التصور، القياس الكمي، ورسم خرائط للخلايا المناعية في البيئة الدقيقة الورم
Summary
هنا، نصف استراتيجية بسيطة ويمكن الوصول إليها لتصور وقياس ورسم خرائط الخلايا المناعية في أقسام أنسجة الورم المدمجة البارافين. تجمع هذه المنهجية بين تقنيات التصوير والتحليل الرقمي الحالية بهدف توسيع قدرة تعدد الإرسال وتحليل المعلمات المتعددة لفحوصات التصوير.
Abstract
المشهد المناعي للبيئة الدقيقة للورم (TME) هو عامل حاسم في تطور السرطان والاستجابة للعلاج. على وجه التحديد ، فإن كثافة وموقع الخلايا المناعية في TME لها قيم تشخيصية وتشخيصية مهمة. وقد أدى التنميط متعدد المجالات للTME إلى زيادة فهمنا للعديد من الشبكات الخلوية والجزيئية التي تنظم بدء الورم وتطوره. ومع ذلك، لا توفر هذه التقنيات معلومات حول التنظيم المكاني للخلايا أو تفاعلات الخلية الخلية. هناك حاجة إلى تقنيات متعددة السهولة يمكن الحصول عليها بأسعار معقولة ومتاحة وسهلة التنفيذ تسمح بالاستبانة المكانية للخلايا المناعية في أقسام الأنسجة لاستكمال تقنيات الإنتاجية العالية القائمة على الخلايا الواحدة. هنا ، نحن نصف استراتيجية تدمج التصوير التسلسلي ، والوسم التسلسلي ، ومحاذاة الصورة لتوليد شرائح متعددة المعلمات الظاهرية من أقسام الأنسجة بأكملها. يتم تحليل الشرائح الظاهرية لاحقًا بطريقة تلقائية باستخدام بروتوكولات محددة من قبل المستخدم تمكن من تحديد مجموعات الخلايا ذات الأهمية وتقديرها الكمي وتعيينها. يتم تحليل الصورة ، في هذه الحالة باستخدام وحدات التحليل من حيث الأنسجة والمؤلف وHISTOmap. نقدم مثالاً حيث طبقنا هذه الاستراتيجية بنجاح على عينة سريرية واحدة، وتعظيم المعلومات التي يمكن الحصول عليها من عينات الأنسجة المحدودة وتوفير وجهة نظر غير متحيزة من TME في قسم الأنسجة بأكمله.
Introduction
تطور السرطان هو نتيجة لعملية متعددة الخطوات تنطوي على تفاعلات متبادلة بين الخلايا الخبيثة وTME. بخلاف الخلايا السرطانية ، يتكون TME من خلايا غير خبيثة ، وخلايا سترومال ، وتجمعات الخلايا المناعية ، ومصفوفة خارج الخلية (ECM)1. التنظيم المكاني للمكونات الخلوية والهيكلية المختلفة للأنسجة الورم والتبادل الديناميكي بين السرطان والخلايا المجاورة غير السرطانية في نهاية المطاف تعديل تطور الورم والاستجابة للعلاج2،3،4. وقد ثبت أن الاستجابة المناعية في السرطان هو تنظيم spatiotemporally5,6. مجموعات مختلفة من الخلايا المناعية التي تتسلل إلى آفة البلاستيك النيولي والأنسجة المجاورة تظهر أنماط توزيع مكانية مميزة وحالات تنشيط وتمايز متنوعة مرتبطة بوظائف مختلفة (على سبيل المثال، الموالية مقابل المضادة للورم). هذه الفئات المختلفة المناعية ومعلماتها تتطور العمل الإضافي مع الورم والمقصورات سترومال.
وقد أدى ظهور التقنيات التي تسمح بتنميط متعدد الخلايا المفردة إلى زيادة فهمنا للعديد من الشبكات الخلوية والجزيئية التي تنظم التسرطن وتطور الورم. ومع ذلك، تتطلب معظم الأدوات التحليلية عالية الإنتاجية القائمة على الخلية الواحدة تعطيل الأنسجة وعزل الخلية الواحدة، مما يؤدي إلى فقدان المعلومات حول التنظيم المكاني للخلايا والتفاعلات بين الخليةوالخلية 7. لأن موقع وترتيب خلايا مناعية محددة في TME لها قيمة تشخيصية وتشخيصية، والتكنولوجيات التي تسمح الاستبانة المكانية هي تكملة أساسية لتقنيات التنميط المناعي الواحدة القائمة على الخلية.
