Visualisatie van bacteriële resistentie met behulp van fluorescerende antibiotica sondes

1. Synthese van Alkyne-fluorophores Synthese van NBD-alkyne (7-nitro-N-(prop-2-yn-1-yl)benzo[c][1,2,5]oxadiazol-4-amine) Los 1.031 mg 4-chloor-7-nitro-benzofuran (5.181 mmol) op in 60 mL tetrahydrofuran (THF). Voeg 1.857 mg CsCO3 (5.696 mmol) toe, dan 0,39 mL propargylamine (6,1 mmol). Verwarm de reactie tot 50 °C gedurende 2 uur, die van bruin naar groen verandert en vervolgens afkoelen tot kamertemperatuur (RT). Filtreer de reactie met behulp van een filterhulpmiddel (zie Tabel met materialen)en was met ethylacetaat (EA). Concentraat het filtraat onder verminderde druk, los het residu op in 150 mL EA en ga naar een scheidingstrechter van 500 mL. Was de EA-oplossing met respectievelijk 100 mL met water en pekel. Combineer vervolgens de waterige fasen en was 2x met 100 mL EA. Droog de gecombineerde organische fasen over watervrij magnesiumsulfaat en filtreer en concentreer u onder verminderde druk. Zuiver het ruwe product door flitschromatografie op silicagel (20-30% EA in petroleumether [PE]), het controleren van zuiverheid door vloeibare chromatografiemassaspectrometrie (LCMS, [M+H]+ = 219.1) en/of nucleaire magnetische resonantie (NMR) spectroscopie, chemische verschuivingen als volgt:1. H NMR (CD3OD, 600 MHz) δ 8,54 (d, J = 8,7 Hz, 1H), 6,35 (d, J = 8,4 Hz, 1H), 4,31 (dd, J = 5,7 Hz, J = 2,5 Hz, 2H), 2,43 (t, J = 2,5 Hz, 1H); 13. C NMR (CD3OD, 150 MHz) δ 144,3, 143,7, 142.2, 135,8, 125,7, 100,0, 76,5, 74,2, 33,4.OPMERKING: Bereid bij het uitvoeren van zuivering door silicagelchromatografie de kolom voor met behulp van de minder polaire oplosmiddelen die worden vermeld. Ruwe verbinding kan ofwel worden geladen als een geconcentreerde oplossing of adsorbeerde op het silica als oplosbaarheid het niet toelaat. Nadat de verbinding is toegevoegd aan de bovenkant van het silica, loopt u door 1-2 kolomvolumes van hetzelfde oplosmiddel dat wordt gebruikt voor silicabevochtiging. Begin dan met de vermelde oplosmiddelverhouding, die door minstens 1 kolomvolume van elk oplosmiddel loopt, en zorg ervoor om geen grote sprongen in oplosmiddelsamenstelling te maken. Verzamel breuken en controleer zuiverheid/identiteit door LCMS of TLC (dunne laagchromatografie). Combineer pure fracties en concentraat onder verminderde druk door roterende verdamping. Synthese van DMACA-alkyne (2-(7-(dimethylamino)-2-oxo-2H-chromen-4-yl)-N-(prop-2-yn-1-yl)paracetamol).Los 5,02 g 3-(dimethylamino)fenol (36,6 mmol) op in 30 mL ethanol en voeg vervolgens 6,7 mL diethyl 1,3-acetonedicarboxylaat (36 mmol) toe. Voeg 10,5 g ZnCl2 (77,2 mmol) toe, en reflux vervolgens de rode oplossing voor 42 uur. Voeg een extra 9,20 g ZnCl2 (67,6 mmol), dan reflux voor 8 uur. Koel de reactie af en concentreer u onder verminderde druk. Verspreid de resulterende rode vaste stof in 200 mL EA, filter, dan overbrengen naar een 500 mL scheiden trechter. Was de EA met 200 mL elk van water en pekel, dan droog over watervrij magnesiumsulfaat. Filtreer de gedroogde organische fase en concentraat onder verminderde druk. Zuiver de rode stof (ethyl 2-(7-(dimethylamino)-2-oxo-2H-chromen-4-yl)acetaat) door flitschromatografie op silicagel (0-100% EA in PE), waarbij de