Hier beschrijven we een eenvoudige en toegankelijke strategie voor het visualiseren, kwantificeren en in kaart brengen van immuuncellen in formaline-vaste paraffine-ingebedde tumorweefselsecties. Deze methodologie combineert bestaande beeldvormings- en digitale analysetechnieken met als doel de multiplexingcapaciteit en multiparameteranalyse van beeldvormingstesten uit te breiden.
Het immuunlandschap van de tumormicroomgeving (TME) is een bepalende factor in de progressie van kanker en de respons op de therapie. Met name de dichtheid en de locatie van immuuncellen in de TME hebben belangrijke diagnostische en prognostische waarden. Multiomic profiling van de TME heeft exponentieel toegenomen ons begrip van de talrijke cellulaire en moleculaire netwerken reguleren tumor initiatie en progressie. Deze technieken geven echter geen informatie over de ruimtelijke organisatie van cellen of celcelinteracties. Betaalbare, toegankelijke en eenvoudig uit te voeren multiplexingtechnieken die ruimtelijke resolutie van immuuncellen in weefselsecties mogelijk maken, zijn nodig als aanvulling op technologieën met een hoge doorvoer op basis van één cel. Hier beschrijven we een strategie die seriële beeldvorming, sequentiële etikettering en beelduitlijning integreert om virtuele multiparameterdia’s van hele weefselsecties te genereren. Virtuele dia’s worden vervolgens geautomatiseerd geanalyseerd met behulp van door de gebruiker gedefinieerde protocollen die identificatie, kwantificering en het in kaart brengen van celpopulaties van belang maken. De beeldanalyse wordt gedaan, in dit geval met behulp van de analysemodules Tissuealign, Auteur en HISTOmap. We presenteren een voorbeeld waarbij we deze strategie met succes toepasten op één klinisch monster, waarbij we de informatie die kan worden verkregen uit beperkte weefselmonsters maximaliseren en een onbevooroordeeldbeeld van de TME in de gehele weefselsectie bieden.
De ontwikkeling van kanker is het resultaat van een proces met wederzijdse interacties tussen kwaadaardige cellen en de TME. Anders dan tumorcellen, de TME is samengesteld uit niet-kwaadaardige cellen, stromalcellen, immuuncel populaties, en extracellulaire matrix (ECM)1. De ruimtelijke organisatie van de verschillende cellulaire en structurele componenten van het tumorweefsel en de dynamische uitwisseling tussen de kanker en naburige niet-kankercellen moduleren uiteindelijk tumorprogressie en reactie op therapie2,3,4. Het is aangetoond dat de immuunrespons bij kanker is spatiotemporally geregeld5,6. Verschillende immuuncelpopulaties die de neoplastische laesie en het aangrenzende weefsel infiltreren vertonen onderscheidende ruimtelijke distributiepatronen en gevarieerde activerings- en differentiatietoestanden die verband houden met verschillende functies (bijvoorbeeld pro- versus antitumor). Deze verschillende immuunpopulaties en hun parameters coevolve overuren met de tumor en de stromal compartimenten.
De opkomst van technologieën die multiomics profilering met één cel mogelijk maken, heeft ons begrip van de talrijke cellulaire en moleculaire netwerken die carcinogenese en tumorprogressie reguleren exponentieel vergroot. De meeste analytische hulpmiddelen met een hoge doorvoer vereisen echter weefselverstoring en isolatie van één cel, wat resulteert in verlies van informatie over de ruimtelijke organisatie van cellen en celcelinteracties7. Omdat de locatie en rangschikking van specifieke immuuncellen in de TME diagnostische en prognostische waarde hebben, zijn technologieën die ruimtelijke resolutie mogelijk maken een essentiële aanvulling op op één cellen gebaseerde immuunprofileringstechnieken.