تقليديا، تقنيات التصوير مثل الكيمياء المناعية (IHC) والفلورالمناعة متعددة (mIF) وقد اقتصرت على عدد قليل من المؤشرات الحيوية التي يمكن تصورها في وقت واحد. وقد أعاق هذا القيد دراسة الديناميات الصدغية للخلايا المناعية المتسللة للورم ، والتي يتم تعريفها عادة من خلال العديد من العلامات النفية. وقد أدت التطورات الأخيرة في أدوات التصوير والتحليل إلى توسيع إمكانيات تعدد الإرسال. وقد استخدمت تقنيات جديدة القائمة على الأجسام المضادة وضع العلامات مثل القياس الهسهي والقياس الخلوي الشامل التصويري لفصل مكان مكاني تصل إلى 12 و 32 المؤشرات الحيوية، على التوالي8،9. التصوير الطيفي الشامل، وهي تقنية لا تتطلب وضع العلامات، لديه القدرة على صورة الآلاف من المؤشرات الحيوية في وقت واحد في قسم نسيج واحد10،11. على الرغم من أن هذه التقنيات قد أظهرت بالفعل إمكانات كبيرة لتشريح المناظر الطبيعية المناعية النسيج في السرطان، فإنها تستخدم معدات وبرامج متطورة للغاية ومكلفة وغير متاحة بسهولة لغالبية الباحثين.
بدلا من ذلك، تم توسيع قدرة تعدد الإمكانات من IHC التقليدية وmIF من خلال استخدام التصوير التسلسلي، وجولات متتابعة من وضع العلامات، والتصوير الطيفي7،12،1313،14،15،16. هذه التقنيات تولد صورا متعددة من نفس أو من أقسام الأنسجة التسلسلية التي يمكن دمجها في الشرائح الظاهرية متعددة المعلمات باستخدام برامج تحليل الصور. ونتيجة لذلك، يزداد عدد العلامات التي يمكن تصورها وتحليلها في وقت واحد.
هنا ، نقترح استراتيجية للتصميم العقلاني لمقالات متعددة الأنسجة باستخدام الكواشف المتاحة تجاريًا ، ومعدات المجهر بأسعار معقولة ، والبرامج سهلة الاستخدام(الشكل 1). تدمج هذه المنهجية التصوير التسلسلي، ووضع العلامات المتسلسلة متعددة، وتصوير الأنسجة بأكملها، ومحاذاة الأنسجة لتوليد شرائح متعددة المعلمات الظاهرية التي يمكن استخدامها للقياس الكمي الآلي ورسم خرائط الخلايا المناعية في أقسام الأنسجة. باستخدام هذه الاستراتيجية، أنشأنا شريحة واحدة افتراضية تتألف من 11 علامة حيوية بالإضافة إلى اثنين من البقع النسيجية المستخدمة بشكل متكرر: الهيماتوكسيلين والإيوسين (H & E) وpicrosirius الأحمر (PSR). تم تحديد مجموعات متعددة من الخلايا المناعية، وتحديد موقعها، وقياسها كميا في مقصورات الأنسجة المختلفة وحل توزيعها المكاني باستخدام خرائط حرارة الأنسجة. هذه الاستراتيجية تعظيم المعلومات التي يمكن الحصول عليها من عينات سريرية محدودة وينطبق على الفورماين ثابتة جزءا لا يتجزأ من عينات الأنسجة المؤرشفة (FFPE) ، بما في ذلك الأنسجة الكاملة ، خزعات إبرة الأساسية ، والخلايا الدقيقة الأنسجة. نقترح هذه المنهجية كدليل مفيد لتصميم المقالات المخصصة لتحديد وتحديد كمية ورسم خرائط مجموعات الخلايا المناعية في TME.
