די-איזופרופיל אמין (DIPEA, 7.50 ממול) לפתרון הצבע, ואז 535 מ”ג של O-(1h-6-chlorobenzotriazole-1-yl)-1, 1, 3, 3-טטרמתילורוניום hexafluorophosphate (בכצ, 1.29 mmol). מערבבים את פתרון הצבע המופעל עבור 15 דקות ב RT, לאחר מכן להוסיף את הפתרון מאמין dropwise, ולעזוב לערבב לילה. למחרת, לדלל את התגובה עם 35 mL של מים ואז להתרכז תחת לחץ מופחת. מחיצה הכתום כתוצאה מוצק בין EA ו מלח (100 mL כל אחד) ב 250 mL הפרדת משפך. הפרד את השכבות (להפעיל את שתי השכבות לתוך מבחנות שונות), ולשטוף את השלב מימית עם 100 mL של EA. לרכז את השלבים האורגניים המשולבים תחת לחץ מופחת, ולאחר מכן לפזר מחדש את הכתום ב 3 מ ל של 1:1 acetonitrile (ACN)/מים (v/v). לטהר את המוצר גולמי על ידי הזרקת אל השלב ההפוך לחץ בינוני נוזלי כרומטוגרפיה (MPLC) מערכת מצויד בעמודת מחסנית סי18 (ממס A: מים, ממס B: ACN). בדיקת שברים עבור טוהר על ידי LCMS ([M + H]+ = 284.1, nmr משמרות כימיות נתון למטה), ולאחר מכן לשלב ליאופליז שברים המתאימים לתת 2-(7-(dimethylamino) -2-אוקסו-2H-כרומאן-4-yl)-N-(אביזר 2-yn-1-YL) מרחאמיד, nmr שינויים כימיים כדלקמן:מיכל בן H NMR (600 מגה-הרץ, DMSO-d6) δ 8.65 (t, J = 5.4 hz, 1h), 7.52 (ד, j = 9.0 hz, 1h), 6.72 (dd, J = 9.1, 2.6 hz, 1H), 6.55 (d, J = 2.6 hz, 1H), 6.00 (s, 1h), 3.88 – 3.87 (m, 2H), 3.62 (s, 2H), 3.13 (t, J = 2.5 Hz, 1h), 3.01 (ים, 6h); מיכל בן 13 C NMR (125 מגה-הרץ, DMSO-d6) δ 167.7, 160.7, 155.4, 152.9, 151.0, 126.0, 109.4, 109.1, 108.1, 97.5, 80.9, 73.3, 39.7, 38.4, 28.2. 2. סינתזה של אנטיביוטיקה פלורסנט הכינו azide-נגזרות של אנטיביוטיקה כמתואר בעבר14,15,16.הערה: ההליך הוא ספציפי לכל אנטיביוטיקה ודורש בדיקה קפדנית של יחסי הגומלין בין פעילות המבנה (SAR) של מולקולת האב כדי להבטיח שהאנטיביוטיקה הפונקציונליזציה תשמור על פעילות הדומה לאב. (למשל, ציפרופלוקסאצין16, לינזוכסה14, ו הטרימאופלרים15). ראה איור 1 לדוגמאות של אנטיביוטיקה פלורסצנט שפורסמה, וסכימת הסינתזה הכללית. לחץ על הליך התגובה Aהערה: עבור רוב האנטיביוטיקה, בצע את ההליך המפורט כאן עבור מזרז נחושת Huisgen [2 + 3] הוספת ציקלודה (שלב 2.1) ו-האלה הפלורסנט (מוכן בשלב 1). מניחים את azide-אנטיביוטי בתוך הבקבוקון התחתון עגול ולהוסיף טרט-butanol (tbuoh) ומים (1:1 v/v, 25 מ ל כל לממול azide). הוסיפו את הפלואורוורידים-אלאלקין המוכנים בשלב 1.1 (3 eq) והחום את התגובה ל 50 ° c. ואז להוסיף נחושת סולפט (100 mM במים, 0.6 eq.) לתגובה, ואחריו חומצה אסקורבית (500 mM במים, 2.4 eq.). מערבבים את התגובה ב 50 ° c עבור 1 h, או עד ניתוח על ידי LCMS לציון השלמת התגובה (הצריכה המלאה של התחלת azide). מגניב את התגובה ולטהר לפי הצורך לגרדום אנטיביוטיקה ולהמשיך לטיהור או על ידי שלב 2.3 או 2.4.