Traditioneel zijn beeldvormingstechnieken zoals immunohistochemie (IHC) en multiplex immunofluorescentie (mIF) beperkt tot een klein aantal biomarkers die tegelijkertijd kunnen worden gevisualiseerd. Deze beperking heeft de studie van de spatiotemporale dynamiek van tumor-infiltrerende immuuncellen belemmerd, die meestal worden gedefinieerd door verschillende fenotypische markers. Recente ontwikkelingen op het gebied van beeldvorming en analytische tools hebben de mogelijkheden van multiplexing uitgebreid. Nieuwe op antilichamen gebaseerde etiketteringstechnologieën zoals histocytometrie en beeldvormingsmassacytometrie zijn gebruikt om tot 12 en 32 biomarkers ruimtelijk te scheiden, respectievelijk8,9. Massaspectrometrie beeldvorming, een techniek die geen etikettering vereist, heeft het potentieel om duizenden biomarkers tegelijk beeld in een enkel weefsel sectie10,11. Hoewel deze technieken hebben al aangetoond groot potentieel voor het ontleden van het weefsel immuun landschap bij kanker, ze gebruiken zeer geavanceerde en dure apparatuur en software en zijn niet gemakkelijk toegankelijk voor de meerderheid van de onderzoekers.
Als alternatief is het multiplexingvermogen van traditionele IHC en mIF uitgebreid door het gebruik van seriële beeldvorming, sequentiële rondes van etikettering en spectrale beeldvorming7,12,13,14,15,16. Deze technieken genereren meerdere afbeeldingen van dezelfde of van seriële weefsel secties die kunnen worden geconsolideerd in virtuele multiparameter dia’s met behulp van beeldanalyse software. Als gevolg hiervan neemt het aantal markers toe dat tegelijkertijd kan worden gevisualiseerd en geanalyseerd.
Hier stellen we een strategie voor het rationele ontwerp van weefselmultiplex-testen met behulp van commercieel beschikbare reagentia, betaalbare microscopie-apparatuur en gebruiksvriendelijke software (figuur 1). Deze methodologie integreert seriële beeldvorming, sequentiële multiplex etikettering, hele weefsel beeldvorming, en weefsel uitlijning om virtuele multiparameter dia’s die kunnen worden gebruikt voor geautomatiseerde kwantificering en mapping van immuuncellen in weefsel secties te genereren. Met behulp van deze strategie hebben we een virtuele dia gemaakt bestaande uit 11 biomarkers plus twee veelgebruikte histologische vlekken: hematoxyline en eosine (H&E) en picrosirius rood (PSR). Meerdere immuuncelpopulaties werden geïdentificeerd, gelokaliseerd en gekwantificeerd in verschillende weefselcompartimenten en hun ruimtelijke verdeling werd opgelost met behulp van weefselheatmaps. Deze strategie maximaliseert de informatie die kan worden verkregen uit beperkte klinische specimens en is van toepassing op formaline-vaste paraffine-embedded (FFPE) gearchiveerde weefselmonsters, met inbegrip van heel weefsel, kernnaaldbiopten en weefselmicroarrays. We stellen deze methodologie voor als een nuttige gids voor het ontwerpen van aangepaste testen voor identificatie, kwantificering en in kaart brengen van immuuncelpopulaties in de TME.