zuiverheid door LCMS ([M+H]+ = 275,1) en/of NMR, chemische verschuivingen als volgt worden gecontroleerd:1. H NMR (CDCl3, 600 MHz) δ 7,30 (d, J = 8,9 Hz, 1H), 6,52 (dd, J = 8,9 Hz, J = 2,6 Hz, 1H), 6,40 (d, J = 2,6 Hz, 1H), 5,87 (m, 1H), 2,96 (m, 8H), 2,25 (d, J = 1,2 Hz, 3H). Los 488 mg ethyl 2-(7-(dimethylamino)-2-oxo-2H-chromen-4-yl)acetaat (1,18 mmol) op in 10 mL THF en voeg vervolgens een oplossing van 157 mg LiOH toe· H2O (3,74 mmol) in 15 mL water. Roer de reactie bij RT gedurende 3 uur, ga dan naar een scheidingstrechter en verdun met nog eens 50 mL water. Was het reactiemengsel 2x met 50 mL diethylether (Et2O) en was vervolgens de gecombineerde organische fase 2x met 25 mL water. Neem elke gele neerslag met de organische laag. Concentraat de organische fase onder verminderde druk met behulp van een roterende verdamper. Verzur de waterige fase tot pH = 2 met geconcentreerde HCl en koel ‘s nachts af tot 4 °C. Filtreer de verzuurde waterige fase en voeg de gele vaste stof toe aan de geconcentreerde organische fase.OPMERKING: Het 2-(7-(dimethylamino)-2-oxo-2H-chroom-4-yl)azijnzuur kan zonder verdere zuivering worden gebruikt, maar dit kan worden gecontroleerd door LCMS ([M+H]+ = 247.1) en/of NMR, chemische verschuivingen als volgt:1. H NMR (CDCl3, 600 MHz) δ 7.41 (d, J = 9,0 Hz, 1H), 6,62 (dd, J = 9,2 Hz, J = 2,8 Hz, 1H), 6,52 (d, J = 2,8 Hz, 1H), 5,98 (d, J = 0,9 Hz, 1H), 3,05 (s, 6H), 2,35 (d, J = 0,9 Hz, 2H); 13. C NMR (CDCl3, 150 MHz) δ 162,2, 155,7, 152,9, 152,8, 125,3, 109,7, 109,3, 109,1, 108,8, 98,3, 40,2, 18,5. Los 466 mg 2-(7-(dimethylamino)-2-oxo-2H-chroom-4-yl)azijnzuur (1,89 mmol) op in 7 mL droge N, N-dimethylformamide (DMF) en plaats onder een atmosfeer van stikstof. Los 0,33 mL propargylamine (5,1 mmol) op in 7 mL droge DMF onder stikstof. Voeg 1,30 mL di-isopropylethylamine (DIPEA, 7,50 mmol) toe aan de kleurstofoplossing, vervolgens 535 mg O-(1H-6-chlorobenzotriazole-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium hexafluorofosfaat (HCTU, 1,29 mmol). Roer de geactiveerde kleurstof oplossing voor 15 min op RT, voeg dan de amine oplossing dropwise, en laat om ‘s nachts te roeren. De volgende dag, verdun de reactie met 35 mL water dan concentreren onder verminderde druk. Deling de resulterende oranje vaste stof tussen EA en pekel (100 mL per stuk) in een 250 mL scheidingstrechter. Scheid de lagen (voer de twee lagen in verschillende kolven) en was de waterige fase met 100 mL EA. Concentraat de gecombineerde organische fasen onder verminderde druk en los vervolgens de oranje vaste stof op in 3 mL van 1:1 acetonitril (ACN)/water (v/v). Zuiver het ruwe product door te injecteren op een omgekeerde fase medium pressure liquid chromatografie (MPLC) systeem uitgerust met een C18 cartridge kolom (oplosmiddel A: water, oplosmiddel B: ACN). Controleer de onderstaande fracties op zuiverheid door LCMS ([M+H]+ = 284,1, NMR chemische verschuivingen hieronder), combineren en lyophiliseren passende fracties om 2-(7-(dimethylamino)-2-oxo-2H-chromen-4-yl)-N-(prop-2-yn-1-yl)acetamide, NMR chemische verschuivingen als volgt te geven:1. H NMR (600 MHz, DMSO-d6) δ 8,65 (t, J = 5,4Hz, 1H), 7,52 (d, J = 9,0Hz, 1H), 6,72 (dd, J = 9,1, 2,6 Hz, 1H), 6,55 (d, J = 2,6 Hz, 1H), 6,00 (s, 1H), 3,88–3,87 (m, 2H), 3,62 (s, 2H), 3,13 (t, J = 2,5 Hz, 1H), 3,01 (s, 6H); 13. C NMR (125 MHz, DMSO-d6) δ 167,7, 160,7, 155,4, 152,9, 151.0, 126.0, 109.4, 109.1, 108.1, 97.5, 80.9, 73.3, 39.7, 38.4, 28.2. 