Visualisierung der bakteriellen Resistenz mit fluoreszierenden Antibiotikasonden

1. Synthese von Alkyn-Fluorophoren Synthese von NBD-Alkyn (7-Nitro-N-(prop-2-yn-1-yl)benzo[c][1,2,5]oxadiazol-4-amin) 1.031 mg 4-Chlor-7-Nitro-Benzofuran (5,181 mmol) in 60 ml Tetrahydrofuran (THF) auflösen. Fügen Sie 1.857 mg CsCO3 (5.696 mmol), dann 0,39 ml Propargylamin (6,1 mmol). Erhitzen Sie die Reaktion auf 50 °C für 2 h, die von braun zu grün drehen, dann auf Raumtemperatur (RT) abkühlen. Filtern Sie die Reaktion mit einem Filterhilfsmittel (siehe Materialtabelle) und waschen Sie sie mit Ethylacetat (EA). Das Filtrat unter reduziertem Druck konzentrieren, dann den Rückstand in 150 ml EA auflösen und zu einem 500 ml Trenntrichter bewegen. Waschen Sie die EA-Lösung mit 100 ml mit Wasser bzw. Sole. Dann kombinieren Sie die wässrigen Phasen und waschen 2x mit 100 ml EA. Die kombinierten organischen Phasen über wasserfreies Magnesiumsulfat trocknen, dann filtern und unter reduziertem Druck konzentrieren. Reinigen Sie das Rohprodukt durch Blitzchromatographie auf Kieselgel (20–30% EA in Petrolether [PE]), Überprüfen der Reinheit durch Flüssigchromatographie Massenspektrometrie (LCMS, [M+H]+ = 219,1) und/oder Kernmagnetresonanz (NMR) Spektroskopie, chemische Verschiebungen wie folgt:1 H NMR (CD3OD, 600 MHz) bei 8,54 (d, J = 8,7 Hz, 1H), 6,35 (d, J = 8,4 Hz, 1H), 4,31 (dd, J = 5,7 Hz, J = 2,5 Hz, 2H), 2,43 (t, J = 2,5 Hz, 1H); 13 C NMR (CD3OD, 150 MHz) n 144,3, 143,7, 142,2, 135,8, 125,7, 100,0, 76,5, 74,2, 33,4.HINWEIS: Bei der Reinigung durch Kieselgelchromatographie bereiten Sie die Säule mit dem weniger polaren der aufgeführten Lösungsmittel vor. Rohe Verbindung kann entweder als konzentrierte Lösung geladen oder auf die Kieselsäure adsorbiert werden, wenn lösliche Ity es nicht zulässt. Nachdem die Verbindung an der Oberseite der Kieselsäure zugegeben wurde, laufen Sie durch 1–2 Säulenvolumen des gleichen Lösungsmittels, das für die Kieselsäurebenetzung verwendet wird. Beginnen Sie dann mit dem aufgeführten Lösungsmittelverhältnis, das durch mindestens 1 Spaltenvolumen jedes Lösungsmittels läuft, und stellen Sie sicher, dass sie keine großen Sprünge in der Lösungsmittelzusammensetzung machen. Sammeln Sie Fraktionen und überprüfen Sie Reinheit/Identität durch LCMS oder TLC (Dünnschichtchromatographie). Kombinieren Sie reine Fraktionen und konzentrieren Sie sich unter reduziertem Druck durch Rotationsverdampfung. Synthese von DMACA-Alkyn (2-(7-(dimethylamino)-2-oxo-2H-chromen-4-yl)-N-(prop-2-yn-1-yl)acetamide).5,02 g 3-(Dimethylamino)phenol (36,6 mmol) in 30 ml Ethanol auflösen, dann 6,7 ml Diethyl 1,3-Acetondicarboxylat (36 mmol) hinzufügen. Fügen Sie 10,5 g ZnCl2 (77,2 mmol) hinzu, dann reflux die rote Lösung für 42 h. Fügen Sie weitere 9,20 g ZnCl2 (67,6 mmol), dann Reflux für 8 h. Kühlen Sie die Reaktion und konzentrieren Sie sich unter reduziertem Druck. Dispergieren Sie den