הערה: מספר שיטות טיהור שונות אפשריות, בהתאם לקוטביות וליציבות הגרדום. לחץ על הליך התגובה Bהערה: בצע הליך זה עבור אנטיביוטיקה מבוססת פפטיד, כדי לספק תנאי תגובה חזקים יותר (עבודה שלא פורסמה, פצאנג, 2019). מניחים את פפטיד azide-אנטיביוטי בבקבוקון התחתון עגול ולהוסיף מספיק DMF (750 mL/mmol azide) כדי להמיס. הוסיפו את הפלואורופור-אלאלקין המוכנים בשלב 1 (5 eq) והחום את התגובה ל-50 ° c עבור 1 h. הוסף נחושת (I) יודיד (20 eq.), ואז DIPEA (120 eq.), ואז חומצה אצטית (240 eq.). מערבבים את התגובה ב 50 ° c עבור 1 h, או עד הניתוח של LCMS מציין השלמת התגובה (כלומר, הצריכה המלאה של הפעלת azide). לצנן את התגובה ולהמשיך לטיהור על ידי שיטה 1 (ראה שלב 2.3). שיטת טיהור 1 (משמש עבור ציפרופלוקסאצין, מתיונין ושינזוכסה) הכנס את תגובת הקליק המקורר ישירות אל עמודת מחסנית MPLC סי18. שילוב שלב ארוך לשטוף (בערך 10 דקות) בתחילת הפעלה (100% ממס A), ולאחר מכן להפעיל מעבר הדרגתי עד 100% ממס B, ואחריו חזרה ממיס A.הערה: ממיס ניתן לבחור מתוך מים, 0.05 – 0.1% החומצה פורמית (הפא) במים, 0.05-0.1% trifluoroacetic חומצה (tfa) במים, בהתאם מסיסות, יציבות, ואת הרזולוציה הטובה ביותר של פסגות. ממס B ניתן לבחור מ acetonitrile (ACN), 0.05 – 0.1% פא ב ACN, 0.05 – 0.1% TFA ב ACN, כדי להתאים את הממס A. אם הימנעות מוכיחה קשה, מתנול עשוי לשמש במקום ACN. לאסוף ולשלב שברים מתאימים, כפי שמצוין על ידי LCMS וצבע (המסה הנכונה נראה, שיא ייחודי), ואז ליסטליז לתת את (למחצה) אנטיביוטיקה פלורסנט טהורה. לטהר את המוצר במידת הצורך. הערכת טוהר על ידי NMR ו/או LCMS וכרומטוגרפיה נוזלית בלחץ גבוה (בדיקות), תוך שימוש בטור ובשיטה המתאימה לגרדום. שיטת טיהור 2הערה: אם מסיסות מאפשר, ניתן לבצע טיהור מחודש על ידי בדיקה מימית (משמש עבור macrolides, עבודה שלא פורסמה, סטון 2019). לדלל את תגובת לחיצה מקורר עם מים Et2O (1:1 v/v, בערך 10-קיפול דילול מנפח התגובה הראשונית), העברת משפך הפרדה בגודל כראוי. הפרידו את השכבות ושטפו את השלב המים פעמיים עם Et2O. רוחצים את השלבים האורגניים המשולבים 2x עם מים (נפח שווה עם שלב אורגני), ולאחר מכן יבש מעל Na2SO4. מסננים את שלב אורגני מיובש ולהתרכז תחת לחץ מופחת. טהר את המוצר הגולמי על-ידי המPLC ו/או ה2.4.4 כמתואר בשלב הפעולה.