Eenvoudige, toegankelijke en eenvoudig uit te voeren multiplexing technieken die ruimtelijke resolutie van immuuncellen in weefselsecties mogelijk maken zijn nodig om het immuunsysteem landschap in kaart te brengen bij kanker en andere immunologische aandoeningen. Hier beschrijven we een strategie die op grote schaal beschikbare etikettering scan- en digitale analysetechnieken integreert om de multiplexingcapaciteit en multidimensionale beoordeling van beeldvormingstesten uit te breiden12,13,17,19. De kleuring van drie seriële secties voor verschillende markers, en het hergebruik van secties door middel van strippen en slijpen technieken, stelde ons in staat om 11 parameters te visualiseren in aanvulling op H & E en PSR vlekken. Zes beelden uit deze secties werden op een geautomatiseerde manier uitgelijnd met behulp van de weefseluitlijningsmodule. De uitlijning was nauwkeurig op het individuele celniveau voor afbeeldingen die afkomstig zijn van dezelfde sectie en zeer concordant voor afbeeldingen afkomstig van naburige secties. Virtuele multiplexing stelde ons in staat om te bepalen hoe markers gevisualiseerd in een sectie ruimtelijk betrekking hebben op markers gevisualiseerd in een andere aaneengesloten sectie. Terwijl sommige van de kleuringen gelabeld COI’s, anderen geëtiketteerd TCs, waardoor we COI’s kwantificeren in de verschillende tv’s. Het gebruik van softwaretools voor de geautomatiseerde kwanting van COI’s heeft de verwerking van beelden sterk vereenvoudigd en versneld. Bovendien werd digitale analyse toegepast op hele weefselsecties in plaats van op geselecteerde gezichtsvelden, wat resulteerde in een onbevooroordeelde weergave van de TME. Bovendien, omdat de weefselcoördinaten van COI’s werden geregistreerd, was het mogelijk om weefselheatmaps te genereren.
Er zijn verschillende gebieden in dit protocol waar het oplossen van problemen mogelijk nodig is. Ten eerste kan slecht antigeen ophalen de kwaliteit van mIF beïnvloeden, daarom moet het type antigeenterugwinningsbuffer en de duur worden geoptimaliseerd voor de specifieke test/biomarker-omstandigheden die worden gebruikt. Ten tweede moet het gebruikte type blokkeringsoplossing worden aangepast aan de weefsels/antigenen/soorten primaire en secundaire antilichamen. In onze handen, de toevoeging van 10% totaal serum van de soort waar het weefsel afkomstig is van geblokkeerde Fc receptoren, en dus verminderd niet-specifieke antilichaam binding. Toevoeging van 10% van het serum van de soort waarin de secundaire antilichamen werden gekweekt, zou de directe niet-specifieke hechting van secundaire antilichamen aan de weefselsectie minimaliseren. Ten derde is validatie van de specificiteit van de primaire en secundaire antilichamen met behulp van de juiste positieve en negatieve controles van essentieel belang. Ten vierde, verhoogde autofluorescentie in sommige kanalen en verspreiding van DAPI op primaire antilichaam strippen zijn ook gemeenschappelijk. Om de verbeterde autofluorescentie aan te pakken, gebruikten we primaire /secundaire antilichaamparen waarbij het specifieke signaal intensiteitswaarden had die ten minste 5x hoger waren dan de achtergrond. Ten slotte kunnen sommige hoge affiniteitsantilichamen niet worden geëlueerd met regelmatige stripprocedures. In dit geval raden we aan om dergelijke antilichamen te gebruiken in de laatste ronde van etikettering. De gebruiker kan hebben om verschillende kleuring sequenties proberen om de optimale configuratie voor de antilichamen van belang te vinden. De efficiëntie van het strippen moet worden bevestigd alvorens over te gaan tot een tweede of derde etiketteringsronde.
De belangrijkste beperking en uitdaging van deze strategie is het vinden van de juiste combinaties van primaire en secundaire fluorescerende antilichamen voor de markers van belang. Het vinden van primaire antilichamen die in verschillende soorten of met verschillende isotypes worden opgeheven die gelijktijdig zouden kunnen worden gebruikt, wordt beperkt door wat commercieel beschikbaar is. De meeste hele schuifscanners zijn uitgerust met lampen en filters die beeldvorming maximaal vijf kanalen mogelijk maken, en secundaire antilichamen in de juiste soorten en rechterfluorophore zijn niet altijd beschikbaar. We hebben deze beperkingen gedeeltelijk overwonnen met behulp van seriële kleuringen en sequentiële etikettering. Verschillende antilichaam combinaties kunnen nodig zijn om te worden getest om te komen tot de beste combinatie voor de markers van belang. Een andere beperking is de kwaliteit van de DAPI-kleuring, omdat strippen en terugdoening niet altijd het uitvoeren van kernensegmentatie mogelijk maken.