2. Synthese van fluorescerende antibiotica Bereid een azide-derivaat van een antibioticum zoals eerder beschreven14,15,16.OPMERKING: De procedure is specifiek voor elk antibioticum en vereist een zorgvuldig onderzoek van de structuur activiteit relatie (SAR) van de ouder molecuul om ervoor te zorgen dat de gefunctionaliseerde antibioticum behoudt activiteit vergelijkbaar met de ouder. (bijvoorbeeld ciprofloxacine16, linezolid14en trimethoprim15). Zie figuur 1 voor voorbeelden van gepubliceerde fluorescerende antibiotica en het algemene syntheseschema. Klikreactieprocedure ALET OP: Voor de meeste antibiotica, volg de procedure hier beschreven voor koper gekatalyseerd Huisgen [2 +3] cycloaddition van azide (stap 2.1) en fluorescerende alkyne (bereid in stap 1). Plaats het azide-antibioticum in een ronde bodemkolf en voeg tert-butanol(tBuOH) en water (1:1 v/v, 25 mL per mmol azide) toe. Voeg de fluorophore-alkyne bereid in stap 1.1 (3 eq.) toe en verwarm de reactie op 50 °C. Voeg vervolgens kopersulfaat (100 mM in water, 0,6 eq.) toe aan de reactie, gevolgd door ascorbinezuur (500 mM in water, 2,4 eq.). Roer de reactie bij 50 °C gedurende 1 uur, of tot analyse door LCMS op indicatie van de voltooiing van de reactie (volledige consumptie van beginnende azide). Koel de reactie en zuiveren indien nodig voor het antibioticum steiger en ga voor zuivering, hetzij door stap 2.3 of 2.4.OPMERKING: Verschillende zuiveringsmethoden zijn mogelijk, afhankelijk van de polariteit en stabiliteit van het schavot. Klik reactie procedure BOPMERKING: Volg deze procedure voor peptide-gebaseerde antibiotica, om sterkere reactievoorwaarden te bieden (ongepubliceerd werk, Phetsang, 2019). Plaats het peptide azide-antibioticum in een ronde bodemkolf en voeg voldoende DMF (750 mL/mmol azide) toe om op te lossen. Voeg de fluorophore-alkyne bereid in stap 1 (5 eq.) toe en verwarm de reactie op 50 °C gedurende 1 uur. Voeg koper (I) jodide (20 eq.), dan DIPEA (120 eq.), dan azijnzuur (240 eq.). Roer de reactie bij 50 °C gedurende 1 uur, of totdat de analyse door LCMS reactievoltooiing aangeeft (d.w.z. volledig verbruik van startende azide). Koel de reactie af en ga verder voor zuivering volgens methode 1 (zie stap 2.3). Zuiveringsmethode 1 (gebruikt voor ciprofloxacine, trimethoprim en linezolid) Injecteer de gekoelde klikreactie direct op een MPLC C18 cartridgekolom. Neem aan het begin van de run een lange wasfase (ongeveer 10 min) op (100% oplosmiddel A), voer vervolgens een helling tot 100% oplosmiddel B uit, gevolgd door een terugkeer naar oplosmiddel A.OPMERKING: Oplosmiddel A kan worden gekozen uit water, 0,05-0,1% mierenzuur (FA) in water, 0,05-0,1% trifluoroacetisch zuur (TFA) in water, afhankelijk van oplosbaarheid, stabiliteit en de beste resolutie van pieken. Oplosmiddel B kan worden gekozen uit acetonitril (ACN), 0,05–0,1% FA in ACN, 0,05–0,1% TFA in ACN, om oplosmiddel A te evenaren. Indien de elutie moeilijk blijkt, mag methanol worden gebruikt in plaats van ACN. Verzamel en combineer de juiste fracties, zoals