resultierenden roten Feststoff in 200 ml EA, filtern, dann in einen 500 ml Trenntrichter übertragen. Waschen Sie den EA mit je 200 ml Wasser und Salzlake, dann über wasserfreies Magnesiumsulfat trocknen. Filtern Sie die getrocknete organische Phase und konzentraten Sie unter reduziertem Druck. Reinigen Sie den roten Feststoff (ethyl 2-(7-(dimethylamino)-2-oxo-2 H-chromen-4-yl)acetat) durch Blitzchromatographie auf Kieselgel (0–100% EA in PE), Überprüfung der Reinheit durch LCMS ([M+H]+ = 275.1) und/oder NMR, chemische Verschiebungen wie folgt:1 H NMR (CDCl3, 600 MHz) bei 7,30 (d, J = 8,9 Hz, 1H), 6,52 (dd, J = 8,9 Hz, J = 2,6 Hz, 1H), 6,40 (d, J = 2,6 Hz, 1H), 5,87 (m, 1H), 2,96 (m, 8H), 2,25 (d, J = 1,2 Hz, 3H). 488 mg Ethyl 2-(7-(dimethylamino)-2-oxo-2 H-Chromen-4-yl-acetat (1,18 mmol) in 10 ml THF auflösen, dann eine Lösung von 157 mg LiOH H2O (3,74 mmol) in 15 ml Wasser. Rühren Sie die Reaktion bei RT für 3 h, dann bewegen Sie sich zu einem trennenden Trichter und verdünnen Sie mit einem zusätzlichen 50 ml Wasser. Das Reaktionsgemisch 2x mit 50 ml Diethylether (Et2O) waschen und dann die kombinierte organische Phase 2x mit 25 ml Wasser waschen. Nehmen Sie jeden gelben Niederschlag mit der organischen Schicht. Konzentrieren Sie die organische Phase unter reduziertem Druck mit einem Rotationsverdampfer. Die wässrige Phase mit konzentriertem HCl auf pH = 2 säuern und über Nacht auf 4 °C abkühlen lassen. Filtern Sie die versauerte wässrige Phase und fügen Sie den gelben Feststoff in die konzentrierte organische Phase ein.ANMERKUNG: Die 2-(7-(dimethylamino)-2-oxo-2 H-Chromen-4-yl)-Essigsäure kann ohne weitere Reinigung verwendet werden, kann aber durch LCMS ([M+H]+ = 247.1) und/oder NMR, chemische Verschiebungen wie folgt überprüft werden:1 H NMR (CDCl3, 600 MHz) J = 9,0 Hz, 1H), 6,62 (dd, J = 9,2 Hz, J = 2,8 Hz, 1H), 6,52 (d, J = 2,8 Hz, 1H), 5,98 (d, J = 0,9 Hz, 1H), 3,05 (s, 6H), 2,35 (d, J = 0,9 Hz, 2H); 13 C NMR (CDCl3, 150 MHz) bei 162,2, 155,7, 152,9, 152,8, 125,3, 109,7, 109,3, 109,1, 108,8, 98,3, 40,2, 18,5. 466 mg 2-(7-(dimethylamino)-2-oxo-2H-chromen-4-yl)essigsäure (1.89 mmol) in 7 ml trockenem N,N-Dimethylformamid (DMF) auflösen und unter stickstoffhaltiger Atmosphäre platzieren. 0,33 ml Propargylamin (5,1 mmol) in 7 ml trockenem DMF unter Stickstoff auflösen. 1,30 ml Di-Isopropylethylamin (DIPEA, 7,50 mmol) in die Farbstofflösung geben, dann 535 mg O-(1H-6-chlorobenzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium hexafluorophosphat (HCTU, 1.29 mmol). Rühren Sie die aktivierte Farbstofflösung für 15 min bei RT, dann fügen Sie die Aminlösung tropfenweise, und lassen Sie über Nacht rühren. Am nächsten Tag die Reaktion mit 35 ml Wasser verdünnen und dann unter reduziertem Druck konzentrat. Teilen Sie den resultierenden orangen entoreinen Festkörper zwischen EA und Sole (jeweils 100 ml) in einem 250 ml Trenntrichter auf. Trennen Sie die Schichten (führen Sie die beiden Schichten in verschiedene Kolben), und waschen Sie die wässrige Phase mit 100 ml EA. Konzentrieren Sie die kombinierten organischen Phasen unter reduziertem Druck, und lösen Sie dann den Orangenfestin in 3 ml 1:1 Acetonitril (ACN)/Wasser (v/v) wieder auf. Reinigen Sie das Rohprodukt durch Injektion in ein Mitteldruck-Flüssigkeitschromatographiesystem (MPLC) der Umkehrphase, das mit einer C18-Patronensäule (Lösungsmittel A: Wasser, Lösungsmittel B: ACN) ausgestattet ist. Überprüfen Sie die Fraktionen auf Reinheit durch LCMS ([M+H]+ = 284.1, NMR-Chemische Verschiebungen unten angegeben), dann kombinieren und lyophilisieren entsprechende Fraktionen, um 2-(7-(dimethylamino)-2-oxo-2H-chromen-4-yl)-N-(prop-2-yn-1-yl)acetami, NMR chemische Verschiebungen wie folgt zu geben:1 H NMR (600 MHz, DMSO-d6) bei 8,65 (t, J = 5,4 Hz, 1H), 7,52 (d, J = 9,0 Hz, 1H), 6,72 (dd, J = 9,1, 2,6 Hz, 1H), 6,55 (d, J = 2,6 Hz, 1H), 6,00 (s, 1H), 3,88–3,87 (m, 2H), 3,62 (s, 2H), 3,13 (t, J = 2,5 Hz, 1H), 3,01 (s, 6H); 13 C NMR (125 MHz, DMSO-d6) n 167,7, 160,7, 155,4, 152,9, 151,0, 126,0, 109,4, 109,1, 108,1, 97,5, 80,9, 73,3, 39,7, 38,4, 28,2. 2. Synthese fluoreszierender Antibiotika Bereiten Sie ein Azid-Derivat eines Antibiotikums wie zuvor beschrieben14,15,16.HINWEIS: Das Verfahren ist spezifisch für jedes Antibiotikum und erfordert eine sorgfältige Untersuchung der Strukturaktivitätsbeziehung (SAR) des Übergeordneten Moleküls, um sicherzustellen, dass das funktionalisierte Antibiotikum eine Aktivität behält, die mit dem Elternteil vergleichbar ist. (z.B. Ciprofloxacin16, Linezolid14und Trimethoprim15). Siehe Abbildung 1 für Beispiele für veröffentlichte fluoreszierende Antibiotika und das allgemeine Syntheseschema. Klicken Sie auf Reaktionsprozedur AHINWEIS: Bei den meisten Antibiotika folgen Sie dem hier beschriebenen Verfahren für kupferkatalysiertes Huisgen [2+3] Cycloaddition von Azid (Schritt 2.1) und fluoreszierendem Alkyn (in Schritt 1). Das Azid-Antibiotikum in einen runden Bodenkolben geben und tert-butanol (tBuOH) und Wasser (1:1 v/v, je 25 ml pro mmol-Azid) hinzufügen. Fügen Sie das in Schritt 1.1 (3 eq.) hergestellte Fluorophor-Alkyn hinzu und erhitzen Sie die Reaktion auf 50 °C. Dann Kupfersulfat (100 mM in Wasser, 0,6 eq.) zur Reaktion hinzufügen, gefolgt von Ascorbinsäure (500 mM in Wasser, 2,4 Eq.). Rühren Sie die Reaktion bei 50 °C für 1 h oder bis zur Analyse durch LCMS unter Angabe der Reaktionsvervollständigung (vollständiger Verbrauch von Beginnenazid). Kühlen Sie die Reaktion ab und reinigen Sie sie je nach Bedarf für das Antibiotikumgerüst und führen Sie die Reinigung entweder durch Schritt 2.3 oder 2.4 fort.HINWEIS: Je nach Polarität und Stabilität des Gerüstes sind verschiedene Reinigungsmethoden möglich. Klicken Sie auf Reaktionsprozedur BHINWEIS: Befolgen Sie dieses Verfahren für Peptid-basierte Antibiotika, um stärkere Reaktionsbedingungen