De weefsel align module vereist minimale training en geen programmeervaardigheden van gebruikers. De software maakt het theoretisch mogelijk om een onbeperkt aantal afbeeldingen uit te lijnen. Echter, precieze uitlijning is afhankelijk van de verwantschap van secties, waar nauwere secties die meer histologisch concordant zijn nauwkeuriger uitgelijnd. We gebruikten de author module van VIS voor het genereren van de APPs. Basiskennis van beeldanalyse is nodig voor het maken van APP’s, maar dit is ook het geval bij het gebruik van een andere beeldanalysesoftware. De unieke voordelen van VIS in vergelijking met andere beeldanalysesoftware omvatten geautomatiseerde uitlijning van afbeeldingen van secties die zijn voorbereid met behulp van verschillende methoden (bijvoorbeeld IF, histochemie, IHC). Dit maakt colokalisatie studies van meerdere markers van belang met behulp van virtuele multiplexing. Bovendien maakt het flexibele en gebruiksvriendelijke ontwerp van APP’s gebruikersspecifieke aanpassingen mogelijk. Geautomatiseerde kwantificering en mapping, en de mogelijkheid van het verwerken van hele weefselsecties, bespaart tijd en vermindert bias in vergelijking met handmatig tellen door visuele inspectie.
Deze strategie is een zeer nuttig onderzoeksinstrument voor weefselimmunologie in de context van kanker en auto-immuniteit, maar blijft ongevalideerd voor klinisch gebruik. Met extra standaardisatie en validatie kan het in de toekomst worden gebruikt voor meerdere toepassingen (bijvoorbeeld om het immuunlandschap bij kanker in kaart te brengen om de respons op immunotherapeutische middelen te voorspellen en te monitoren). Het kan ook worden aangepast aan verschillende ontstekingsaandoeningen (bijvoorbeeld inflammatoire darmziekte) om pathologische evaluatie te combineren met prognostische biomarkers.
De belangrijkste kritieke stappen in dit protocol zijn de efficiëntie/specificiteit van de etikettering en de robuustheid van de ontworpen APP’s voor het beoogde gebruik of biomarker. Daarom is regelmatige validatie door visuele inspectie, vooral bij het ontwerpen van een nieuwe APP, essentieel. Het efficiënte gebruik van meerdere rondes van strippen en afweeren of verschillende soorten vlekken op dezelfde sectie zijn kritische componenten en kan weefsel of sectie specifiek zijn. Het is van cruciaal belang om de efficiëntie van dergelijke processen te verifiëren voordat u verdergaat met een analyse van grote batchprocessen.
Samengevat bieden we een strategie die de kwantitatieve en ruimtelijke informatie maximaliseert die kan worden verkregen uit waardevolle klinische weefselmonsters. De middelen, apparatuur en kennis die nodig zijn om deze methodologie te implementeren zijn breed toegankelijk. We stellen deze methodologie voor als een nuttige gids voor het plannen van tests gericht op het identificeren, kwantificeren en in kaart brengen van immuuncelpopulaties in de TME.
The authors have nothing to disclose.
