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Immunology and Infection

Visualizzazione, quantificazione e mappatura delle popolazioni di cellule immunitarie nel microambiente tumorale

Published: March 25, 2020
doi:
10.3791/60740
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1Centre de Recherche du Centre hospitalier de l’Université de Montréal (CRCHUM), 2Département de Microbiologie, Infectiologie et Immunologie, Faculté de Médecine,Université de Montréal, 3Département de Pathologie et Biologie Cellulaire, Faculté de Médecine,Université de Montréal, 4Institut du Cancer de Montréal, 5Département de Neurosciences, Faculté de Médecine,Université de Montréal, 6Département de Chirurgie, Faculté de Médecine,Université de Montréal, 7Département de Médecine, Faculté de médecine,Université de Montréal

Summary

Qui, descriviamo una strategia semplice e accessibile per visualizzare, quantificare e mappare le cellule immunitarie nelle sezioni del tessuto tumorale incorporate con paraffina. Questa metodologia combina le tecniche di imaging e analisi digitale esistenti con lo scopo di espandere la capacità di multiplexing e l’analisi multiparametrica dei saggi di imaging.

Abstract

Il paesaggio immunitario del microambiente tumorale (TME) è un fattore determinante nella progressione del cancro e nella risposta alla terapia. In particolare, la densità e la posizione delle cellule immunitarie nel TME hanno importanti valori diagnostici e prognostici. La profilazione multiomica del TME ha aumentato esponenzialmente la nostra comprensione delle numerose reti cellulari e molecolari che regolano l’inizio e la progressione del tumore. Tuttavia, queste tecniche non forniscono informazioni sull’organizzazione spaziale delle cellule o sulle interazioni cellula-cellula. Tecniche di multiplexing convenienti, accessibili e facili da eseguire che consentono la risoluzione spaziale delle cellule immunitarie nelle sezioni di tessuto sono necessarie per integrare le tecnologie ad alta velocità ad alta velocità basate su singole cellule. In questo articolo viene descritta una strategia che integra l’imaging seriale, l’etichettatura sequenziale e l’allineamento delle immagini per generare diapositive virtuali multiparametriche di intere sezioni di tessuto. Le diapositive virtuali vengono successivamente analizzate in modo automatizzato utilizzando protocolli definiti dall’utente che consentono l’identificazione, la quantificazione e la mappatura delle popolazioni di cellule di interesse. L’analisi dell’immagine viene eseguita, in questo caso utilizzando i moduli di analisi Tissuealign, Author e HISTOmap. Presentiamo un esempio in cui abbiamo applicato con successo questa strategia a un campione clinico, massimizzando le informazioni che possono essere ottenute da campioni di tessuto limitati e fornendo una visione imparziale del TME nell’intera sezione tissutale.

Introduction

Lo sviluppo del cancro è il risultato di un processo a più fasi che coinvolge interazioni reciproche tra le cellule maligne e il TME. Oltre alle cellule tumorali, il TME è composto da cellule non maligne, cellule stromali, popolazioni di cellule immunitarie e matrice extracellulare (ECM)1. L’organizzazione spaziale dei diversi componenti cellulari e strutturali del tessuto tumorale e lo scambio dinamico tra il cancro e le cellule non cancerose vicine alla fine modulano la progressione tumorale e la risposta alla terapia2,3,4. È stato dimostrato che la risposta immunitaria nel cancro è spatiotemporalmente regolata5,6. Diverse popolazioni di cellule immunitarie che si infiltrano nella lesione neoplastica e nel tessuto adiacente presentano modelli di distribuzione spaziale distintivi e diversi stati di attivazione e differenziazione associati a diverse funzioni (ad esempio, pro- contro antitumor). Queste diverse popolazioni immunitarie e i loro parametri covolvono lo straordinario con il tumore e i compartimenti stromali.

L’emergere di tecnologie che consentono la profilazione multiomica a singola cellula ha aumentato esponenzialmente la nostra comprensione delle numerose reti cellulari e molecolari che regolano la carcinogenesi e la progressione del tumore. Tuttavia, la maggior parte degli strumenti analitici ad alta velocità basata su singole cellule richiedono interruzioni dei tessuti e isolamento cellulare singola, con conseguente perdita di informazioni sull’organizzazione spaziale delle cellule e sulle interazioni cella-cellule7. Poiché la posizione e la disposizione di specifiche cellule immunitarie nel TME hanno un valore diagnostico e prognostico, le tecnologie che consentono la risoluzione spaziale sono un complemento essenziale di tecniche di profilazione immunitaria basate su singole cellule.

Tradizionalmente, tecniche di imaging come l’immunosintochimica (IHC) e l’immunofluorescenza multiplex (mIF) sono state limitate a un piccolo numero di biomarcatori che possono essere visualizzati contemporaneamente. Questa limitazione ha ostacolato lo studio delle dinamiche spatiotemporali delle cellule immunitarie che infiltrano i tumori, che sono tipicamente definite da diversi marcatori fenotipici. I recenti progressi nell’imaging e negli strumenti analitici hanno ampliato le possibilità del multiplexing. Sono state utilizzate nuove tecnologie di etichettatura basate su anticorpi come la citometria della itometria e la citometria di massa di imaging per separare spazialmente fino a 12 e 32 biomarcatori, rispettivamente8,9. L’imaging della spettrometria di massa, una tecnica che non richiede l’etichettatura, ha il potenziale per immagini di migliaia di biomarcatori contemporaneamente in una singola sezione di tessuto10,11. Anche se queste tecniche hanno già mostrato un grande potenziale per sezionare il paesaggio immunitario dei tessuti nel cancro, usano attrezzature e software altamente sofisticati e costosi e non sono facilmente accessibili alla maggior parte dei ricercatori.

In alternativa, la capacità di multiplexing dei tradizionali IHC e mIF è stata ampliata attraverso l’uso di imaging seriale, cicli sequenziali di etichettatura e imaging spettrale7,12,13,14,15,16. Queste tecniche generano più immagini dalla stessa o da sezioni di tessuto seriale che possono essere consolidate in diapositive virtuali multiparametriche utilizzando il software di analisi delle immagini. Di conseguenza, il numero di marcatori che possono essere visualizzati e analizzati contemporaneamente aumenta.

Qui, proponiamo una strategia per la progettazione razionale di saggi multix dei tessuti utilizzando reagenti disponibili in commercio, apparecchiature di microscopia a prezzi accessibili e software user-friendly (Figura 1). Questa metodologia integra l’imaging seriale, l’etichettatura multiplex sequenziale, l’imaging dei tessuti interi e l’allineamento dei tessuti per generare diapositive multiparametriche virtuali che possono essere utilizzate per la quantificazione automatizzata e la mappatura delle cellule immunitarie nelle sezioni tissutali. Utilizzando questa strategia, abbiamo creato una diapositiva virtuale composta da 11 biomarcatori più due macchie istologiche usate di frequente: ematossina e eosina (H&E) e rosso picrosirico (PSR). Sono state identificate, localizzate e quantificate più popolazioni di cellule immunitarie in diversi compartimenti tissutali e la loro distribuzione spaziale è stata risolta utilizzando mappe di calore dei tessuti. Questa strategia massimizza le informazioni che possono essere ottenute da campioni clinici limitati ed è applicabile a campioni di tessuto archiviati con paraffina fissata a formalina (FFPE), tra cui tessuti interi, biopsie di aghi centrali e microarray di tessuti. Proponiamo questa metodologia come utile guida per la progettazione di saggi personalizzati per l’identificazione, la quantificazione e la mappatura delle popolazioni di cellule immunitarie nel TME.