zu bieten (unveröffentlichte Arbeit, Phetsang, 2019). Das Peptid-Azid-Antibiotikum in einen runden Bodenkolben geben und genügend DMF (750 ml/mmol-Azid) hinzufügen, um sich aufzulösen. Fügen Sie das in Schritt 1 (5 eq.) hergestellte Fluorophor-Alkyn hinzu und erhitzen Sie die Reaktion auf 50 °C für 1 h. Kupfer (I) Iodid (20 eq.), dann DIPEA (120 eq.), dann Essigsäure (240 eq.). Rühren Sie die Reaktion bei 50 °C für 1 h, oder bis die Analyse durch LCMS die Reaktionsvervollständigung anzeigt (d. h. den vollständigen Verbrauch von Startazid). Kühlen Sie die Reaktion ab und gehen Sie zur Reinigung durch Methode 1 vor (siehe Schritt 2.3). Reinigungsverfahren 1 (verwendet für Ciprofloxacin, Trimethoprim und Linezolid) Injizieren Sie die gekühlte Klickreaktion direkt in eine MPLC C18-Patronensäule. Integrieren Sie eine lange Waschphase (ca. 10 min) zu Beginn des Laufs (100% Lösungsmittel A), dann führen Sie einen Gradienten bis zu 100% Lösungsmittel B, gefolgt von einer Rückkehr zu Lösungsmittel A.HINWEIS: Lösungsmittel A kann aus Wasser, 0,05–0,1% Ameisensäure (FA) in Wasser, 0,05–0,1% Trifluoressigsäure (TFA) in Wasser gewählt werden, abhängig von Löslichkeit, Stabilität und der besten Auflösung von Spitzen. Lösungsmittel B kann aus Acetonitril (ACN), 0,05–0,1% FA in ACN, 0,05–0,1% TFA in ACN gewählt werden, um lösungsmittel A zu entsprechen. Wenn sich die Elution als schwierig erweist, kann Methanol anstelle von ACN verwendet werden. Sammeln und kombinieren Sie geeignete Fraktionen, wie durch LCMS und Farbe angegeben (korrekte Masse gesehen, Singular Peak), dann Lyophilisieren, um das (halb)reine fluoreszierende Antibiotikum zu geben. Reinigen Sie das Produkt bei Bedarf weiter. Bewerten Sie die Reinheit durch NMR und/oder LCMS und Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie (HPLC) unter Verwendung einer für das Gerüst geeigneten Säule und Methode. Reinigungsmethode 2HINWEIS: Wenn die Löslichkeit dies zulässt, kann die Vorreinigung durch die wässrige Aufarbeitung durchgeführt werden (verwendet für Makroliden, unveröffentlichte Arbeit, Stein 2019). Die gekühlte Klickreaktion mit Wasser und Et2O (1:1 v/v, ca. 10-fache Verdünnung aus dem anfänglichen Reaktionsvolumen) verdünnen und auf einen entsprechend großen Trenntrichter übertragen. Die Schichten trennen und die wässrige Phase zweimal mit Et2O waschen. Waschen Sie die kombinierten organischen Phasen 2x mit Wasser (gleiches Volumen mit organischer Phase), dann trocknen Sie über Na2SO4. Filtern Sie die getrocknete organische Phase und konzentraten Sie unter reduziertem Druck. Reinigen Sie das Rohprodukt mit MPLC und/oder HPLC, wie in Schritt 2.4.4 beschrieben.HINWEIS: Siehe Abbildung 2 für Beispiele für unvollständige, vollständige und gereinigte Klickreaktion LCMS-Ablaufverfolgungen. Typische gereinigte Erträge für die Antibiotikum-Fluorophor-Klickreaktionen liegen zwischen 30 und 80%.VORSICHT: Die meisten