הערה: ראה איור 2 לדוגמאות של שלמות, שלמה ומטוהרים לחץ על עקבות lcms התגובה. התשואות טיפוסי מטוהרים עבור אנטיביוטיקה-fluorophore לחץ על טווח התגובות מ 30-80%.התראה: רוב הכימיקלים המשמשים בסינתזות אלה מחזיקים בסכנות בטיחות ספציפיות. יש לקחת את הזהירות בכל עת, כולל שימוש בציוד הגנה אישי. Et2O, tbuoh, פא, חומצה אצטית, PE, EA, THF, ACN, Dmf, אטוה, dipea, propargylamine, ו-htu הם דליקים; להימנע ממגע עם מקורות חום או ניצוץ. THF, propargylamine, DIPEA, tBUOH, הפא, dmf, ו PE רעילים כולם; להימנע מחשיפה. Propargylamine, CsCO3,לב2, LIOH-H2O, Dipea, cui, הפא, חומצה אצטית, ו-HCl כולם מאכל; להימנע ממגע ולהיות מודע למגע פני השטח. האוכלהשני, קוסו4, CUSO ו-PE מציגים סכנות סביבתיות; היות מודעים לתנאי סילוק. THF יכול ליצור מטעני נפץ; לטפל בתנאי אחסון. אזידים אורגניים הם חומר נפץ; לדאוג במיוחד עם ייצור בקנה מידה גדול. 3. הערכה של פעילות מיקרוביאלית הערה: כל העבודה הכרוכה בחיידקים צריכה להתבצע בתנאים סטריליים כדי למנוע זיהום של השיטת או המעבדה. כל המדיה צריכה להיות אוטומטית לפני השימוש, ו פלסטלינה וציוד כגון פיפטות חייב להישמר עקר. מומלץ לבצע את העבודה בכיסוי ביולוגי (סוג 2). פס גליצרול מניות של זנים חיידקיים המתאימים לגרדום אנטיביוטי על ליבסואז מרק אגר (LB, מוכן לכל הוראות היצרן), ולצמוח לילה ב 37 ° c.הערה: הבחירה של חיידקים כדי לבדוק את הפעילות אנטיבקטריאלי חייב להתבצע על בסיס הגרדום אנטיביוטי בשימוש. יש לבחור בטווח המייצג של 5 – 10 חיידקים מהזן הידוע כפגיע לאנטיביוטיקה, בהתחשב ביכולות הלוגיסטיות של המעבדה. אם אפשרי, חיידקים עמידים צריך גם להיבדק. הפרוטוקול שניתן להלן יעבוד על רוב החיידקים, אבל בדוק אם תנאים מיוחדים נדרשים (למשל, CO2, מדיה מיוחדת) ולבצע שינויים לפי הצורך. החיידק הצליח להשתמש בתנאים האלה כוללים את סטייהילוקוצ’י, סטרפטוקוצ’י, באקל, אי קולי, קלבסילה דלקת ריאות, פסאודומונס aeruginosa, ו בידור faecium. בחרו מושבה אחת מלוחית הרישוי, והתרבות שבין לילה ב-5 מ ל של ציר מילר-הינטון (CAMHB), שהוכן לפי הוראות היצרן ב-37 ° c. לדלל את התרבויות לילה ~ 40-קיפול ב CAMHB ולצמוח לשלב באמצע יומן, צפיפות אופטית ב 600 nm (OD600) = 0.4 – 0.8, כרך 5 מ ל). הכנת פתרונות מניות של כל אנטיביוטיקה פלורסנט ב 1.28 mg/mL במים סטריליים, ו פיפטה 10 μL של אנטיביוטיקה לעמודה הראשונה של 96 צלחת הבאר. הוסף 90 μL של CAMHB לעמודה הראשונה ו 50 μL לכל הבארות האחרות. לאחר מכן, בצע דילול של 2 בקיפול סדרתי על פני הצלחת. לערבב ביסודיות, ולאחר מכן לדלל את התרבויות באמצע הפאזה כדי ~ 106 המושבה ויוצרים יחידות (cfu)/mL ולהוסיף 50 μl לכל הבארות, כדי לספק ריכוז סופי של ~ 5 x 105 cfu/mL.