Protocol
Representative Results
Discussion
هناك حاجة بسيطة وسهلة الوصول إليها لتنفيذ تقنيات متعددة الشينغ التي تسمح بالاستبانة المكانية للخلايا المناعية في أقسام الأنسجة لرسم خريطة للمشهد المناعي في السرطان والاضطرابات المناعية الأخرى. هنا، ونحن نصف استراتيجية تدمج العلامات المتاحة على نطاق واسع وتقنيات التحليل الرقمي لتوسيع قدرة تعدد النصائح والتقييم متعدد الأبعاد من المقالات التصوير12،13،17،19. تلطيخ ثلاثة أقسام المسلسل لعلامات مختلفة ، وإعادة استخدام المقاطع من خلال تقنيات التجريد وإعادة التحقيق ، مكنتنا من تصور 11 المعلمات بالإضافة إلى بقع H & E و PSR. تم محاذاة ست صور من هذه الأقسام بطريقة آلية باستخدام وحدة محاذاة الأنسجة. كانت المحاذاة دقيقة على مستوى الخلية الفردية للصور الناشئة من نفس القسم ومتوافقة للغاية للصور الناشئة من الأقسام المجاورة. متعددة الظاهري مكنتنا من تحديد كيفية علامات تصور في أحد الأقسام تتصل مكانيا إلى علامات تصور في قسم آخر متجاورة. وفي حين أن بعض البقع وصفت بثاني أكسيد الكربون، فإن البعض الآخر وصف بـ TCs، مما يسمح لنا بتحديد كمي لثاني أكسيد الكربون في مختلف اللجان. وقد أدى استخدام أدوات برمجية للقياس الكمي الآلي لـ COIs إلى تبسيط وتسريع معالجة الصور إلى حد كبير. وعلاوة على ذلك، تم تطبيق التحليل الرقمي على أقسام الأنسجة بأكملها بدلاً من مجالات نظر مختارة، مما أدى إلى تمثيل غير متحيز للإدارة المتكاملة للأنسجة. وعلاوة على ذلك، ونظرا ً لأن إحداثيات الأنسجة في COIs تم تسجيلها، كان من الممكن توليد خرائط حرارة الأنسجة.
هناك عدة مناطق في هذا البروتوكول حيث قد تكون هناك حاجة لاستكشاف الأخطاء وإصلاحها. أولاً، يمكن أن يؤثر استرداد المستضد الضعيف على جودة الـ mIF، وبالتالي يجب تحسين نوع عازل استرجاع المستضد والمدة لظروف الفحص/العلامات الحيوية المحددة المستخدمة. ثانياً، ينبغي تكييف نوع محلول الحجب المستخدم مع الأنسجة/المستضد/الأنواع من الأجسام المضادة الأولية والثانوية. في أيدينا، إضافة 10٪ مجموع المصل من الأنواع حيث النسيج يأتي من مستقبلات FC منعت، وبالتالي انخفاض غير محدد ربط الأجسام المضادة. إضافة 10٪ من المصل من الأنواع التي أثيرت فيها الأجسام المضادة الثانوية من شأنها أن تقلل من التعلق المباشر غير المحدد للأجسام المضادة الثانوية إلى قسم الأنسجة. ثالثاً، من الضروري التحقق من خصوصية الأجسام المضادة الأولية والثانوية باستخدام الضوابط الإيجابية والسلبية المناسبة. رابعا، زيادة الفلورات في بعض القنوات ونشر DAPI على تجريد الأجسام المضادة الأولية هي أيضا شائعة. لمعالجة الفلور التّيعز المُحسّن، استخدمنا أزواج الأجسام المضادة الأولية/الثانوية حيث كانت الإشارة المحددة تحتوي على قيم كثافة لا تقل عن 5 x تلك التي تحتوي عليها الخلفية. وأخيرا، لا يمكن توصف بعض الأجسام المضادة تقارب عالية مع إجراءات تجريد العادية. في هذه الحالة، نوصي باستخدام مثل هذه الأجسام المضادة في الجولة الأخيرة من وضع العلامات. قد يضطر المستخدم إلى محاولة تسلسل تلطيخ مختلف للعثور على التكوين الأمثل للأجسام المضادة ذات الاهتمام. وينبغي تأكيد كفاءة التجريد قبل الشروع في جولة ثانية أو ثالثة من وضع العلامات.