Protocol

Tre sezioni SERIALi di FFPE dal carcinoma epatocellulare umano associato al virus dell’epatite B (HBV) associato al virus dell’epatite B (HBV) sono state ottenute dal Centre hospitalier de l’Université de Montréal (CHUM) Hepatopancreatobiliary Cancer Clinical Database and Biological Specimen Repository (HBP Biobank). I pazienti che partecipano a questa banca tissutale hanno fornito il consenso informato. Questo studio è stato approvato dal comitato etico istituzionale (numero protocollo 09.237) ed eseguito in conformità con la Dichiarazione di Helsinki. 1. Protocollo di colorazione ematossia e eosina (H&E) NOTA: la colorazione H&E è stata eseguita dalla struttura centrale della patologia molecolare del Centre de Recherches du Centre hospitalier de l’Université de Montréal (CRCHUM) utilizzando le scale robotiche di scorrimento multiprogramma Shandon utilizzando il seguente programma. Per la deparaffinazione, immergere le diapositive 3x per 2,5 min ciascuna in sostituzione di xilene.AVVISO: i sostituti dello xylene sono infiammabili, irritanti della pelle e dannosi se inalati. Per la reidratazione, immergere i vetrini in etanolo 100% 3x per 2,5 min ciascuno. Lavare per 1 min in acqua a doppia distillazione (ddH2O) per reidratare. Incubare per 1 min in ematossitale. Lavare 3x per 1 min ciascuno in ddH2O. Incubare per 5 s con eosina. Lavare 30 s con 95% di etanolo. Lavare 2 volte per 1 min con 100% di etanolo.AVVISO: l’etanolo è infiammabile e irritante per gli occhi. Eosin è un irritante per gli occhi. Per la disidratazione, immergere 3x per 1,5 min ciascuno nel sostituto dello xilene. Montare i vetrini manualmente.NOTA: il tempo stimato per l’esecuzione di questa parte del protocollo è di 30 min. 2. Protocollo di colorazione immunofluorescenza multiplex per sezioni FFPE NOTA: Questo protocollo è stato adattato da Robertson etal. Deparaffinazione e reidratazioneNOTA: prima dell’etichettatura mediata da anticorpi delle sezioni FFPE da IHC o mIF, la paraffina deve essere rimossa. La mancata rimozione efficiente della paraffina comporta una colorazione non ottimale. Mettere 4 m di sezione del tessuto FFPE nei supporti per scivoli di vetro. Sotto il cofano dei fumi, immergere i vetrini in un barattolo Coplin contenente 37 gradi di xilene preriscaldato per 10 min.AVVISO: Lo xylene è infiammabile, irritante per la pelle e dannoso se inalato. Agitare manualmente le diapositive per 10 s ogni 2 min. Ripetere 1x in xilene fresco per altri 5 min. Nel cofano chimico, immergere i vetrini in sequenza per 5 min in ciascuna delle seguenti soluzioni: 1) xilene : etanolo (1:1 v/v); 2) 100% etanolo; 3) 70% di etanolo; 4) 50% di etanolo; 5) 30% di etanolo; 6) salina tampone fosfata (PBS).NOTA: Conservare le diapositive in PBS fino a quando non sono pronte per eseguire il recupero dell’antigene. Mantenere le sezioni decerate idratate in ogni momento. L’essiccazione causerà un legame non specifico degli anticorpi e quindi un’elevata colorazione di fondo. Recupero dell’antigene indotto dal caloreNOTA: Gli antigeni possono essere mascherati su fissazione formalina, prevenendo il legame degli anticorpi e di conseguenza la visualizzazione. L’uso di tamponi e procedure di smascheramento dell’antigene ristabilisce parzialmente la conformazione nativa degli epitopi e ripristina così il riconoscimento degli anticorpi. Il tipo di buffer e durata di recupero dell’antigene deve essere ottimizzato per le condizioni specifiche del test (ad esempio, bersaglio, anticorpo, tessuto, ecc.). Immergere diapositive dewaxed in un barattolo Coplin contenente la soluzione di recupero dell’antigene (ricetta nella Tabella dei Materiali). Mettere il barattolo Coplin chiuso in una pentola a pressione elettrica con acqua del rubinetto. Il livello dell’acqua non deve superare la metà dell’altezza del barattolo in modo che l’acqua non si mescoli con la soluzione di recupero dell’antigene. Chiudere il coperchio e la valvola di pressione del fornello. Selezionare alta pressione per 10 min e iniziare. Al termine, scollegare il fornello, rilasciare la pressione, aprire il coperchio e tenere il barattolo all’interno del fornello per 30 min, lasciando raffreddare i vetrini. Blocco dell’associazione non specifica Trasferire il rack con le diapositive in un barattolo Coplin pieno di PBS. Risciacquare il buffer di recupero dell’antigene con PBS 2x per 5 min ciascuno. Circondale con una penna PAP per creare una barriera idrofobica. Immergere i vetrini in un barattolo Coplin contenente 0,1 M di glicina in PBS. Incubare per 15 min a temperatura ambiente (RT).NOTA: La glicina satura i gruppi di aldeide generati durante il recupero dell’antigene. Questi gruppi potrebbero legare gli anticorpi primari e secondari in modo inspecifico. Risciacquare la soluzione di glicina lavando 2x con PBS per 5 min. Posizionare i vetrini in una camera di umidità e aggiungere abbastanza soluzione di blocco per coprire tutte le sezioni di tessuto. Evitare di traboccare la barriera idrofobica. Incubare per 30 min a RT.NOTA: la ricetta per la soluzione di blocco è disponibile nella Tabella dei Materiali. La soluzione di blocco deve contenere una proteina (ad esempio, BSA) per bloccare i siti di legame non specifici. Può anche incorporare detergenti come Triton X-100 o Tween 20 che riducono le interazioni idrofobiche tra anticorpi e bersagli tissutali, rendendo così più selettivo il riconoscimento degli antigeni. L’aggiunta del 10% di siero totale dalla specie da cui proviene il tessuto bloccherebbe i recettori Fc e quindi ridurrebbe il legame degli anticorpi non specifici. Infine, l’aggiunta del 10% del siero delle specie in cui sono stati allevati gli anticorpi secondari ridurrebbe al minimo l’attaccamento non specifico diretto degli anticorpi secondari alla sezione del tessuto. Etichettatura dell’immunofluorescenza Risciacquare con PBS-Tween (0,1% v/v) 2x per 5 min ciascuno e riposizionare i vetrini nella camera di umidità. Aggiungere il cocktail di anticorpi primari risospeso in soluzione di blocco. Incubare per tutta la notte a 4 gradi centigradi. Gli anticorpi primari e secondari utilizzati per questo studio sono elencati nella Tabella dei materiali.NOTA: Il cocktail di anticorpi primari deve contenere anticorpi allevati in specie diverse, o della stessa specie ma di isotipi diversi. Per un elenco delle coppie di anticorpi primari-secondari utilizzati in questo studio consultare la tabella 2. I dettagli di tutti gli anticorpi utilizzati sono riportati nella Tabella dei materiali e nella Tabella 2. Risciacquare con PBS-Tween (0,1% v/v) 3x per 5 min e riposizionare i vetrini nella camera di umidità. Al buio, aggiungere il cocktail di anticorpi secondari e incubare per 1 h a RT.NOTA: Quando gli anticorpi primari provengono da specie diverse, gli anticorpi secondari devono essere selezionati in modo che ciascuno di essi si lega solo a uno degli anticorpi primari e non l’uno all’altro. Ciò si ottiene comunemente utilizzando anticorpi secondari tutti allevati nella stessa specie, purché questa specie differisca dalle specie in cui sono stati generati gli anticorpi primari. Nei casi in cui gli anticorpi primari sono stati allevati nella stessa specie ma hanno isotipi diversi, dovrebbero essere utilizzati anticorpi secondari specifici per isotipi. Risciacquare con PBS-Tween (0,1% v/v) 3x per 5 min ciascuno. Risciacquare con ddH2O. Rimuovere il liquido in eccesso e montare in supporti di montaggio con DAPI. Il volume utilizzato dipende dalle dimensioni della sezione. Di solito 40 l è sufficiente per coprire la superficie di un normale vetrino di microscopia. Posizionare il vetrino di copertura sulla sezione e spremere delicatamente il supporto di montaggio in eccesso evitando la formazione di bolle. Lasciare asciugare i vetrini per 20 min al buio e conservare a 4 gradi centigradi fino a quando non sono pronti per l’acquisizione. Acquisire immagini per tutti i canali utilizzando l’intero scanner di diapositive (vedere Tabella dei materiali).NOTA: Gli anticorpi sono stati convalidati utilizzando il tessuto carcinoma epatocellulare umano come controllo positivo. Per ogni anticorpo primario, tre sezioni seriali sono state macchiate con anticorpo primario, controllo isotipo, o solo soluzione di blocco, rispettivamente senza variazioni nel resto del protocollo di colorazione. Le immagini acquisite sono state confrontate per stabilire la specificità della colorazione. La colorazione era considerata specifica quando il segnale nella sezione incubato con anticorpo primario aveva il modello previsto ed era facilmente distinguibile dallo sfondo. Gli anticorpi primari che danno un segnale di fondo elevato o componenti del tessuto di etichettatura nell’isotipo e nessuna sezione anticorpale primaria è stata considerata non specifica. Il tempo stimato per il completamento di questa parte del protocollo è di 2 giorni. I controlli richiesti includono: (1) controllo isotipo per stabilire il contributo di legame non specifico dell’anticorpo primario al segnale di fondo. Una sezione è macchiata allo stesso modo degli altri tessuti campione, tranne per il fatto che è incubata con un anticorpo con lo stesso isotipo e origine dell’anticorpo primario ma specifica per un bersaglio che è assente nella sezione del tessuto. Se l’anticorpo di controllo isotipo appropriato non è disponibile, può essere sostituito da IgG totale della stessa specie in cui è stato allevato l’anticorpo primario; (2) Nessun controllo anticorpale primario (cioè controllo negativo) per stabilire la specificità della colorazione e per stimare il contributo del legame non specifico di anticorpi secondari al segnale di fondo. In questo caso, la sezione di controllo è macchiata nello stesso modo delle altre sezioni, ad eccezione del fatto che non viene aggiunto alcun anticorpo primario; (3) Controllo positivo per stabilire che la colorazione funziona. In questo caso, la colorazione viene eseguita su una sezione di tessuto che è noto per esprimere il marcatore riconosciuto dall’anticorpo primario. 