Wij danken de deelnemer aan de studie. Wij danken Louise Rousseau, coördinator van de HBP biobank voor het herstel van de weefselmonsters en alle bijbehorende klinische informatie. Wij erkennen de moleculaire pathologie en celbeeldvorming kernfaciliteiten in het CRCHUM en Michael Persch van Visiopharm voor uitstekende technische bijstand. Financiering: Deze studie werd ondersteund door subsidies van de Canadian Liver Foundation, Fonds de recherche du Québec-Santé (FRQS) AIDS and Infectious Disease Network (Réseau SIDA-MI) en het Canadian Network on Hepatitis C (CanHepC). CanHepC wordt gefinancierd door een gezamenlijk initiatief van de Canadian Institutes of Health Research (CIHR) (NHC-142832) en het Public Health Agency of Canada. M.F.M. ontving beurzen van de Université de Montréal, Bourse Gabriel Marquis en de FRQS. T.F. ontving doctoraatsbeurzen van CIHR en CanHepC. S.T. bekleedt de Roger-Des-Groseillers-leerstoel in hepatobiliaire en pancreasoncologische chirurgie, Université de Montréal.
Auteursbijdragen: M.F.M. ontwierp, voerde experimenten uit en analyseerde gegevens. T.F. ontwierp experimenten. A.C-B. technische begeleiding. G.S. voerde alle pathologische beoordeling van het onderzoek door en gaf input over alle pathologische aspecten. L.M. voerde H&E-kleuring uit, optimaliseerde en voerde beeldacquisitie uit. M.N.A. voerde de PSR-vlek uit en leverde waardevolle technische input. N.B. heeft bijgedragen aan de beeldanalyse. S.T. is hoofdonderzoeker van de HBP biobank en is verantwoordelijk voor het toezicht op de algehele werking van de biobank. Hij leverde ook onschatbare input over alle aspecten van het project en de klinische implicaties ervan. M.F.M. T.F., en N.H.S. conceptualiseerden en ontwierpen de studie. N.H.S. hield toezicht op het werk en kreeg financiering. M.F.M., T.F., A.C-B en N.H.S. schreven het manuscript. Alle auteurs beoordeelden en keurden het manuscript goed.
Antigen Retrieval Solution: Sodium Citrate Buffer (10 mM Sodium Citrate, 0.05% v/v Tween 20, pH 6.0) | |||
Blocking Solution: 1 % BSA, 10 % filtered human serum, 10 % filtered donkey serum, 0.1 % Tween 20, and 0.3% Triton in PBS | |||
Bovine serum albumin (BSA) | Multicell | 800-095-EG | |
Coplin jars (EASYDIP SLIDE STAINING SYSTEM) | Newcomersupply | 5300KIT | |
Cover slides | Fisherbrand | 12-545E 22*50 | |
Direct Red 80 | Sigma Aldrich | 365548 | |
Donkey Serum | Sigma Aldrich | D9663 | |
Ethanol 100% | |||
Electric pressure cooker | Salton | ||
Eosin | Leica Biosystems | 3801600 | CAUTION, eye irritation |
Fast Green FCF | Sigma Aldrich | F7252 | CAUTION, harmful by inhalation, ingestion and skin absortion |
FFPE section (4μm) slides | |||
Glycine 0,1 M in PBS | |||
Hematoxylin Stain Solution, Gil 1. Formulation, Regular Strength | Ricca Chemical Company | 3535-32 | |
Holder (EasyDip Staining Jar Holder) | Newcomersupply | 5300RK | |
Human Serum | Gemini | 22210 | |
Humidity chamber | Millipore Sigma | Z670138-1EA | |
Pap pen | abcam | ab2601 | |
PBS | |||
PBS-Tween 20 (0.1% v/v) | |||
Permount Mounting Media | Fisher Chemical | SP15-500 | |
Picric Acid 1.3 % | Sigma Aldrich | P6744 | CAUTION, skin and eye irritation |