القيد الرئيسي والتحدي الذي تواجهه هذه الاستراتيجية هو العثور على التوليفات الصحيحة من الأجسام المضادة الفلورية الأولية والثانوية لعلامات الاهتمام. العثور على الأجسام المضادة الأولية التي أثيرت في أنواع مختلفة أو مع isotypes المختلفة التي يمكن استخدامها في وقت واحد محدودة بما هو متاح تجاريا. معظم الماسحات الضوئية الشريحة كلها مجهزة المصابيح والمرشحات التي تسمح التصوير بحد أقصى خمس قنوات، والأجسام المضادة الثانوية في الأنواع الصحيحة والفلوروفور الحق ليست متاحة دائما. لقد تغلبنا جزئيا على هذه القيود باستخدام البقع التسلسلية والعلامات المتسلسلة. قد تحتاج العديد من تركيبات الأجسام المضادة إلى اختبارها للوصول إلى أفضل تركيبة لعلامات الاهتمام. القيد الآخر هو جودة تلطيخ DAPI ، لأن تجريد وإعادة التحقيق قد لا تسمح دائمًا بإجراء تجزئة النوى.
وحدة محاذاة الأنسجة يتطلب الحد الأدنى من التدريب وليس مهارات البرمجة من المستخدمين. البرنامج يسمح نظريا محاذاة عدد غير محدود من الصور. ومع ذلك، تعتمد المحاذاة الدقيقة على صلة المقاطع، حيث يتم محاذاة الأقسام الأقرب التي تكون أكثر توافقًا من الناحية النسيجية بشكل أكثر دقة. استخدمنا وحدة المؤلف من VIS لتوليد APPs. هناك حاجة إلى المعرفة الأساسية لتحليل الصور لإنشاء APPs ، ولكن هذا هو الحال بنفس القدر عند استخدام أي برنامج آخر لتحليل الصور. وتشمل المزايا الفريدة لـ VIS بالمقارنة مع برامج تحليل الصور الأخرى المحاذاة الآلية للصور من الأقسام المعدة باستخدام أساليب مختلفة (على سبيل المثال، IF، كيمياء النسيج، IHC). وهذا يسمح الدراسات توطين مشترك من علامات متعددة من الفائدة باستخدام multixing الظاهري. وعلاوة على ذلك، فإن التصميم المرن والسهل الاستعمال للAPPs يسمح بالتخصيص الخاص بالمستخدم. القياس الكمي الآلي ورسم الخرائط ، وإمكانية معالجة أقسام الأنسجة بأكملها ، يوفر الوقت ويقلل من التحيز مقارنة بالعد اليدوي عن طريق الفحص البصري.
هذه الاستراتيجية هي أداة بحثية مفيدة للغاية لمناعة الأنسجة في سياق السرطان والمناعة الذاتية ولكنها لا تزال غير مصدقة للاستخدام السريري. مع توحيد إضافية والتحقق من صحة, ويمكن استخدامه في المستقبل لتطبيقات متعددة (على سبيل المثال, لرسم خريطة المشهد المناعي في السرطان للتنبؤ ورصد الاستجابة لعوامل العلاج المناعي). كما يمكن تكييفه مع الحالات الالتهابية المختلفة (على سبيل المثال، مرض الأمعاء الالتهابي) للجمع بين التقييم المرضي والمؤشرات الحيوية التكهنية.
وتتمثل الخطوات الحاسمة الرئيسية في هذا البروتوكول في كفاءة/خصوصية وضع العلامات ومتانة الإجراءات المصممة للاستخدام المقصود أو العلامة البيولوجية. وبالتالي ، فإن التحقق من الصحة المنتظم عن طريق الفحص البصري ، وخاصة عند تصميم APP جديد ، أمر ضروري. الاستخدام الفعال لجولات متعددة من تجريد وإعادة التحقيق أو أنواع مختلفة من البقع على نفس القسم هي مكونات حاسمة ويمكن أن تكون أنسجة أو قسم محدد. التحقق من كفاءة هذه العمليات قبل الشروع في تحليل دفعة كبيرة أمر بالغ الأهمية.