3. Picro-sirius rosso (PSR)/protocollo di colorazione verde veloce NOTA: L’obiettivo di questa colorazione è quello di visualizzare collageni fibrillari I e III nelle sezioni del tessuto FFPE. Questo protocollo è stato adattato da Segnani et al.18. Tutti i passaggi vengono eseguiti in una cappa chimica. Eseguire la deparaffinazione e la reidratazione delle sezioni tissutali simili al protocollo di colorazione dell’immunofluorescenza multiplex per le sezioni FFPE (sezione 2.1).NOTA: Se la sezione da colorare è stata precedentemente utilizzata per l’etichettatura immunofluorescenza e la paraffina è già stata rimossa, le fasi di disperazione-reidratazione sono utili per rimuovere il supporto di montaggio. DAPI non viene rimosso utilizzando questa procedura, ma non interferisce in modo percevolmente con la colorazione PSR. Immergere i vetrini in un barattolo contenente la soluzione picro-sirius rosso/verde veloce (ricetta nella tabella dei materiali)e incubare per 30 min a RT (più di 30 min si traduce in colorazione non specifica dei nuclei degli epatociti). Lavare rapidamente i vetrini in ddH2O (5 tuffi). Quindi, lavare rapidamente in etanolo 100% (5 tuffi). Lavare per 30 s in xilene-100% etanolo (1:1 v/v). Lavare per 30 s in xilene. Montaggio con supporto di montaggio (vedi Tabella dei materiali)prima che lo xilene sia completamente evaporato (questo aiuta con il montaggio).NOTA: il tempo stimato per l’esecuzione di questa parte del protocollo è 1 h. 4. Elusione di anticorpi da sezioni tissutali NOTA: Per riutilizzare le sezioni tissutali nei saggi di etichettatura sequenziali, è necessaria la rimozione completa degli anticorpi primari e secondari. Gli anticorpi legati sono stati rimossi come descritto in precedenza13. Preriscaldare un bagno d’acqua a 56 gradi centigradi. Mettere le sezioni all’interno di un barattolo contenente buffer di stripping (ricetta in Table of Materials), chiudere il coperchio e sigillarlo con nastro adesivo in paraffina per evitare perdite durante lo scuotimento. Mettere il barattolo all’interno del bagno d’acqua e incubare per 30 min con agitazione. Lavare 4x per 15 min ciascuno in ddH2O a RT. Risciacquare con PBS-Tween (0.1% v/v). Mantenere le sezioni idratate in PBS-Tween o acqua fino a quando non è pronto a ricontrollare la sezione con il secondo ciclo di anticorpi primari.NOTA: il tempo stimato per l’esecuzione di questa parte del protocollo è 2 h. Verificare l’efficienza della procedura di eluzione dell’anticorpo.NOTA: Prima di utilizzare il protocollo per la eluzione di anticorpi in un saggio di etichettatura sequenziale, è necessario verificare l’efficienza della rimozione degli anticorpi primari e secondari. Eseguire la colorazione e l’acquisizione dell’immagine di una sezione con una determinata coppia di anticorpi primario-secondario di interesse, come indicato nel protocollo di colorazione dell’immunofluorescenza multiplex per le sezioni FFPE (sezioni 2.1–2.4.6). Al momento dell’acquisizione dell’immagine, eseguire l’elusione di complessi di anticorpi primari-secondari legati al tessuto, come indicato nelle sezioni 4.1–4.3. Incubare la sezione con lo stesso anticorpo secondario e le stesse condizioni utilizzate nel passaggio 2.4.3. Eseguire i passaggi di lavaggio, montaggio e acquisizione dell’immagine come indicato in 2.4.4–2.4.6. Confrontare le immagini affiancate acquisite prima e dopo lo stripping per stabilire se il segnale specifico è scomparso o meno.NOTA: Il confronto delle immagini prima e dopo la rimozione degli anticorpi convaliderà l’efficienza della procedura di eluizione. Tuttavia, è normale vedere un aumento del segnale di fondo in tutti i canali, così come la diffusione di DAPI. Questo limita il numero di giri di stripping che possono essere eseguiti sulla stessa sezione di tessuto. Tre turni di stripping sembrano essere il massimo. 5. Acquisizione di immagini Generare immagini utilizzando un intero scanner di diapositive. Utilizzare un obiettivo 20x 0,75NA e una risoluzione di 0,3225 m/pixel. 6. Analisi dell’immagine NOTA: il metodo qui descritto si riferisce all’esempio corrente. Si prega di fare riferimento alla Tabella 1 e al testo per adattarsi ad altri campioni specifici. Eseguire l’allineamento dei tessuti utilizzando il modulo Tissualign del software di analisi delle immagini (VIS in questo protocollo, vedere Tabella dei materiali). Aprire il software di analisi delle immagini e fare clic sulla scheda Tissuealign. Importare le immagini da allineare nel vassoio delle diapositive passando a File Database e selezionare la prima immagine da allineare. Tornare alla scheda Tissuealign e caricare l’immagine facendo clic sul pulsante Carica nel vassoio delle diapositive. L’immagine verrà visualizzata nel vassoio diapositive e nell’area di lavoro.NOTA: solo la pila di interesse deve essere caricata nel vassoio scorrevole. Ripetere il passaggio 6.1.2 per tutte le immagini nell’ordine da allineare, caricandole una per una. Una volta caricate tutte le immagini di interesse sulla barra delle Workflow Steps diapositive, procedere al collegamento delle immagini premendo Avanti nella barra multifunzione. Quindi, trascinare e rilasciare la seconda immagine sopra la prima immagine. La prima e la seconda immagine sono ora collegate. Ripetere questo passaggio per allineare le altre immagini, una alla volta, in modo ordinato. Il nome della prima immagine cambierà, a indicare che è stata collegata alle altre immagini. Contemporaneamente, le immagini collegate verranno visualizzate nell’area di lavoro a destra del vassoio diapositive. A questo punto, allineare le immagini utilizzando l’allineamento automatico, l’allineamento semiautomatico o l’allineamento manuale. È sempre preferibile provare prima l’allineamento automatico. Per l’allineamento automatico premere il pulsante Avanti nei passaggi del flusso di lavoro (passaggio 3) nella barra multifunzione. Esaminare l’allineamento automatico navigando in diverse posizioni del tessuto e verificando visivamente che le strutture corrispondenti in immagini diverse siano disposte nello stesso modo nelle due dimensioni dell’immagine. Se il risultato dell’allineamento automatico non è soddisfacente, migliorarlo utilizzando perni (utilizzare un minimo di tre pin per immagine) indicando le caratteristiche del tessuto omologoso nelle immagini collegate. Una volta che i perni sono posizionati in posizioni omologhe nelle immagini collegate, l’utente ha due scelte: allineamento semiautomatico o allineamento manuale. Per l’allineamento semiautomatico, fare clic sul pulsante Allineamento automatico in base ai punti di riferimento correnti nella barra multifunzione. Per l’allineamento manuale, fare clic sul pulsante Applica Pin sulla barra multifunzione. Una volta soddisfatti dell’allineamento, fare clic sul pulsante Avanti nei passaggi del flusso di lavoro e salvare l’immagine composita nel database.NOTA: L’allineamento di sei diapositive che coprono 11 marcatori più le immagini H&E e PSR ha richiesto 15 minuti nell’analisi presentata. Eseguire il rilevamento dei tessuti utilizzando il protocollo definito dall’utente Analysis Protocol Package 1 (APP 1, Tabella 1). Aprire il modulo Analisi immagine del software facendo clic sulla scheda Analisi immagini sulla barra multifunzione. Importare l’immagine composita (allineata) Database e selezionando l’immagine di interesse e facendo clic di nuovo sulla scheda Analisi immagine. Aprire la finestra di dialogo di selezione APP facendo clic sull’icona Apri APP e selezionare il pacchetto APP da utilizzare. In questo caso selezionare APP 1 per il rilevamento dei tessuti. Una volta aperto app 1, verificare che APP1 funzioni correttamente andando in una posizione del tessuto selezionata e facendo clic sul pulsante Anteprima. Se i risultati sono soddisfacenti, andare al passaggio successivo. Fare clic per eseguire APP 1 ed elaborare l’immagine utilizzando l’APP selezionata. Esportare i dati (ad esempio immagini, misure, ecc.) quando l’analisi viene eseguita facendo clic su File/Esporta.NOTA: APP 1 crea una regione di interesse (ROI) delineando il tessuto (tessuto ROI) e calcola l’area del tessuto. Salvare l’immagine modificata con il ROI appena creato scegliendo File Risparmiate vi salvo.NOTA: il rilevamento del tessuto e la creazione di un ROI con APP 1 nell’esempio fornito hanno preso 5 min nella stazione di analisi delle immagini descritta. L’area del tessuto lavorato era di 3,2 cm2. Eseguire la segmentazione dei tessuti in Stroma e Parenchyma utilizzando l’APP 2(Tabella 1).NOTA: APP 2 funziona sul tessuto ROI predefinito. APP 2 segmenta il tessuto nei ROI Stroma e Parenchyma. Aprire il modulo Analisi immagine facendo clic sulla scheda Analisi immagine sulla barra multifunzione. Importare l’immagine contenente il tessuto roI accedendo a File Database e selezionando l’immagine salvata nel passaggio 6.2.7. Tornare alla scheda Analisi immagine e caricare l’immagine facendo clic sul pulsante Carica nel vassoio diapositive. L’immagine verrà visualizzata nel vassoio diapositive e nell’area di lavoro. Aprire APP 2 utilizzando la finestra di dialogo di selezione APP come nella 6.2.3. Anteprima APP 2 elaborando in un campo visivo selezionato. Se i risultati sono soddisfacenti, eseguire APP 2 sull’immagine completa facendo clic sul pulsante Esegui. Come output di APP 2, il tessuto ROI è segmentato nei ROI Stroma e Parenchyma e le rispettive aree determinate. Risultati dell’esportazione come in 6.2.6. Salvare l’immagine modificata come in 6.2.7.NOTA: La segmentazione del tessuto in Stroma e Parenchyma utilizzando APP 2 ha richiesto 4 h nella stazione di analisi presentata. L’area del tessuto lavorato era di 3,2 cm2. Identificare e quantificare le celleFoxP3 hiCD4 utilizzando il protocollo definito dall’utente APP 3(Tabella 1).NOTA: APP 3 funziona sui ROI predefiniti Stroma e Parenchyma. Aprite il modulo Analisi immagine e importate l’immagine contenente i ROI Stroma e Parenchyma come in 6.3.1 e 6.3.2. Aprire APP 3 utilizzando la finestra di dialogo di selezione APP come nella 6.2.3. Anteprima APP 3 elaborazione in un campo visivo selezionato arricchito in FoxP3hicd4 celle. Se i risultati sono soddisfacenti, eseguire APP 3 sull’immagine completa. Come output di APP 3, tutti i singoli oggettiFoxP3 hiCD4 , saranno etichettati e le loro coordinate tissutali memorizzate. Saranno determinate le densità degli oggetti FoxP3hiCD4 nelle classi ROM e Parenchyma. Esportare i risultati come in 6.2.6. Eseguire la mappatura del calore dei tessuti degli oggetti etichettati FoxP3hiCD4. Aprire il protocollo definito dall’utente FoxP3hiCD4 MAP utilizzando la finestra di dialogo di selezione APP come in 6.2.3.NOTA: FoxP3hiCD4 MAP utilizza le coordinate degli oggetti etichettati FoxP3hiCD4 per la generazione di mappe di calore di densità. L’identificazione ehiil conteggio degli oggetti etichettati con etichetta FoxP3 hi CD4 con APP 3 hanno richiesto 25 min nella stazione di analisi delle immagini descritta. L’area del tessuto lavorato era di 3,2 cm2. Eseguire FoxP3hiCD4, MAP premendo il pulsante Esegui. Esportare la mappa di calore del tessuto facendo clic su File Proprietà Export . Area di lavoro.NOTA: la mappatura di FoxP3hicd4, con l’utilizzo di FoxP3hiCD4 MAP, ha richiesto 5 min nella stazione di analisi delle immagini descritta. Identificare e quantificare gli oggetti CD8, CD68, MPO, SMA e CD34 utilizzando i protocolli definiti dall’utente APP 4, APP5, APP6, APP7 e APP 8, rispettivamente (tabella 1) come fatto nella sezione 6.4-6.4.3.2 che carica l’APP di interesse in ogni caso.NOTA: gli APP lavorano da 4 a 8 sui ROI predefiniti Stroma e Parenchyma.