נפח של תרבות (ml) = (אמצעי אחסון מדיה ב-ml)/(OD600 x 1,000)לדוגמה, עבור OD600 = 0.5 תרבות בנפח המדיה הרצוי של 12 מ”ל, להוסיף (12/(0.5 x 1,000) = 0.024 mL של התרבות עד 12 מ ל של מדיה לכסות את הצלחות עם כיסוי והדגירה ב 37 ° c עבור 18 – 24 שעות בלי לרעוד. לבדוק חזותית את הצלחות, עם מיקרופון להיות הריכוז הנמוך ביותר ללא צמיחה גלויה.הערה: ראו טבלה 1 לקבלת מספר דוגמאות לאנטיביוטיקה פעילה ובלתי פעילה של פלורסנט. 4. ניתוח הצטברות בדיקה על ידי ספקטרופוטומטר וזרימה הערה: צנטריפוגה פעמים אלה כבר אופטימיזציה עבור E. coli, כך שינויים קלים עשויים להיות נחוצים עבור מינים אחרים. נתונים מייצגים עבור הצטברות בדיקה מדווחת על הבדיקה המסומנת ב-NBD ציפרופלוקסאצין. פס גליצרול מניות של זנים חיידקיים על LB אגר ולצמוח לילה ב 37 ° c. בחרו מושבה אחת מלוחית הרישוי והתרבות לילה ב-LB ב-37 ° c. לדלל תרביות לילה ~ 50-קיפול במדיה ולצמוח לשלב באמצע היומן (OD600 = 0.4 – 0.8). צנטריפוגה את התרבויות ב 1,470 x g עבור 25 דקות ו decant התקשורת. להשעות את החיידקים ב 1 מ ל של מלוחים מאגור פוספט (PBS), אז צנטריפוגה ב 1,470 x g עבור 15 דקות. Decant התקשורת ולהשעות מחדש את כדורי שנשטפו ב-PBS ל-OD הסופי600 = 2. במידת הצורך, הוסף 10.1 μL של קרבוניל ציאניד 3-כלורלוההידרהידרט (CCCP, 10 מ”מ ב-PBS) ל 1 מ ל של חיידקים (ריכוז סופי 100 μM) ו-דגירה ב 37 ° c עבור 10 דקות.הערה: CCCP ס היא מעכבי משאבה מהאפלוקס. תוספת של CCCP ס תאפשר את בחינת ההשפעה של אפלוקס. צנטריפוגה את התרבויות ב 18,000 x g עבור 4 דקות ב 20 ° c ו decant התקשורת. הוסף 1 מ ל של פתרון אנטיביוטי פלורסנט (10-100 μM ב-PBS) אל הגלולה, ו דגירה ב 37 ° c עבור 30 דקות. צנטריפוגה את התרבויות ב 18,000 x g עבור 7 דקות ב 4 ° c ו decant התקשורת. . וחזור על שלב 4.9 חזור על שלב 4.10 כולל של 4x. במקרה הצורך, חיידקים lyse על ידי הוספת 180 μl של מאגר הליזה (20 מ”מ Tris-HCl, pH 8.0, ו 2 מ”מ נתרן edta) אז 70 μl של ליזוזים (72 mg/mL ב H2O). מודקון ב 37 ° c עבור 30 דקות, ואז להקפיא להפשיר 3x (78-c ° צ’ עבור 5 דקות, אז 34 ° c עבור 15 דקות). Sonicate את הדגימות 20 דקות, ואז חום 65 ° c עבור 30 דקות. צנטריפוגה את דגימות lysed (18,000 x g, 8 דקות), ואז לסנן דרך ממברנה 10 kda מסנן. שטוף את הפילטר 4x עם 100 μL של מים. להעביר את ליפוסט כדי שטוח למטה התחתון שחור 96 צלחת היטב ולמדוד את עוצמת הזריחה על קורא צלחת עם עירור ואורכי גל פליטה מתאים fluorophore (כלומר, DMACA: λex = 400 ננומטר, λem = 490 nm; NBD: λex = 475 ננומטר, λem = 545 nm).