باختصار، نحن نقدم استراتيجية تزيد من المعلومات الكمية والمكانية التي يمكن الحصول عليها من عينات الأنسجة السريرية القيمة. ويمكن الوصول على نطاق واسع إلى الموارد والمعدات والمعارف اللازمة لتنفيذ هذه المنهجية. ونحن نقترح هذه المنهجية كدليل مفيد لتخطيط المقالات التي تهدف إلى تحديد مجموعات الخلايا المناعية وقياسها كمياً ورسم خرائط لها في منطقة TME.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر المشارك في الدراسة. نشكر لويز روسو، منسقة البنك الحيوي HBP لاسترداد عينات الأنسجة وجميع المعلومات السريرية المرتبطة بها. نحن نعترف بعلم الأمراض الجزيئية ومرافق التصوير الخلوي الأساسية في CRCHUM ومايكل بيرش من Visiopharm للحصول على مساعدة تقنية ممتازة. التمويل: تم دعم هذه الدراسة من خلال منح مقدمة من مؤسسة الكبد الكندية، ومؤسسة التنمية الاقتصادية في كيبيك-سانتي (FRQS) شبكة الإيدز والأمراض المعدية (Réseau SIDA-MI)، والشبكة الكندية لالتهاب الكبد C (CanHepC). يتم تمويل CanHepC من خلال مبادرة مشتركة من المعاهد الكندية للبحوث الصحية (NHC-142832) ووكالة الصحة العامة الكندية. حصل M.F.M. على زمالات من جامعة مونتريال، وبورصة غابرييل ماركيز، وFRQS. حصل T.F. على زمالات الدكتوراه من CIHR و CanHepC. S.T. يحمل كرسي روجر-ديس غروسيليرس في جراحة الأورام الكبدية والبنكرياس، جامعة مونتريال.
مساهمات المؤلف: M.F.M. تم تصميمها وتجربتها وتحليلها وتحليل البيانات. T.F. صممت التجارب. أ. سي بي. قدمت التوجيه التقني. أجرى G.S. جميع التقييم المرضي لموضوع الدراسة وقدم مدخلات حول جميع الجوانب المرضية. قامت L.M. بتلطيخ H & E وتحسينها وتنفيذها. M.N.A. أداء وصمة عار PSR وقدمت مدخلات تقنية قيمة. ساهم N.B. في تحليل الصورة. S.T. هو المحقق الرئيسي للبنك الحيوي HBP وهو مسؤول عن الإشراف على التشغيل العام للبنك الحيوي. كما قدم مدخلات لا تقدر بثمن في جميع جوانب المشروع وآثاره السريرية. M.F.M، T.F. ، وN.H.S. تصور وتصميم الدراسة. وأشرف ت. ه. س. على العمل وحصل على تمويل. كتب م.ف.م، وT.F.، و A.C-B، ون.ه.س. المخطوطة. قام جميع المؤلفين بمراجعة المخطوطة والموافقة عليها.
Materials
| Antigen Retrieval Solution: Sodium Citrate Buffer (10 mM Sodium Citrate, 0.05% v/v Tween 20, pH 6.0) | |||
| Blocking Solution: 1 % BSA, 10 % filtered human serum, 10 % filtered donkey serum, 0.1 % Tween 20, and 0.3% Triton in PBS | |||
| Bovine serum albumin (BSA) | Multicell | 800-095-EG | |
| Coplin jars (EASYDIP SLIDE STAINING SYSTEM) | Newcomersupply | 5300KIT | |
| Cover slides | Fisherbrand | 12-545E 22*50 | |
| Direct Red 80 | Sigma Aldrich | 365548 | |
| Donkey Serum | Sigma Aldrich | D9663 | |
| Ethanol 100% | |||
| Electric pressure cooker | Salton | ||
| Eosin | Leica Biosystems | 3801600 | CAUTION, eye irritation |
| Fast Green FCF | Sigma Aldrich | F7252 | CAUTION, harmful by inhalation, ingestion and skin absortion |
| FFPE section (4μm) slides | |||
| Glycine 0,1 M in PBS | |||
| Hematoxylin Stain Solution, Gil 1. Formulation, Regular Strength | Ricca Chemical Company | 3535-32 | |
| Holder (EasyDip Staining Jar Holder) | Newcomersupply | 5300RK | |
| Human Serum | Gemini | 22210 | |
| Humidity chamber | Millipore Sigma | Z670138-1EA | |
| Pap pen | abcam | ab2601 | |
| PBS | |||
| PBS-Tween 20 (0.1% v/v) | |||
| Permount Mounting Media | Fisher Chemical | SP15-500 | |
| Picric Acid 1.3 % | Sigma Aldrich | P6744 | CAUTION, skin and eye irritation |
| Picro-Sirius Red/Fast Green solution: Fast Green 0.1 % w/v + Sirius Red 0.2 % w/v in 1,3 % picric acid solution | |||