Chemikalien, die in diesen Synthesen verwendet werden, weisen spezifische Sicherheitsrisiken auf. Es ist jederzeit Vorsicht geboten, auch bei der Verwendung persönlicher Schutzausrüstung. Et2O, tBuOH, FA, Essigsäure, PE, EA, THF, ACN, DMF, EtOH, DIPEA, Propargylamin und HCTU sind alle entzündlich; Kontakt mit Wärme- oder Funkenquellen zu vermeiden. THF, Propargylamin, DIPEA, tBuOH, FA, DMF und PE sind alle toxisch; Exposition zu vermeiden. Propargylamin, CsCO3, ZnCl2, LiOH-H2O, DIPEA, CuI, FA, Essigsäure und HCl sind alle korrosiv; Kontakt vermeiden und sich des Oberflächenkontakts bewusst sein. ZnCl2, CuSO4, CuI und PE stellen Umweltgefahren dar; auf entsorgungsbedingungen achten. THF kann explosive Peroxide bilden; mit den Lagerbedingungen aufpassen. Organische Aziden sind explosiv; besonders bei der Großserienfertigung aufpassen. 3. Bewertung der antimikrobiellen Aktivität HINWEIS: Alle Arbeiten mit Bakterien sollten unter sterilen Bedingungen durchgeführt werden, um eine Kontamination des Assays oder des Labors zu vermeiden. Alle Medien sollten vor dem Gebrauch autoklaviert werden, und Kunststoffe und Geräte wie Pipetten müssen steril gehalten werden. Es wird empfohlen, die Arbeit in einer Biocontainment-Haube (Typ 2) zu erledigen. Streifen GlycerinBestände von Bakterienstämmen geeignet für das Antibiotikum Gerüst auf LysogeneBrühe Agar (LB, nach Herstelleranweisungen zubereitet), und wachsen über Nacht bei 37 °C.HINWEIS: Die Wahl der Bakterien, um antibakterielle Aktivität zu testen, muss auf der Grundlage des verwendeten Antibiotikumgerüsts getroffen werden. Aus den Arten, von denen bekannt ist, dass sie anfällig für das Antibiotikum sind, sollte ein repräsentativer Bereich von 5–10 Bakterien ausgewählt werden, wobei die logistischen Fähigkeiten des Labors berücksichtigt werden sollten. Wenn möglich, sollten auch resistente Bakterien getestet werden. Das unten angegebene Protokoll wird auf die meisten Bakterien funktionieren, aber überprüfen, ob besondere Bedingungen erforderlich sind (z.B. CO2, spezielle Medien) und änderungen bei Bedarf. Bakterien erfolgreich mit diesen Bedingungen astestiert gehören Staphylokokken, Streptococci, Bacilli, E. coli, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, und Enterococcus faecium. Wählen Sie eine einzelne Kolonie von der Platte, und Kultur über Nacht in 5 ml kationangepasstMueller-Hinton Broth (CAMHB, vorbereitet nach Herstelleranleitung) bei 37 °C. Verdünnen Sie die Nachtkulturen in CAMHB um das 40-fache und wachsen Sie bis zu einer Mittleren-Log-Phase, optische Dichte bei 600 nm (OD600) = 0,4–0,8, Volumen 5 ml). Bereiten Sie Lagerlösungen jedes fluoreszierenden Antibiotikums bei 1,28 mg/ml in sterilem Wasser und Pipette 10 l Antibiotikum auf die erste Säule einer 96-Well-Platte vor. Fügen Sie der ersten Spalte 90 L VON CAMHB und allen anderen Brunnen 50 L hinzu. Führen Sie dann eine serielle 2-fache