Representative Results

Panoramica della strategia per la visualizzazione, la quantificazione e la mappatura delle popolazioni di cellule di interesse nel TMEPer quantificare le popolazioni cellulari di interesse (COI) in diversi compartimenti tissutali (TC) e per caratterizzare la loro organizzazione spaziale, abbiamo progettato un flusso di lavoro che integra tecniche convenienti e facili da usare e massimizza le informazioni posizionali che possono essere ottenute da preziosi campioni clinici FFPE (Figura 1). In primo luogo, le sezioni FFPE del tessuto intero seriale sono state macchiate per la visualizzazione di COI (ad esempio, cellule immunitarie) e TC (ad esempio, stroma contro parenchyma) (Figura 1, punto 1). Il numero di sezioni consecutive da macchiare deve essere ridotto al minimo che consenta la visualizzazione delle cellule di interesse o delle caratteristiche tissutali necessarie per affrontare la questione della ricerca. Minore è il numero di sezioni seriali, maggiore è la somiglianza e la concordanza dell’architettura dei tessuti in sezioni contigue. Inoltre, la capacità di multiplexing può essere ampliata attraverso il riutilizzo di sezioni colorate fluorescenti attraverso tecniche di stripping e riprobing19. Una volta che sono stati fatti i passaggi di colorazione, è stato utilizzato un intero scanner di diapositive per digitalizzare le immagini. Le immagini acquisite da sezioni seriali sono state allineate e consolidate in una diapositiva multiplex virtuale in modo automatizzato(Figura 1, sezione 2). Successivamente, un ROI per il tessuto è stato delineato con un protocollo definito dall’utente che identificava i pixel associati ai tessuti (TAP)(Figura 1, passaggio 3). Successivamente, il tessuto del ROI è stato segmentato in TC definiti ROI aggiuntivi. (Figura1, passaggio 4). Successivamente, i protocolli definiti dall’utente hanno rilevato e quantificato i COI in diversi BC(Figura 1, passaggio 5). Infine, le mappe di calore dei tessuti delle COI sono state generate in base alle loro densità e alle loro coordinate tissutali(Figura 1, punto 6). Figura 1: Rappresentazione schematica della strategia per la visualizzazione, la quantificazione e la mappatura delle cellule immunitarie nel TME. (1) Le sezioni seriali del tessuto intero sono state macchiate per l’etichettatura dei CO e le sezioni di tessuto colorato intero sono state digitalizzate utilizzando uno scanner di scorrimento intero. (2) Le immagini acquisite da sezioni seriali sono state collegate, allineate e registrate in modo automatizzato utilizzando un modulo di analisi Tissuealign. Un’immagine composita è stata generata dall’allineamento ad alta precisione delle singole immagini. (3) È stato utilizzato un protocollo definito dall’utente per il rilevamento automatico dei pixel associati ai tessuti (TAP) nell’immagine composita. (4) Il tessuto è stato segmentato in TC (ad esempio stroma e parenchyma) definito ROI. (5) Sono stati utilizzati protocolli definiti dall’utente per il rilevamento automatico e la quantificazione dei COI in diversi televisori. (6) Sono state generate mappe di calore dei tessuti di COI. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Imaging di COI e TCTre sezioni seriali di tessuto FFPE di tumore resezionato da un soggetto con carcinoma epatocellulare associato all’HBV sono state macchiate in uno o più cicli di colorazione come nella Figura 2A. Sezione Sono stato macchiato con H&E per mostrare l’architettura del tessuto, morfologia cellulare, e per determinare i parametri clinicamente rilevanti come il tipo di malignità, grado di tumore, e la valutazione complessiva di infiltrazione immunitaria (Figura 2C). Nella sezione contigua II, due cicli di mIF sono stati utilizzati per etichettare le cellule zampenomie e patichymale del fegato (Figura 2A). Nel primo round, i vasi normali e tumorali sono stati visualizzati utilizzando la colorazione CD34 delle cellule endoteliali. Inoltre, le cellule epiteliali (epatociti e cholangiociti) sono state identificate utilizzando citokeratina 8/18, e le cellule epatiche epatiche attivate fibrogeni e cellule stellate epatiche sono state identificate come cellule alfa levigate di actin acumento positivo(Figura 2C). Dopo l’acquisizione dell’immagine, le sezioni tissutali sono state spogliate e riesaminate con anticorpi contro i macrofagi (CD68) e i miofibroblasti (desmin). Per caratterizzare meglio l’infiltrazione immunitaria del tumore, la sezione seriale III adiacente è stata macchiata utilizzando due cicli di mIF per i marcatori cellulari CD3, CD4, CD8, forcella P3 (FoxP3) e mieloperoxidase (MPO). In tutti i casi DAPI è stato utilizzato come una contromacchia nucleare. Infine, la sezione III è stata macchiata di macchie PSR e contrastata con verde veloce per visualizzare il collagene fibrillare e segmentare il tessuto in stroma e parenchyma (Figura 2C). Un intero scanner scorrevole dotato di obiettivo 20X è stato utilizzato per digitalizzare le sezioni colorate e per creare diapositive virtuali. Sono state acquisite sei immagini dalle tre sezioni seriali (Figura 2B) e le diapositive virtuali successivamente analizzate utilizzando il software VIS secondo la rappresentazione schematica nella Figura 1. Analisi dell’immagineL’analisi dell’immagine comprendeva cinque fasi: 1) allineamento dei tessuti; 2) rilevamento dei tessuti; 3) segmentazione dei tessuti; 4) quantificazione automatizzata dei COI; e 5) mappatura del calore dei tessuti. Tutti i protocolli per l’analisi delle immagini sono stati sviluppati utilizzando il modulo Author del software di analisi delle immagini e sono indicati nel testo come APP. Allineamento dei tessutiSei diapositive virtuali da tre sezioni seriali, che coprono 11 marcatori più macchie H&E e PSR, sono state caricate nel modulo Tissualign del software di analisi delle immagini. Successivamente, le immagini sono state collegate, allineate e registrate in modo automatizzato, generando un 11-plex più H&E e PSR immagine composita virtuale, contenente tutti i livelli delle singole immagini (Figures 2A–C). L’allineamento era accurato nel caso di immagini provenienti da sezioni seriali adiacenti, che mostravano le corrispondenti strutture tissutali posizionate e disposte in modo omologato al momento dell’allineamento(Figura 2C e Figura S1A). Inoltre, l’allineamento era preciso a livello di singola cella per le immagini provenienti dalla stessa sezione (Figura S1B). Il tempo per l’allineamento automatico dipende dal numero, dalle dimensioni, dalla complessità e dalla somiglianza delle immagini da allineare. L’allineamento delle suddette sei diapositive virtuali ha richiesto 15 min nella nostra stazione VIS. Figura 2: colorazione delle sezioni del tessuto seriale e allineamento dell’immagine. (A) Riepilogo delle colorazioni effettuate su tre sezioni seriali per la visualizzazione di CO e TC. I numeri tra parentesi indicano la designazione dell’immagine. Per le sezioni II e III, i tessuti sono stati spogliati e risondati con un secondo cocktail di anticorpi. (B) Panoramica di sei singole immagini di tessuti interi prima e dopo l’allineamento dei tessuti (rispettivamente a sinistra e a destra). Barra della scala – 3.500 m. (C) Vista ingrandita delle immagini allineate. Barra di scala : 80 m. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Rilevamento dei tessutiUna volta che le immagini sono state collegate e allineate, abbiamo cercato di identificare i TAP (Figura 3A). Per progettare un APP per il rilevamento automatico dei TAP (APP 1, tabella 1), abbiamo sfruttato due proprietà che differenziano i TAC dai pixel non associati al tessuto. In primo luogo, il segnale DAPI (banda blu) è limitato ai nuclei, che si trovano esclusivamente nel tessuto, il che significa che tutti i pixel DAPI sono un sottoinsieme di TAP. In secondo luogo, i TAP hanno un segnale di autofluorescenza più elevato nelle bande verdi e gialle rispetto ai pixel non associati al tessuto. Di conseguenza, abbiamo sviluppato l’APP 1 per il rilevamento dei tessuti (Tabella 1),che rileva i TAP in base al segnale di base in questi canali utilizzando semplici tecniche di soglia. Le soglie per le bande blu, verde e gialla erano impostate in modo che i TAP avessero valori di intensità dello sfondo superiori alle soglie, mentre i pixel non associati al tessuto avevano valori inferiori. App 1 per il rilevamento dei tessuti è stato applicato all’immagine IIA, che contiene i livelli nei canali blu, verde e giallo (Figura 3A). Come output di APP 1, una maschera verde brillante è stato posto sulla parte superiore dei TAP, e un ROI chiamato “Tissue” è stato delineato (output, Figura 3A). Inoltre, l’area del tessuto è stata determinata come variabile di output quantitativa. Poiché l’APP 1 non incorpora i pixel non associati al tessuto nel tessuto ROI, sono stati esclusi dall’analisi successiva basata su questo ROI (Figura 3A). La precisione dell’APP 1 con l’identificazione dei TAP è illustrata nella Figura 3A. Segmentazione dei tessuti e delineazione dei ROI per i TCSuccessivamente, abbiamo proceduto a definire diversi compartimenti all’interno del tessuto ROI segmentando il tessuto in stroma rispetto al parenchyma. Abbiamo usato l’immagine macchiata PSR (IIIC, Figura 2C), dove lo stroma può essere definito come l’area associata alla deposizione di collageni fibrillari (banda rossa), il parenchyma come l’area in cui i collageni fibrillari sono assenti, e prevale il rapido colorante verde (banda verde) (Figura 3B). Abbiamo creato l’APP 2 (Tabella 1) per delimitare digitalmente i TC Stroma e Parenchyma. Questa APP funziona sul tessuto ROI predefinito (output, Figura 3A) e utilizza aree rinromatiche e parenchyma rappresentative per la formazione dello strumento Classificatore integrato nel modulo Analisi immagine. Il Classificatore addestrato assegna i pixel a uno stroma o a un’etichetta di parenchyma (salmone e verde, rispettivamente, Figura 3B). Al momento della classificazione dei pixel, APP 2 ha eseguito operazioni morfologiche con l’obiettivo di definire i ROIs Stroma e Parenchyma(Figura 3B e Tabella 1). Le prestazioni di APP 2 per classificare i pixel e generare i rispettivi ROI sono mostrate nella Figura 3B. Inoltre, APP 2 quantifica l’area dello stroma e del parenchyma. Infine, anche se la segmentazione viene effettuata utilizzando la sezione macchiata PSR, le regioni stroma e parenchyma delineate possono essere trasferite a qualsiasi immagine allineata all’immagine PSR. Figura 3: Rilevamento/segmentazione automatizzata dei tessuti e generazione di ROI. (A) L’immagine IIA è stata utilizzata per identificare i TAP (immagine a sinistra, barra della scala – 6.000 m). Una maschera verde brillante è stata assegnata ai TAP utilizzando APP 1 (Tabella 1) generando un ROI chiamato Tissue (output 1). A destra, l’inserimento mostra una visualizzazione ingrandita che dimostra la precisione dell’APP 1 al rilevamento dei TAP. Barra di scala : 350 m. (B) Il tessuto ROI (output 1) è segmentato in stroma e parenchyma utilizzando l’APP 2. L’immagine a sinistra mostra una vista del tessuto ROI segmentato in ROI stroma (salmone) e parenchyma ROI (verde). Barra della scala: 4.500 m. Sulla destra, le viste ingrandite dell’insetto per il tessuto ROI, la colorazione PSR originale (immagine IIIC), e i ROI stroma e parenchyma. Barra della scala: 250 m. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Quantificazione automatizzata dei COISuccessivamente, abbiamo proceduto a identificare, individuare e quantificare i COI nei ROI Stroma e Parenchyma. I PAP da 3 a 8 (Tabella 1) sono stati creati per individuare e contare i seguenti COI: cd4 , FoxP3 , CD8 , CD68 , MMO , le celle SMA e CD34 . App 3 è stato progettato per individuare e contare le celle CD4-FoxP3 (immagine IIIA, Figura 2C) come marcatori surrogati di cellule T regolatorie (Tregs). Questo protocollo rileva la co-localizzazione del segnale dal fattore di trascrizione nucleare FoxP3 (banda rossa) e dal colorante di etichettatura del DNA DAPI (banda blu). Dato che le cellule T attivate di recente upregulate FoxP3, per arricchire per Tregs abbiamo impostato soglie per preselezionare solo le celle brillanti FoxP3 (FoxP3hi). Successivamente, tra tutte le cellehi preselezionate daPI-FoxP3, solo quelle che erano circondate da segnali CD4 a forma di anello (banda verde) sono state etichettate e conteggiate come celle FoxP3hiCD4 (etichetta rosa, Figura 4A). La densità delle celleFoxP3 hiCD4 nelle classi ROM e Parenchyma sono state determinate come variabili di output quantitative di APP 3 (Figura 4A). Allo stesso modo, gli IP da 4 a 6 sono stati progettati per il rilevamento di celle CD8, CD68 e MPO. Questi API condividono la stessa progettazione di base per rilevare e quantificare i COI. In particolare, i COI vengono identificati in base all’intensità del segnale proveniente dal biomarcatore specifico della popolazione cellulare, quindi vengono eseguiti diversi passaggi morfologici post-elaborazione per delineare le singole cellule(tabella 1). Le singole cellule o COI sono etichettate, conteggiate e le relative coordinate tissutali registrate. Le API da 4 a 6 determinano anche la densità dei COI nei ROI Stroma e Parenchyma(Figura 4B–D). La qualità della nostra colorazione DAPI non era sufficiente per integrare la segmentazione dei nuclei nei PAP da 3 a 6, quindi non possiamo garantire che tutti gli oggetti etichettati singolarmente siano singole cellule. Per questo motivo, è stata espressa la densità delle celle nei conteggi di oggetti etichettati/mm2 (Figura 4). Tuttavia, le aggregazioni cellulari sono state separate con successo in singole celle nelle fasi di post-elaborazione integrate in APP da 3 a 6, e un’ampia ispezione visiva ha mostrato che la maggior parte degli oggetti etichettati corrispondeva a singole celle. Per rilevare l’area SMA e CD34, abbiamo sviluppato rispettivamente gli APP 7 e 8 (Tabella 1). Entrambi gli APP rilevano il segnale specifico in base alle soglie e determinano la percentuale di area positiva nei ROIs Stroma e Parenchyma(Figura 4E-F). Una delle possibilità più interessanti di generare diapositive multiplex virtuali è l’analisi dell’espressione di colocalizzazione. Abbiamo generato l’APP 10 per rilevare la colocalizzazione tra la SMA e la desmin, due marcatori co-espressi dai miofibroblasti nel fegato. App 10 utilizza soglie per la ricerca di pixel positivi per i file di tipo SMA, desmin e SMA più desmin (tabella 1). Come variabili di output quantitative, APP 10 determina l’area di SMA, l’area desmin e l’area di espressione colocalizzata di questi due marcatori (Figura S3). Figura 4: Identificazione e quantificazione dei COI nei TC stroma e parenchyma. (A–F) Rilevamento e quantificazione automatizzati dei COI di CD4, FoxP3, CD8, CD68, MPO e CD34 nei COI Stroma e Parenchyma utilizzando i protocolli rispettivamente 3, 4, 5, 6, 7 e 8 (Tabella 1). A sinistra sono mostrate le immagini originali, al centro le immagini elaborate e a destra le quantificazioni. Per le figure 4A-D, barra di scala : 40 m. Per le figure 4E e F, barra di scala 350 m. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. In alternativa alla quantificazione dei COI nei TC Stroma e Parenchyma, abbiamo determinato la densità delle cellule immunitarie nei diversi noduli maligni denominati da 1 a 4 (Figura 5A, He I). Il ROI per ogni nodulo è stato delineato manualmente come indicato nella figura 5A. Le firme immunitarie distintive dei tessuti hanno caratterizzato ogni nodulo, rivelando ulteriormente l’eterogeneità intrinseca del TME. Mappe di calore dei tessutiCome accennato in precedenza, gli APP da 3 a 8 memorizzano le coordinate del tessuto di ogni oggetto etichettato individualmente. Questa funzione consente la generazione automatizzata di mappe tissutali in cui le regioni ad alta densità di una determinata popolazione cellulare vengono visualizzate come hot spot (rosso) e regioni con densità relativamente bassa come punti freddi (blu scuro). Ai valori di densità intermedi vengono assegnati i colori in base alla scala dei colori illustrata nella figura 5. Le mappe di calore dei tessuti sono state generate da APP che dividevano le immagini in cerchi di 50 m di diametro e gli fu assegnato un colore in base alla densità relativa di un determinato COI all’interno del cerchio. Come mostrato nella Figura 5B-G, i modelli di posizionamento e la distribuzione di intensità dei diversi COI nel TME erano piuttosto vari. Inoltre, a livello di noduli individuali, la disposizione di diverse popolazioni nell’area tissutale era unica (Figura S2A–C). Per fornire un esempio della potenza di questa tecnica e per visualizzare l’organizzazione spaziale di hot spot provenienti da diverse popolazioni nello stesso nodulo, gli hot spot dei singoli tipi di cellule sono stati estratti manualmente e mappati insieme sul contorno del nodulo 2 (Figura S2, Figura De Figura E). Figura 5: Mappe di calore dei tessuti di COI nel TME. (A) Colorazione rossa picrosirius che mostra la posizione dei noduli 1, 2, 3 e 4. (B–G) Mappe di calore dei tessuti rispettivamente per CD4, FoxP3, CD8, CD68, MPO, CD34 e SMA. Il blu scuro indica una densità relativamente bassa, e il rosso indica un’alta densità relativa. Ai valori di densità intermedi vengono assegnati i colori in base alla scala dei colori mostrata. (H e I) Quantificazione dei COI nei noduli 1, 2 e 3 – 4 organizzati rispettivamente per tipo di cellula e per nodulo. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura supplementare S1: Convalida dell’allineamento dei tessuti. (A) La colorazione CD34 (in rosso) eseguita sulla sezione II (ingresso 1) viene utilizzata per generare una maschera CD34 in verde (output 1). La maschera verde (output 1) è sovrapposta all’immagine H&E della sezione seriale allineata I (ingresso 2). L’immagine di fusione mostra una perfetta corrispondenza delle strutture vascolari. Barra della scala: 50 m. (B) Immagine IIIA che mostra l’unione di DAPI, CD4 e FoxP3 (ingresso 1) è stato utilizzato per generare un’etichetta per le celle CD4-FoxP3 (output 1 in magenta). L’etichetta Output 1 è stata trasferita sull’immagine allineata IIIB (ingresso 2) e mostra una corrispondenza perfetta tra le coppie FoxP3/DAPI e CD4/CD3 nell’immagine di unione. Barra della scala: 15 m. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura supplementare S2: Vista ingrandita delle mappe di calore dei tessuti. (A–C) Mappe di calore dei tessuti per le celle CD4-FoxP3, CD8, CD68 e MPO’ in noduli 1–4. Le barre della scala nei noduli 1, 2 e 3 e 4 rappresentano rispettivamente 1.500 m, 700 m e 500 m. (D) Contorno del nodulo 2 con linea continua nera. (E) Gli spot caldi per le celle CD4-FoxP3, CD8, CD68 e MPO’ nel nodulo 2 sono stati estratti e mappati insieme sul profilo del nodulo 2 definito in D. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura supplementare S3: Analisi della colocalizzazione. (A) Sulla sinistra e al centro si trovano le immagini dell’etichetta SMA in verde e dell’etichetta desmin rispettivamente in rosso. Sulla destra c’è un’area doppia positiva SMA/desmin in giallo. (B) Quantificazione dell’area di SMA, dell’area di desmin e dell’area doppia di SMA/desmin. Barra della scala: 150 m. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. App Scopo Classificazione Classificazione Passaggi di post-elaborazione Variabili di output Metodo Caratteristiche (valore pixel) 1 Rilevamento dei tessuti Soglia Canale DAPI (150) o Etichettare gli oggetti con valori colocalizzati al di sopra della soglia per i 3 canali o Tessuto ROI Canale FITC/A488 (120) o Chiudere l’oggetto positivo 5 pixel o Area dei tessuti Canale TRITC/A568 (40) o Creare tessuto ROI 2 Segmentazione dei tessuti Foresta decisionale Mediana RGB-R o Fori di riempimento o ROI Stroma Mediana RGB-G o Creare RoI Stroma o Area Stroma Mediana RGB-B o Creare ROI Parenchyma o ROI Parenchyma Mediana IHS-S o Area Parenchyma Mediana H&E Eosin 3 Per individuare e quantificare le celle CD4 FoxP3 Soglia Canale DAPI (>600) o Etichetta oggetti con colocalizzazione di DAPI e Cy5/A647, circondati dal segnale FITC/A488 o Conteggi e densità delle cellule CD4-FoxP3 in ROIs Stroma e Parenchyma Canale FITC/A488 poli arrotondamento (>850) o Cancellare gli oggetti di dimensioni inferiori a 7 m2 o Coordinate di singole celle CD4-FoxP3 Canale Cy5/A647(>800) 4 Per individuare e quantificare le celle CD8 Soglia Canale DAPI (<1200) o Cancellare gli oggetti positivi di dimensioni inferiori a 15 m2 o Conteggi e densità delle cellule CD8 in ROIs Stroma e Parenchyma Canale Cy5/A647 mediana (>80) o Chiudere oggetti positivi 2 pixel o Coordinate di singole celle o Separare gli oggetti 5 Per individuare e quantificare le celle CD68 Soglia Canale FITC/A488 (>200) o Cancellare gli oggetti positivi di dimensioni inferiori a 20 m2 o Conteggi e densità delle cellule CD68 in ROIs Stroma e Parenchyma o Dilataro oggetti positivi 3 pixel o Coordinate di singole celle CD68 o Separare gli oggetti 6 Per individuare e quantificare le celle MPO Soglia Canale DAPI (>400) o Cancellare gli oggetti di dimensioni inferiori a 5 m2 o Conteggi e densità delle cellule di MPO in ROIs Stroma e Parenchyma. Canale TRITC/A568 (900-4000) o Dilatare 3 pixel oggetti positivi o Coordinate di singole celle MPO. o Separare gli oggetti 7 Per individuare e quantificare l’area di SMA Soglia Canale TRITC/CF568 (>1050) o Cancellare gli oggetti positivi di dimensioni inferiori a 25 m2 o Conteggi e densità dell’area sMA in ROIs Stroma e Parenchyma o Dilatare 3 pixel oggetti positivi o Coordinate dei pixel di SMA 8 Per individuare e quantificare l’area CD34 Soglia Canale DAPI (<5000) o Cancellare gli oggetti positivi di dimensioni inferiori a 25 m2 o Conteggi e densità dell’area CD34 in ROIs Stroma e Parenchyma Canale Cy5/A647 mediana (>120) o Dilatare 3 pixel oggetti positivi o Coordinate di CD34 x pixel 9 Creare mappe di calore dei tessuti per una determinata popolazione cellulare Mappa termica dell’oggetto Mappa termica dell’oggetto o Mappa di calore Raggio di disegno 50 m — 10 Quantificare la colocalizzazione tra SMA e Desmin Soglia Canale TRITC (CF568) (>1050) o Etichettare gli oggetti con valori di soglia superiori per TRITC (CF568) o Quantificare l’espressione colocalizzata di SMA e Desmin Canale Cy5 (A647) (>1000) o Etichettare gli oggetti con valori di soglia superiori per Cy5 (A647) o Etichettare gli oggetti con colocalizzazione di valori di soglia superiori per TRITC (CF568) e Cy5 (A647) o Cancellare gli oggetti positivi di dimensioni inferiori a 25 m2 Tabella 1: Parametri generali utilizzati per la progettazione di API impiegati per l’analisi delle immagini. I parametri specificati in questa tabella sono adattati alle caratteristiche uniche delle immagini utilizzate in questa analisi (ad esempio, sfondo, artefatti, ecc.) e potrebbero non essere applicabili ad altre immagini. Poiché i passaggi di post-elaborazione menzionati sono stati definiti per le immagini specifiche analizzate in questo studio, non sono intenzionalmente dettagliate. L’utente deve personalizzare i PIP in base alle immagini da analizzare. Sezione/Colorazione Anticorpo primario Anticorpo secondario Sezione II/1st Colorazione Mouse IgG2a anti-umano SMAMouse IgG1 anti-umano CD34Coniglio anti-umano Cytokeratin 8/18 Capra anti-topo IgG2a CF568Ratto anti-topo IgG1 A647Asino anti-coniglio A488 Sezione II/2nd Colorazione Coniglio anti-umano DesminMouse anti-umano CD68 Asino anti-coniglio A647Antitoa d’asino DyLight 755 Sezione III/1st Colorazione Mouse anti-umano CD4Coniglio anti-umano FoxP3Capra anti-umano MPO A488 antitamaAsino anti-coniglio A647Asino anti-capra A568 Sezione III/2nd Colorazione Coniglio anti-umano CD3Mouse anti-umano CD8 Antitoa d’asino DyLight 755Asino anti-coniglio A647 Tabella 2: Coppie anticorpi primarie-secondarie per mIF.