| Primary Antibody Anti-αSMA | Mouse IgG2a 1A4 | Sigma A2547 | Dilution 1/100 |
| Primary Antibody Anti-CD34 | Mouse IgG1 HPCA1/763 | Novus Biologicals NBP2-44568 | Dilution 1/250 |
| Primary Antibody Anti-Cytokeratin 8/18 | Rabbit EP17/EP30 | Agilent IR09461-2 | Ready to use |
| Primary Antibody Anti-CD68 | Mouse KP1 | Abcam ab955 | Dilution 1/200 |
| Primary Antibody Anti-Desmin | Rabbit Polyclonal | Invitrogen PA5-16705 | Dilution 1/200 |
| Primary Antibody Anti-CD4 | Mouse N1UG0 | Affymetrix 14-2444 | Dilution 1/250 |
| Primary Antibody Anti-FoxP3 | Rabbit 1054C | R & D MAB8214 | Dilution 1/100 |
| Primary Antibody Anti-MPO | Goat Polyclonal | R & D Systems AF3667 | Dilution 1/250 |
| Primary Antibody Anti-CD3 | Rabbit SP7 | Abcam ab16669 | Dilution 1/200 |
| Primary Antibody Anti-CD8 | Mouse C8/144B | Invitrogen 14-0085-80 | Dilution 1/200 |
| Secondary Antibody Donkey anti-mouse A488 | Polyclonal | Invitrogen A-21202 | Dilution 1/500 |
| Secondary Antibody Donkey anti-Rabbit A488 | Polyclonal | Invitrogen A-21206 | Dilution 1/500 |
| Secondary Antibody Donkey anti-goat A568 | Polyclonal | Invitrogen A-11057 | Dilution 1/500 |
| Secondary Antibody Donkey anti-rabbit A647 | Polyclonal | Invitrogen A-31573 | Dilution 1/500 |
| Secondary Antibody Rat anti-mouse IgG1 A647 | RMG1-1 | Biolegend 406618 | Dilution 1/500 |
| Secondary Antibody Goat anti-mouse IgG2a CF568 | Polyclonal | Sigma Aldrich SAB4600315 | Dilution 1/500 |
| Secondary Antibody Donkey anti-mouse DyLight 755 | Polyclonal | Invitrogen SA5-10171 | Dilution 1/500 |
| Secondary Antibody Donkey anti-rabbit DyLight 755 | Polyclonal | Invitrogen SA5-10043 | Dilution 1/500 |
| SDS | BioShop | SDS001,500 | CAUTION, oral skin and eye toxicity |
| Shandon multi-program robotic slide stainer | LabX | 11384903 | |
| Shandon Xylene Substitute, | Thermo Fisher Scientific | CA89413-336 | CAUTION, Flammable, skin and eye irritation, Harmful when inhaled |
| Shaking water bath | |||
| SlowFade Gold antifade reagent with DAPI | Invitrogen | S36938 | |
| Sodium Citrate Dihydrate | Millipore Sigma | 1545801 | CAUTION, eye irritation |
| Stripping Buffer: mix 20 ml 10% w/v SDS with 12.5 ml 0.5 M Tris-HCl (pH 6.8), and 67.5 ml ultra-pure water. Under a fume hood, add 800 uL of 2-mercapto ethanol (114,4 mM final concentration) | |||
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787-50ML | |
| Tris-HCl | BioShop | 77-86-1 | |
| Tween 20 | Fisher Scientific | BP337-500 | |
| VIS Software | Visiopharm | ||
| Whole slide scanner Olympus BX61VS | Olympus | Microscope: Olympus Slide Scanner BX61VS, 5 slides scanner, motorized stage, autofocus. Camera: Lightsource: Xcite-120. Filters: BrightLine® Sedat filter set (# LED-DA/FI/TR/Cy5-4X4M-B-000, Semrock) | |
| Xylene | Sigma Aldrich | 214736-4L | CAUTION, Flammable, skin and eye irritation, Harmful when inhaled |
| Xylene : Ethanol solution (1:1 v/v) | |||
| 2-mercaptoethanol | Sigma | M6250 | CAUTION, harmful by ingestion, inhalation, fatal if sking absortion. Eye irritation. Use fume hood |
References
- Greten, F. R., Grivennikov, S. I. Inflammation and Cancer:Triggers, Mechanisms, and Consequences. Immunity. 51 (1), 27-41 (2019).