Verdünnung über die Platte aus. Mischen Sie die Mid-Log-Phasenkulturen gründlich, dann auf 106 Koloniebildeinheiten (CFU)/ml und fügen Sie 50 l zu allen Brunnen hinzu, um eine Endkonzentration von 5 x 105 KBE/ml zu erreichen.Kulturvolumen (mL) = (Medienvolumen in mL)/(OD600 x 1.000)z.B. für eine OD600 = 0,5-Kultur bei einem gewünschten Medienvolumen von 12 ml (12/(0,5 x 1.000) = 0,024 ml Kultur auf 12 ml Medien Die Platten mit Deckeln bedecken und bei 37 °C für 18 bis 24 H ohne Schütteln bebrüten. Überprüfen Sie die Platten visuell, wobei das MIC die niedrigste Konzentration gut und ohne sichtbares Wachstum ist.HINWEIS: Siehe Tabelle 1 für einige Beispiele für aktive und inaktive fluoreszierende Antibiotika. 4. Analyse der Sondenakkumulation durch Spektrophotometrie und Durchflusszytometrie HINWEIS: Diese Zentrifugationszeiten wurden für E. colioptimiert, so dass leichte Veränderungen für andere Arten erforderlich sein können. Repräsentative Daten für die Sondenakkumulation werden für die NBD-markierte Ciprofloxacinsonde gemeldet. Streifen Glycerin-Bestände der Bakterienstämme auf LB-Agar und wachsen über Nacht bei 37 °C. Wählen Sie eine einzelne Kolonie aus der Platte und Kultur über Nacht in LB bei 37 °C. Verdünnen Sie die Nachtkulturen in den Medien um das 50-fache und wachsen Sie bis zur mittleren Logphase (OD600 = 0,4–0,8). Zentrifugieren Sie die Kulturen bei 1.470 x g für 25 min und dekantieren Sie die Medien. Die Bakterien in 1 ml Phosphat-gepufferter Saline (PBS) aussetzen, dann 15 min zentrifugieren bei 1.470 x g. Dekantieren Sie die Medien und setzen Sie die gewaschenen Pellets in PBS auf eine endgültige OD600 = 2 aus. Auf Wunsch 10,1 l Carbonylcyanid 3-Chlorphenylhydrazone (CCCP, 10 mM in PBS) auf 1 ml Bakterien (Endkonzentration 100 m) geben und 10 min bei 37 °C inkubieren.HINWEIS: CCCP ist ein Efflux-Pumpeninhibitor. Die Hinzufügung von CCCP wird die Untersuchung der Auswirkungen von Efflux ermöglichen. Zentrifugieren Sie die Kulturen bei 18.000 x g für 4 min bei 20 °C und dekantieren Sie die Medien. 1 ml fluoreszierende Antibiotikalösung (10–100 M in PBS) in das Pellet geben und 30 min bei 37 °C inkubieren. Zentrifugieren Sie die Kulturen bei 18.000 x g für 7 min bei 4 °C und dekantieren Sie die Medien. Setzen Sie die Bakterien in 1 ml kaltem PBS aus, und wiederholen Sie Schritt 4.9. Wiederholen Sie Schritt 4.10 insgesamt 4x. Auf Wunsch Lysebakterien durch Zugabe von 180 l Lysepuffer (20 mM Tris-HCl, pH 8,0 und 2 mM Natrium EDTA) dann 70 l Lysozym (72 mg/ml in H2O). Bei 37 °C 30 min inkubieren, dann 3x einfrieren (ca. 78 °C für 5 min, dann 34 °C für 15 min). Beschallen Sie die Proben für 20 min, dann erhitzen Sie auf 65 °C für 30 min. Zentrifugieren Sie die lysierten Proben (18.000 x g, 8 min), dann filtern Sie durch eine 10 kDa Filtermembran. Waschen Sie den Filter 4x mit 100 l Wasser. Übertragen Sie das Lysat auf eine flache schwarze 96-Wellplatte und