Picro-Sirius Red/Fast Green solution: Fast Green 0.1 % w/v + Sirius Red 0.2 % w/v in 1,3 % picric acid solution | |||
Primary Antibody Anti-αSMA | Mouse IgG2a 1A4 | Sigma A2547 | Dilution 1/100 |
Primary Antibody Anti-CD34 | Mouse IgG1 HPCA1/763 | Novus Biologicals NBP2-44568 | Dilution 1/250 |
Primary Antibody Anti-Cytokeratin 8/18 | Rabbit EP17/EP30 | Agilent IR09461-2 | Ready to use |
Primary Antibody Anti-CD68 | Mouse KP1 | Abcam ab955 | Dilution 1/200 |
Primary Antibody Anti-Desmin | Rabbit Polyclonal | Invitrogen PA5-16705 | Dilution 1/200 |
Primary Antibody Anti-CD4 | Mouse N1UG0 | Affymetrix 14-2444 | Dilution 1/250 |
Primary Antibody Anti-FoxP3 | Rabbit 1054C | R & D MAB8214 | Dilution 1/100 |
Primary Antibody Anti-MPO | Goat Polyclonal | R & D Systems AF3667 | Dilution 1/250 |
Primary Antibody Anti-CD3 | Rabbit SP7 | Abcam ab16669 | Dilution 1/200 |
Primary Antibody Anti-CD8 | Mouse C8/144B | Invitrogen 14-0085-80 | Dilution 1/200 |
Secondary Antibody Donkey anti-mouse A488 | Polyclonal | Invitrogen A-21202 | Dilution 1/500 |
Secondary Antibody Donkey anti-Rabbit A488 | Polyclonal | Invitrogen A-21206 | Dilution 1/500 |
Secondary Antibody Donkey anti-goat A568 | Polyclonal | Invitrogen A-11057 | Dilution 1/500 |
Secondary Antibody Donkey anti-rabbit A647 | Polyclonal | Invitrogen A-31573 | Dilution 1/500 |
Secondary Antibody Rat anti-mouse IgG1 A647 | RMG1-1 | Biolegend 406618 | Dilution 1/500 |
Secondary Antibody Goat anti-mouse IgG2a CF568 | Polyclonal | Sigma Aldrich SAB4600315 | Dilution 1/500 |
Secondary Antibody Donkey anti-mouse DyLight 755 | Polyclonal | Invitrogen SA5-10171 | Dilution 1/500 |
Secondary Antibody Donkey anti-rabbit DyLight 755 | Polyclonal | Invitrogen SA5-10043 | Dilution 1/500 |
SDS | BioShop | SDS001,500 | CAUTION, oral skin and eye toxicity |
Shandon multi-program robotic slide stainer | LabX | 11384903 | |
Shandon Xylene Substitute, | Thermo Fisher Scientific | CA89413-336 | CAUTION, Flammable, skin and eye irritation, Harmful when inhaled |
Shaking water bath | |||
SlowFade Gold antifade reagent with DAPI | Invitrogen | S36938 | |
Sodium Citrate Dihydrate | Millipore Sigma | 1545801 | CAUTION, eye irritation |
Stripping Buffer: mix 20 ml 10% w/v SDS with 12.5 ml 0.5 M Tris-HCl (pH 6.8), and 67.5 ml ultra-pure water. Under a fume hood, add 800 uL of 2-mercapto ethanol (114,4 mM final concentration) | |||
Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787-50ML | |
Tris-HCl | BioShop | 77-86-1 | |
Tween 20 | Fisher Scientific | BP337-500 | |
VIS Software | Visiopharm | ||
Whole slide scanner Olympus BX61VS | Olympus | Microscope: Olympus Slide Scanner BX61VS, 5 slides scanner, motorized stage, autofocus. Camera: Lightsource: Xcite-120. Filters: BrightLine® Sedat filter set (# LED-DA/FI/TR/Cy5-4X4M-B-000, Semrock) | |
Xylene | Sigma Aldrich | 214736-4L | CAUTION, Flammable, skin and eye irritation, Harmful when inhaled |
Xylene : Ethanol solution (1:1 v/v) | |||
2-mercaptoethanol | Sigma | M6250 | CAUTION, harmful by ingestion, inhalation, fatal if sking absortion. Eye irritation. Use fume hood |