aangegeven door LCMS en kleur (juiste massa gezien, enkelvoud piek), dan lyofileren om de (semi)pure tl antibioticum te geven. Verder zuiveren van het product indien nodig. Beoordeel de zuiverheid door NMR en/of LCMS en hogedrukvloeistofchromatografie (HPLC), met behulp van een kolom en methode die geschikt zijn voor het schavot. Zuiveringsmethode 2OPMERKING: Als de oplosbaarheid het toelaat, kan de voorzuivering worden uitgevoerd door de waterige workup (gebruikt voor macroliden, ongepubliceerd werk, Steen 2019). Verdun de afgekoelde klikreactie met water en Et2O (1:1 v/v, ongeveer 10-voudige verdunning van het eerste reactievolume), overbrengen d.m.v. een geschikte scheidingstrechter. Scheid de lagen en was de waterige fase twee maal met Et2O. Was de gecombineerde organische fasen 2x met water (gelijk volume met organische fase), droog dan over Na2SO4. Filtreer de gedroogde organische fase en concentraat onder verminderde druk. Zuiver het ruwe product door MPLC en/of HPLC zoals beschreven in stap 2.4.4.OPMERKING: Zie figuur 2 voor voorbeelden van onvolledige, complete en gezuiverde klikreactie LCMS-sporen. Typische gezuiverde opbrengsten voor de antibiotica-fluorophore klik reacties variëren van 30-80%.LET OP: De meeste chemicaliën die in deze syntheses worden gebruikt, bezitten specifieke veiligheidsrisico’s. Voorzichtigheid moet te allen tijde worden ingenomen, inclusief het gebruik van persoonlijke beschermingsmiddelen. Et2O, tBuOH, FA, azijnzuur, PE, EA, THF, ACN, DMF, EtOH, DIPEA, propargylamine en HCTU zijn allemaal ontvlambaar; contact met warmte of vonkbronnen te voorkomen. THF, propargylamine, DIPEA, tBuOH, FA, DMF en PE zijn allemaal giftig; blootstelling te voorkomen. Propargylamine, CsCO3, ZnCl2, LiOH-H2O, DIPEA, CuI, FA, azijnzuur en HCl zijn allemaal corrosief; contact te vermijden en zich bewust te zijn van oppervlaktecontact. ZnCl2, CuSO4, CuI en PE brengen milieurisico’s met zich mee; rekening houden met de verwijderingsvoorwaarden. THF kan explosieve peroxiden vormen; zorg voor de opslagvoorwaarden. Organische azides zijn explosief; zorg vooral bij grootschalige productie. 3. Evaluatie van antimicrobiële activiteit OPMERKING: Alle werkzaamheden waarbij bacteriën betrokken zijn, moeten onder steriele omstandigheden worden uitgevoerd om besmetting van de test of het laboratorium te voorkomen. Alle media moeten voor gebruik automatisch zijn afgegaan en plasticware en apparatuur zoals pipetten moeten steriel worden gehouden. Het wordt aanbevolen om te werken in een biocontainment kap (type 2). Streep glycerol voorraden van bacteriële stammen die geschikt zijn voor het antibioticum steiger op lysogeny bouillon agar (LB, bereid volgens de instructies van de fabrikant), en groeien ‘s nachts op 37 °C.OPMERKING: De keuze van bacteriën om antibacteriële activiteit te testen moet worden gemaakt op basis van het antibioticum steiger wordt gebruikt. Een representatief bereik van 5-10 bacteriën moet worden gekozen uit de soorten waarvan bekend is dat ze gevoelig zijn voor het antibioticum, met aandacht voor de logistieke mogelijkheden van het lab. Indien mogelijk moeten ook resistente bacteriën worden getest. Het onderstaande protocol werkt op de meeste bacteriën, maar controleer of er