messen Sie die Fluoreszenzintensität auf einem Plattenleser mit anregungs- und Emissionswellenlängen, die für das Fluorophor geeignet sind (d. h. DMACA:ex = 400 nm,em = 490 nm; NBD:- ex = 475 nm, -em = 545 nm).ANMERKUNG: Siehe Abbildung 3 für Beispiele für spektrophotometrische Analysen von Bakterien mit dem fluoreszierenden NBD-gekennzeichneten Ciprofloxacin-Antibiotikum. Für die Analyse durch Durchflusszytometrie können die gleichen Wachstums- und Färbebedingungen verwendet werden (Schritte 4.1–4.17), wobei Änderungen ausschließlich in der endgültigen Vorbereitung vorgenommen werden. Bringen Sie das Gesamtvolumen auf 1 ml PBS. Lesen Sie Proben auf einem Durchflusszytometer mit einer Durchflussrate von ca. 60 l/min, mit logarithmischer Amplifikation für die Datenerfassung (F1-Anregung = 488 nm; Emission = 525/20 nm). Zeichnen Sie insgesamt 10.000 Ereignisse auf und analysieren Sie die Daten dann mit entsprechender Software. Zeichnen Sie die Fluoreszenzintensität von F1 gegen die Anzahl der Ereignisse und schätzen Sie die mittlere Fluoreszenzintensität von den Histogrammspitzen, nachdem die Bakterien gefärbt wurden.HINWEIS: Siehe Abbildung 4 für Beispiele für Durchflusszytometrieanalysen von Bakterien mit dem NBD-gekennzeichneten Ciprofloxacin-Antibiotikum. 5. Vorbereitung für die mikroskopische Analyse Wachsen Sie Subkulturen zu OD600 = 0,4, wie bei der MIC-Bewertung, dann teilen Sie sich in 1 ml Aliquots und Zentrifuge bei 18.000 x g für 3-5 min. Dekantieren und entsorgen Sie Medien, und setzen Sie dann das bakterielle Pellet in 500 l HBSS wieder aus. Zentrifugieren Bei 18.000 x g für 3 min, dann Dekant und entsorgen Medien. Bereiten Sie Lösungen von Antibiotika-Sonden in HBSS in Konzentrationen von 1–100 M vor. Setzen Sie die gewaschenen Bakterien in 500 l der Sondenlösung wieder auf und brüten Sie 30 min bei 37 °C. Wiederholen Sie Schritt 5.3. Für ein Mehrfach-Etikettierungsexperiment das Pellet in 500 l eines orthogonal gefärbten Nukleinsäurefarbstoffs wieder aufsetzen. Verwenden Sie für Grün Syto9 (5 m in HBSS); für blau verwenden Sie Hoechst 33342 (20 g/ml in HBSS). Inkubieren bei RT für 15-30 min. Wiederholen Sie Schritt 5.3, dann in 500 l FM4-64FX (5 g/ml in HBSS) wieder aufsetzen und bei RT für 5 min inkubieren. Wiederholen Sie Schritt 5.3, setzen Sie dann in 500 l HBSS erneut ab, und wiederholen Sie Schritt 5.3 erneut. Wiederholen Sie Schritt 5.8, und setzen Sie schließlich die gewaschenen, gefärbten Bakterien in 15 l Montagemedium aus (siehe Tabelle der Materialien). Pipette Montagemedium auf einem Mikroskop-Schlitten und oben mit einem hochleistungsstarken Abdeckung supg, dann versiegeln Kanten mit klarem Nagellack.ANMERKUNG: Siehe Abbildung 5 für Beispiele für konfokale Mikroskopiebilder, die mit NBD-gekennzeichneten Ciprofloxacin- und Trimethoprim-Antibiotika aufgenommen wurden, sowie Abbildung 6 für Dasazolidinon(Linezolid) mit DMACA-Kennzeichnung.