הערה: ראה איור 3 עבור דוגמאות של ניתוחים spectrophotometric של חיידקים באמצעות הניאון nbd התווית ציפרופלוקסאצין אנטיביוטיקה. לניתוח על ידי הזרימה cy, לנסות את הצמיחה ואת התנאים כתמים ניתן להשתמש (צעדים 4.1 – 4.17), עם שינויים רק בהכנה הסופית. הביאו את הנפח הכולל ל-1 מ ל של PBS. לקרוא דגימות על cytometer זרימה בקצב הזרימה של כ 60 μL/min, באמצעות הגברה לוגריתמי עבור רכישת נתונים (F1 עירור = 488 nm; פליטה = 525/20 nm). רשום סך של 10,000 אירועים, ולאחר מכן נתח את הנתונים באמצעות תוכנה מתאימה. מתווה את עוצמת הקרינה מ-F1 נגד מספר האירועים הספירות, מעריך את עוצמת הקרינה החציוני מפסגות ההיסטוגרמה לאחר שהחיידק היה מוכתם.הערה: ראה איור 4 לדוגמאות של ניתוח cy, בקטריה של חיידקים באמצעות אנטיביוטיקה בעלת תווית nbd. 5. הכנה לאנליזה מיקרוסקופית לגדול תת תרבויות כדי OD600 = 0.4, כמו עבור הערכת מיקרופון, ולאחר מכן לחלק לתוך 1 מ”ל ali, וצנטריפוגה ב 18,000 x g עבור 3 – 5 דקות. Decant ולמחוק מדיה, ואז להשעות מחדש את הגלולה חיידקים ב 500 μL של HBSS. צנטריפוגה ב 18,000 x g עבור 3 דקות, לאחר מכן decant ולמחוק מדיה. הכנת פתרונות לבדיקות אנטיביוטי ב HBSS בריכוזים של 1 – 100 μM. להשעות את החיידקים שנשטפו ב-500 μL של פתרון הבדיקה, ו-דגירה ב 37 ° צ’ עבור 30 דקות. חזור על שלב 5.3. עבור ניסוי מרובה תיוג, להשעות מחדש את הגלולה ב 500 μL של צבע חומצה גרעין בצבע אורתוגונאלי. עבור ירוק, השתמש Syto9 (5 μM ב HBSS); עבור כחול, השימוש Hoechst 33342 (20 μg/mL ב HBSS). דגירה ב RT עבור 15 – 30 דקות. חזור על שלב 5.3, ואז להשעות מחדש ב 500 μL של FM4-64FX (5 μg/mL ב HBSS) ו-דגירה ב-RT עבור 5 דקות. חזור על שלב 5.3, לאחר מכן השהה מחדש ב 500 μL של HBSS, וחזור על שלב 5.3 פעם נוספת. חזור על שלב 5.8, ולאחר מכן להשהות לבסוף שטף, חיידקים צבועים ב 15 μL של הרכבה בינונית (ראה טבלת חומרים). פיפטה הרכבה בינונית על שקופית מיקרוסקופ ולמעלה עם שובר מכסה ביצועים גבוהים, ולאחר מכן חותם קצוות עם לק ברור ציפורניים.הערה: ראה איור 5 לדוגמאות של תמונות מיקרוסקופית מיקרוסקופיה שצולמו באמצעות התווית nbd ואנטיביוטיקה בתלת מימוניים, ובאיור 6 עבור dmaca-מתויג oxazolidinone (לינזוכסה) אנטיביוטיקה.