Discussion

Sono necessarie tecniche semplici, accessibili e facili da eseguire di multiplexing che consentano la risoluzione spaziale delle cellule immunitarie nelle sezioni tissutali per mappare il paesaggio immunitario nel cancro e in altri disturbi immunologici. In questo caso, descriviamo una strategia che integra ampiamente disponibili tecniche di etichettatura e analisi digitale per espandere la capacità di multiplexing e la valutazione multidimensionale dei saggi di imaging12,13,17,19. La colorazione di tre sezioni seriali per diversi marcatori, e il riutilizzo delle sezioni attraverso tecniche di stripping e rialimentazione, ci ha permesso di visualizzare 11 parametri oltre alle macchie H&E e PSR. Sei immagini di queste sezioni sono state allineate in modo automatizzato utilizzando il modulo di allineamento dei tessuti. L’allineamento è stato preciso a livello di singola cellula per le immagini provenienti dalla stessa sezione e altamente concordante per le immagini provenienti dalle sezioni vicine. Il multiplexing virtuale ci ha permesso di determinare in che modo i marcatori visualizzati in una sezione si relazionano spazialmente ai marcatori visualizzati in un’altra sezione contigua. Mentre alcune delle colorazioni etichettavano COI, altri etichettavano i CC, permettendoci di quantificare i COI nei diversi televisori. L’uso di strumenti software per la quantificazione automatizzata dei COI ha notevolmente semplificato e accelerato l’elaborazione delle immagini. Inoltre, l’analisi digitale è stata applicata a intere sezioni di tessuto invece di campi visivi selezionati, con conseguente rappresentazione imparziale del TME. Inoltre, poiché le coordinate tissutali dei COI sono state registrate, è stato possibile generare mappe di calore dei tessuti.

In questo protocollo possono essere necessarie diverse aree in cui potrebbe essere necessaria la risoluzione dei problemi. In primo luogo, un recupero scarso dell’antigene può influire sulla qualità del mIF, pertanto il tipo di buffer e durata di recupero dell’antigene dovrebbe essere ottimizzato per le condizioni specifiche di analisi/biomarcatore utilizzate. In secondo luogo, il tipo di soluzione di blocco utilizzata dovrebbe essere adattato ai tessuti/antigeni/specie di anticorpi primari e secondari. Nelle nostre mani, l’aggiunta del 10% di siero totale dalle specie in cui il tessuto proviene dai recettori Fc bloccati, e quindi ha ridotto il legame di anticorpi non specifici. L’aggiunta del 10% del siero delle specie in cui sono stati allevati gli anticorpi secondari ridurrebbe al minimo l’attaccamento non specifico diretto degli anticorpi secondari alla sezione del tessuto. In terzo luogo, è essenziale la convalida della specificità degli anticorpi primari e secondari utilizzando i controlli positivi e negativi appropriati. Quarto, una maggiore autofluorescenza in alcuni canali e la diffusione di DAPI su stripping anticorpale primario sono anche comuni. Per affrontare l’autofluorescenza migliorata, abbiamo usato coppie di anticorpi primari/secondari in cui il segnale specifico aveva valori di intensità almeno 5 volte quello dello sfondo. Infine, alcuni anticorpi ad alta affinità non possono essere eluiti con procedure di stripping regolari. In questo caso, si consiglia di utilizzare tali anticorpi nell’ultimo ciclo di etichettatura. L’utente potrebbe dover provare diverse sequenze di colorazione per trovare la configurazione ottimale per gli anticorpi di interesse. L’efficienza dello stripping deve essere confermata prima di procedere ad un secondo o terzo ciclo di etichettatura.

La principale limitazione e sfida di questa strategia consiste nel trovare le giuste combinazioni di anticorpi fluorescenti primari e secondari per i marcatori di interesse. Trovare anticorpi primari allevati in specie diverse o con diversi isotipi che potrebbero essere utilizzati simultaneamente è limitato da ciò che è disponibile in commercio. La maggior parte degli scanner per diapositive interi sono dotati di lampade e filtri che consentono l’imaging di un massimo di cinque canali, e gli anticorpi secondari nella specie giusta e il fluoroforo destro non sono sempre disponibili. Abbiamo parzialmente superato queste limitazioni utilizzando macchie seriali ed etichettatura sequenziale. Diverse combinazioni di anticorpi potrebbero essere necessario testare per arrivare alla migliore combinazione per i marcatori di interesse. Un’altra limitazione è la qualità della colorazione DAPI, perché lo stripping e la richiamata potrebbero non sempre consentire l’esecuzione della segmentazione dei nuclei.

Il modulo tissue align richiede una formazione minima e nessuna abilità di programmazione da parte degli utenti. Il software permette teoricamente l’allineamento di un numero illimitato di immagini. Tuttavia, l’allineamento preciso dipende dalla parentela delle sezioni, in cui le sezioni più vicine che sono più istologicamente concordanti sono più accuratamente allineate. Abbiamo usato il modulo Autore di VIS per generare le PA. La conoscenza di base dell’analisi delle immagini è necessaria per la creazione di APP, ma questo è ugualmente il caso quando si utilizza qualsiasi altro software di analisi delle immagini. I vantaggi unici di VIS rispetto ad altri software di analisi delle immagini includono l’allineamento automatico delle immagini da sezioni preparate utilizzando diversi metodi (ad esempio, IF, istochimica, IHC). Ciò consente studi di co-localizzazione di più marcatori di interesse utilizzando il multiplexing virtuale. Inoltre, la progettazione flessibile e intuitiva delle APP consente una personalizzazione specifica dell’utente. La quantificazione e la mappatura automatizzate, e la possibilità di elaborare sezioni intere del tessuto, consente di risparmiare tempo e riduce la distorsione rispetto al conteggio manuale mediante ispezione visiva.

Questa strategia è uno strumento di ricerca molto utile per l’immunologia tissutale nel contesto del cancro e dell’autoimmunità, ma rimane non convalidata per uso clinico. Con ulteriore standardizzazione e convalida, può essere utilizzato in futuro per più applicazioni (ad esempio, per mappare il paesaggio immunitario nel cancro per prevedere e monitorare la risposta agli agenti immunoterapeutici). Può anche essere adattato a diverse condizioni infiammatorie (ad esempio, malattia infiammatoria intestinale) per combinare la valutazione patologica con biomarcatori prognostici.