speciale voorwaarden nodig zijn (bijvoorbeeld CO2,speciale media) en breng indien nodig wijzigingen aan. Bacteriën met succes geassuieerd met behulp van deze voorwaarden omvatten Staphylococci, Streptococci, Bacilli, E. coli, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, en Enterococcus faecium. Kies een enkele kolonie van de plaat, en cultuur ‘s nachts in 5 mL van kation aangepast Mueller-Hinton Bouillon (CAMHB, bereid volgens de instructies van de fabrikant) op 37 °C. Verdun de nachtelijke culturen ~40-voudig in CAMHB en groei tot een mid-log fase, optische dichtheid op 600 nm (OD600) = 0,4-0,8, volume 5 mL). Bereid voorraadoplossingen van elk fluorescerend antibioticum op 1,28 mg/mL in steriel water en pipet 10 μL antibioticum naar de eerste kolom van een 96-putplaat. Voeg 90 μL CAMHB toe aan de eerste kolom en 50 μL aan alle andere putten. Voer vervolgens een seriële 2-voudige verdunning over de plaat uit. Meng grondig, verdun vervolgens de mid-log fase culturen tot ~ 106 kolonie vormen eenheden (CFU)/mL en voeg 50 μL aan alle putten, om een definitieve concentratie van ~ 5 x 105 CFU/mL.cultuurvolume (mL) = (mediavolume in mL)/(OD600 x 1.000)b.v., voor een OD600 = 0.5 cultuur in een gewenst mediavolume van 12 mL, voeg (12/((0.5 x 1.000) = 0.024 mL van cultuur aan 12 mL van media toe Bedek de platen met deksels en incubeer bij 37 °C gedurende 18-24 uur zonder te schudden. Visueel inspecteren van de platen, met de MIC is de laagste concentratie goed met geen zichtbare groei.OPMERKING: Zie tabel 1 voor enkele voorbeelden van actieve en inactieve fluorescerende antibiotica. 4. Analyse van sondeaccumulatie door spectrofotometrie en flowcytometrie OPMERKING: Deze centrifugatie tijden zijn geoptimaliseerd voor E. coli,dus kleine veranderingen kunnen nodig zijn voor andere soorten. Representatieve gegevens voor sondeaccumulatie worden gerapporteerd voor de NBD-gelabelde ciprofloxacine-sonde. Streep glycerol voorraden van de bacteriële stammen op LB agar en groeien ‘s nachts op 37 °C. Kies een enkele kolonie van de plaat en cultuur ‘s nachts in LB bij 37 °C. Verdun ‘s nachts culturen ~ 50-voudige in de media en groeien tot mid-log fase (OD600 = 0,4-0,8). Centrifugeer de culturen op 1.470 x g gedurende 25 min en decanteer de media. Resuspend de bacteriën in 1 mL fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS), dan centrifugeeren op 1.470 x g voor 15 min. Decanteer de media en resuspend de gewassen pellets in PBS naar een definitieve OD600 = 2. Voeg indien gewenst 10,1 μL carbonylcyanide 3-chloorophenylhydrazone (CCCP, 10 mM in PBS) toe aan 1 mL bacteriën (eindconcentratie 100 μM) en uitbroed bij 37 °C gedurende 10 min.OPMERKING: CCCP is een efflux pompremmer. De toevoeging van CCCP zal het onderzoek naar de impact van de efflux mogelijk maken. Centrifugeer de culturen op 18.000 x g gedurende 4 min bij 20 °C en decanteer de media. Voeg 1 mL fluorescerende antibioticaoplossing (10-100 μM in PBS) toe aan de pellet en incubeer bij 37 °C gedurende 30 min. Centrifugeer de culturen op 18.000 x g gedurende 7 min bij 4 °C en decanteer de media. Resuspend de bacteriën in 1 mL koude PBS, en herhaal stap 4.9. Herhaal stap 4.10 in totaal 4x. Indien gewenst, lyse bacteriën door toevoeging van 