- Pages, F., et al. International validation of the consensus Immunoscore for the classification of colon cancer: a prognostic and accuracy study. Lancet. 391 (10135), 2128-2139 (2018).
- Binnewies, M., et al. Understanding the tumor immune microenvironment (TIME) for effective therapy. Nature Medicine. 24 (5), 541-550 (2018).
- Taube, J. M., et al. Implications of the tumor immune microenvironment for staging and therapeutics. Modern Pathology: an official journal of the United States and Canadian Academy of Pathology, Inc. 31 (2), 214-234 (2018).
- Bindea, G., et al. Spatiotemporal dynamics of intratumoral immune cells reveal the immune landscape in human cancer. Immunity. 39 (4), 782-795 (2013).
- Galon, J., et al. Towards the introduction of the ‘Immunoscore’ in the classification of malignant tumours. The Journal of Pathology. 232 (2), 199-209 (2014).
- Finotello, F., Eduati, F. Multi-Omics Profiling of the Tumor Microenvironment: Paving the Way to Precision Immuno-Oncology. Frontiers in Oncology. 8, 430 (2018).
- Gerner, M. Y., Kastenmuller, W., Ifrim, I., Kabat, J., Germain, R. N. Histo-cytometry: a method for highly multiplex quantitative tissue imaging analysis applied to dendritic cell subset microanatomy in lymph nodes. Immunity. 37 (2), 364-376 (2012).
- Giesen, C., et al. Highly multiplexed imaging of tumor tissues with subcellular resolution by mass cytometry. Nature Methods. 11 (4), 417-422 (2014).
- Porta Siegel, T., et al. Mass Spectrometry Imaging and Integration with Other Imaging Modalities for Greater Molecular Understanding of Biological Tissues. Molecular Imaging and Biology : MIB: the official publication of the Academy of Molecular Imaging. 20 (6), 888-901 (2018).
- Buchberger, A. R., DeLaney, K., Johnson, J., Li, L. Mass Spectrometry Imaging: A Review of Emerging Advancements and Future Insights. Analytical Chemistry. 90 (1), 240-265 (2018).
- Pirici, D., et al. Antibody elution method for multiple immunohistochemistry on primary antibodies raised in the same species and of the same subtype. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 57 (6), 567-575 (2009).
- Gendusa, R., Scalia, C. R., Buscone, S., Cattoretti, G. Elution of High-affinity (>10-9 KD) Antibodies from Tissue Sections: Clues to the Molecular Mechanism and Use in Sequential Immunostaining. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 62 (7), 519-531 (2014).
- van der Loos, C. M. Multiple immunoenzyme staining: methods and visualizations for the observation with spectral imaging. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 56 (4), 313-328 (2008).
- Stack, E. C., Wang, C., Roman, K. A., Hoyt, C. C. Multiplexed immunohistochemistry, imaging, and quantitation: a review, with an assessment of Tyramide signal amplification, multispectral imaging and multiplex analysis. Methods. 70 (1), 46-58 (2014).
- Toth, Z. E., Mezey, E. Simultaneous visualization of multiple antigens with tyramide signal amplification using antibodies from the same species. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 55 (6), 545-554 (2007).
- Robertson, D., Savage, K., Reis-Filho, J. S., Isacke, C. M. Multiple immunofluorescence labeling of formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissue. BMC Cell Biology. 9, 13 (2008).
- Segnani, C., et al. Histochemical Detection of Collagen Fibers by Sirius Red/Fast Green Is More Sensitive than van Gieson or Sirius Red Alone in Normal and Inflamed Rat Colon. PloS One. 10 (12), 0144630 (2015).
- Bolognesi, M. M., et al. Multiplex Staining by Sequential Immunostaining and Antibody Removal on Routine Tissue Sections. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 65 (8), 431-444 (2017).