I principali passaggi critici di questo protocollo sono l’efficienza/specificità dell’etichettatura e la robustezza dei PA progettati per l’uso o il biomarcatore previsto. Pertanto, la convalida regolare mediante ispezione visiva, soprattutto dopo la progettazione di una nuova APP, è essenziale. L’uso efficiente di più cicli di stripping e riprobing o diversi tipi di macchie sulla stessa sezione sono componenti critici e possono essere specifici del tessuto o della sezione. Verificare l’efficienza di tali processi prima di procedere con l’analisi batch di grandi dimensioni è fondamentale.

In sintesi, forniamo una strategia che massimizza le informazioni quantitative e spaziali che possono essere ottenute da preziosi campioni di tessuto clinico. Le risorse, le attrezzature e le conoscenze necessarie per implementare questa metodologia sono ampiamente accessibili. Proponiamo questa metodologia come utile guida per la pianificazione dei saggi che mirano a identificare, quantificare e mappare le popolazioni di cellule immunitarie nel TME.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ringraziamo il partecipante allo studio. Ringraziamo Louise Rousseau, coordinatrice della biobanca HBP per il recupero dei campioni di tessuto e di tutte le informazioni cliniche associate. Riconosciamo la patologia molecolare e le strutture centrali di imaging cellulare presso il CRCHUM e Michael Persch di Visiopharm per un’eccellente assistenza tecnica. Finanziamento: Questo studio è stato sostenuto da sovvenzioni della Canadian Liver Foundation, Fonds de recherche du Québec-Santé (FRQS) AIDS and Infectious Disease Network (Réseau SIDA-MI), e della Canadian Network on Hepatitis C (CanHepC). CanHepC è finanziato da un’iniziativa congiunta del Canadian Institutes of Health Research (CIHR) (NHC-142832) e dell’Agenzia per la sanità pubblica del Canada. M.F.M. ha ricevuto borse di studio dall’Università di Montréal, Bourse Gabriel Marquis e dal FRQS. T.F. ha ricevuto borse di dottorato da CIHR e CanHepC. S.T. detiene la sedia Roger-Des-Groseillers in chirurgia oncologica epatica e pancreatica, Université de Montréal.

Contributi degli autori: M.F.M. ha progettato, eseguito esperimenti e analizzato i dati. T.F. ha progettato esperimenti. A.C-B. fornito guida tecnica. G.S. ha eseguito tutta la valutazione patologica del soggetto dello studio e ha fornito input su tutti gli aspetti patologici. L.M. ha eseguito la colorazione H&E, ottimizzato ed eseguito l’acquisizione di immagini. M.N.A. ha eseguito la macchia PSR e ha fornito un prezioso contributo tecnico. N.B. ha contribuito all’analisi dell’immagine. S.T. è il principale investigatore della biobanca HBP ed è responsabile della supervisione del funzionamento complessivo della biobanca. Ha anche fornito un contributo inestimabile su tutti gli aspetti del progetto e sulle sue implicazioni cliniche. M.F.M, T.F.e N.H.S. concettualizzarono e progettarono lo studio. N.H.S. supervisionò il lavoro e ottenne finanziamenti. M.F.M., T.F., A.C-B e N.H.S. hanno scritto il manoscritto. Tutti gli autori hanno esaminato e approvato il manoscritto.

Materials

Antigen Retrieval Solution: Sodium Citrate Buffer (10 mM Sodium Citrate, 0.05% v/v Tween 20, pH 6.0)
Blocking Solution: 1 % BSA, 10 % filtered human serum, 10 % filtered donkey serum, 0.1 % Tween 20, and 0.3% Triton in PBS
Bovine serum albumin (BSA) Multicell 800-095-EG
Coplin jars (EASYDIP SLIDE STAINING SYSTEM) Newcomersupply 5300KIT
Cover slides Fisherbrand 12-545E 22*50
Direct Red 80 Sigma Aldrich 365548
Donkey Serum Sigma Aldrich D9663
Ethanol 100%
Electric pressure cooker Salton
Eosin Leica Biosystems 3801600 CAUTION, eye irritation
Fast Green FCF Sigma Aldrich F7252 CAUTION, harmful by inhalation, ingestion and skin absortion
FFPE section (4μm) slides
Glycine 0,1 M in PBS
Hematoxylin Stain Solution, Gil 1. Formulation, Regular Strength Ricca Chemical Company 3535-32
Holder (EasyDip Staining Jar Holder) Newcomersupply 5300RK
Human Serum Gemini 22210
Humidity chamber Millipore Sigma Z670138-1EA
Pap pen abcam ab2601
PBS
PBS-Tween 20 (0.1% v/v)
Permount Mounting Media Fisher Chemical SP15-500
Picric Acid 1.3 % Sigma Aldrich P6744 CAUTION, skin and eye irritation
Picro-Sirius Red/Fast Green solution: Fast Green 0.1 % w/v + Sirius Red 0.2 % w/v in 1,3 % picric acid solution
Primary Antibody Anti-αSMA Mouse IgG2a 1A4 Sigma A2547 Dilution 1/100
Primary Antibody Anti-CD34 Mouse IgG1 HPCA1/763 Novus Biologicals NBP2-44568 Dilution 1/250
Primary Antibody Anti-Cytokeratin 8/18 Rabbit EP17/EP30 Agilent IR09461-2 Ready to use
Primary Antibody Anti-CD68 Mouse KP1 Abcam ab955 Dilution 1/200
Primary Antibody Anti-Desmin Rabbit Polyclonal Invitrogen PA5-16705 Dilution 1/200
Primary Antibody Anti-CD4 Mouse N1UG0 Affymetrix 14-2444 Dilution 1/250
Primary Antibody Anti-FoxP3 Rabbit 1054C R & D MAB8214 Dilution 1/100
Primary Antibody Anti-MPO Goat Polyclonal R & D Systems AF3667 Dilution 1/250
Primary Antibody Anti-CD3 Rabbit SP7 Abcam ab16669 Dilution 1/200
Primary Antibody Anti-CD8 Mouse C8/144B Invitrogen 14-0085-80 Dilution 1/200
Secondary Antibody Donkey anti-mouse A488 Polyclonal Invitrogen A-21202 Dilution 1/500
Secondary Antibody Donkey anti-Rabbit A488 Polyclonal Invitrogen A-21206 Dilution 1/500
Secondary Antibody Donkey anti-goat A568 Polyclonal Invitrogen A-11057 Dilution 1/500
Secondary Antibody Donkey anti-rabbit A647 Polyclonal Invitrogen A-31573 Dilution 1/500
Secondary Antibody Rat anti-mouse IgG1 A647 RMG1-1 Biolegend 406618 Dilution 1/500
Secondary Antibody Goat anti-mouse IgG2a CF568 Polyclonal Sigma Aldrich SAB4600315 Dilution 1/500
Secondary Antibody Donkey anti-mouse DyLight 755 Polyclonal Invitrogen SA5-10171 Dilution 1/500
Secondary Antibody Donkey anti-rabbit DyLight 755 Polyclonal Invitrogen SA5-10043 Dilution 1/500
SDS BioShop SDS001,500 CAUTION, oral skin and eye toxicity
Shandon multi-program robotic slide stainer LabX 11384903
Shandon Xylene Substitute, Thermo Fisher Scientific CA89413-336 CAUTION, Flammable, skin and eye irritation, Harmful when inhaled
Shaking water bath
SlowFade Gold antifade reagent with DAPI Invitrogen S36938
Sodium Citrate Dihydrate Millipore Sigma 1545801 CAUTION, eye irritation
Stripping Buffer: mix 20 ml 10% w/v SDS with 12.5 ml 0.5 M Tris-HCl (pH 6.8), and 67.5 ml ultra-pure water. Under a fume hood, add 800 uL of 2-mercapto ethanol (114,4 mM final concentration)
Triton X-100 Sigma Aldrich T8787-50ML
Tris-HCl BioShop 77-86-1
Tween 20 Fisher Scientific BP337-500
VIS Software Visiopharm
Whole slide scanner Olympus BX61VS Olympus Microscope: Olympus Slide Scanner BX61VS, 5 slides scanner, motorized stage, autofocus. Camera: Lightsource: Xcite-120. Filters: BrightLine® Sedat filter set (# LED-DA/FI/TR/Cy5-4X4M-B-000, Semrock)
Xylene Sigma Aldrich 214736-4L CAUTION, Flammable, skin and eye irritation, Harmful when inhaled
Xylene : Ethanol solution (1:1 v/v)
2-mercaptoethanol Sigma M6250 CAUTION, harmful by ingestion, inhalation, fatal if sking absortion. Eye irritation. Use fume hood
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Immune Cell PopulationsTumor MicroenvironmentImmunotherapyAntigen RetrievalAntibody StainingImage AnalysisAnti-tumor Response

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Flores Molina, M., Fabre, T., Cleret-Buhot, A., Soucy, G., Meunier, L., Abdelnabi, M. N., Belforte, N., Turcotte, S., Shoukry, N. H. Visualization, Quantification, and Mapping of Immune Cell Populations in the Tumor Microenvironment. J. Vis. Exp. (157), e60740, doi:10.3791/60740 (2020).
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