180 μL lysis buffer (20 mM Tris-HCl, pH 8.0, en 2 mM natrium EDTA) dan 70 μL lysozyme (72 mg/mL in H2O). Incubeer bij 37°C gedurende 30 min, dan vries-dooi 3x (−78 °C gedurende 5 min, dan 34 °C gedurende 15 min). Soniceren van de monsters voor 20 min, dan warmte tot 65 °C voor 30 min. Centrifugeer de lysed samples (18.000 x g, 8 min), filtreer vervolgens door een 10 kDa filtermembraan. Was het filter de 4x met 100 μL water. Breng het lysaat over op een zwarte 96-putplaat met platte bodem en meet de fluorescentieintensiteit op een plaatlezer met excitatie- en emissiegolflengten die geschikt zijn voor het fluorophore (d.w.z. DMACA: λex = 400 nm, λem = 490 nm; NBD: λex = 475 nm, λem = 545 nm).OPMERKING: Zie figuur 3 voor voorbeelden van spectrofotometrische analyses van bacteriën met behulp van het fluorescerende NBD-gelabelde ciprofloxacineantibioticum. Voor analyse per flow cytometrie kunnen dezelfde groei- en kleuringsvoorwaarden worden gebruikt (stappen 4.1–4.17), waarbij alleen in de uiteindelijke voorbereiding wijzigingen worden aangebracht. Breng het totale volume op 1 mL PBS. Lees monsters op een stroomcytometer met een stroomsnelheid van ongeveer 60 μL/min, met behulp van logaritmische versterking voor de gegevensverwerving (F1-excitatie = 488 nm; emissie = 525/20 nm). Neem in totaal 10.000 gebeurtenissen op en analyseer de gegevens met behulp van de juiste software. Plot de fluorescentieintensiteit van de F1 tegen het aantal gebeurtenissen telt, het schatten van de mediane fluorescentie intensiteit van het histogram pieken nadat de bacteriën werd gekleurd.OPMERKING: Zie figuur 4 voor voorbeelden van stroomcytometrieanalyses van bacteriën met behulp van het nbd-gelabelde ciprofloxacine-antibioticum. 5. Voorbereiding voor microscopische analyse Kweek subculturen tot OD600 = 0,4, zoals voor MIC-beoordeling, verdeel dan in 1 mL aliquots en centrifuge op 18.000 x g voor 3-5 min. Decanteer en gooi media weg en schors vervolgens bacteriële pellet in 500 μL HBSS. Centrifugeer bij 18.000 x g voor 3 min en decanteer en gooi media weg. Bereid oplossingen voor van antibioticasondes in HBSS bij concentraties van 1-100 μM. Resuspend de gewassen bacteriën in 500 μL van de sondeoplossing en broed op 37 °C gedurende 30 min. Herhaal stap 5.3. Voor een meervoudig etiketteringsexperiment, resuspend de pellet in 500 μL van een orthogonally gekleurde nucleïnezuurkleurstof. Gebruik Syto9 (5 μM in HBSS) voor groen; voor blauw, gebruik Hoechst 33342 (20 μg/mL in HBSS). Incubate bij RT voor 15-30 min. Herhaal stap 5.3 en bredig vervolgens opnieuw in 500 μL FM4-64FX (5 μg/mL in HBSS) en incubeer bij RT gedurende 5 min. Herhaal stap 5.3, dan opnieuw opteschorten in 500 μL HBSS, en herhaal stap 5.3 nogmaals. Herhaal stap 5.8 en hang de gewassen, geverfde bacteriën uiteindelijk op in 15 μL montagemedium (zie Tabel met materialen). Pipette montage medium op een microscoop dia en top met een high-performance cover slip, dan afdichting randen met duidelijke nagellak.OPMERKING: Zie figuur 5 voor voorbeelden van confocale microscopiebeelden die zijn gemaakt met ciprofloxacine- en trimethoprimantibiotica met het NBD-label, en figuur 6 voor oxazolidinon (linezolid) antibioticum met DMACA-gelabelde oxazolidinon (linezolid).