Обогащение тканей млекопитающих и ксенопусов с холестерином

Холестерин, основной клеточный липид, играет многочисленные критические функциональные и структурные роли^{1,,2,,3,,4,,55,66,7,8,,9}. От регулирования физических свойств плазменной мембраны до обеспечения жизнеспособности клеток, роста, пролиферации и использования молекулы сигнала и прекурсора в изобилии биохимических путей, холестерин является императивным компонентом, необходимым для нормальной функции клеток и органов. В результате дефицит холестерина приводит к тяжелым физическим порокам развития и различным расстройствам. С другой стороны, даже небольшое повышение уровня холестерина выше физиологических уровней (2-3x)^,является цитотоксическим^1,,2,,10 и было связано с развитием нарушений, в том числе сердечно-сосудистых^11,,12,,13 и нейродегенеративных заболеваний^14,15,16,¹⁷. Таким образом, для изучения важнейших функций холестерина и определения влияния изменений уровня холестерина были разработаны различные подходы, которые изменяют содержание холестерина в тканях, клетках и ксенопух.

Изменение уровня холестерина в тканях и клетках млекопитающих
Несколько подходов могут быть использованы для снижения уровня холестерина в тканях и клетках^18. Один подход включает в себя их воздействие статинов, растворенных в липопротеино-дефицитной сыворотке для ингибирования HMG-CoA редуктазы, которая контролирует скорость синтеза холестерина^19,20. Тем не менее, эти препараты снижения уровня холестерина также препятствуют образованию нестероловых продуктов вдоль мевалонатного пути. Таким образом, небольшое количество мевалоната добавляется, чтобы позволить образование этих продуктов²¹ и повысить специфику этого подхода. Другой подход к снижению уровня холестерина включает в себя использование циклодекстрин. Эти гюфрироранозы мономеры обладают внутренней гидрофобной полости с диаметром, который соответствует размеру стеринов²², что облегчает извлечение холестерина из клеток, тем самым истощая их от родного содержания холестерина²³. Примером является 2-гидроксипропил-я-циклодекстрин (HP-CD), доклинический препарат в настоящее время тестируется для лечения ниманн-Пик типа C болезни, генетически наследственных смертельных метаболических расстройств, характеризующихся лизосомального холестерина хранения²⁴. Уровень истощения холестерина зависит от конкретной производной используется. Например, HP-CD извлекает холестерин с меньшей емкостью, чем метилированные производные, метил-и-циклодекстрин (МЗКД)^{24,25,26,27,28,29,30}. Примечательно, однако, что циклодекстрины могут также извлекать другие гидрофобные молекулы в дополнение к холестерину, что может привести к неспецифическим эффектам³¹. В отличие от истощения, клетки и ткани могут быть специально обогащены холестерином путем лечения циклодекстрином, который был донасыщен холестерином^23. Этот подход также может быть использован в качестве контроля для специфики q-циклодекстринов, используемых для истощения холестерина³¹. Истощение холестерина из тканей и клеток является простым и может быть достигнуто путем разоблачения клеток в течение 30-60 мин до 5 мМ ММ МЗКД растворяется в среде, используемой для хранения клеток. Такой подход может привести к 50% снижению содержания холестерина (например, в гиппокампе нейронов³², крысиных мозговых артерий³³). С другой стороны, подготовка комплекса к циклодекстрин-холестерин для обогащения холестерина тканей и клеток является более сложной и будет описана в разделе протокола.

Альтернативный подход к обогащению тканей и клеток с использованием циклодекстрин насыщен холестерина включает в себя использование ЛПНП, который опирается на рецепторы ЛПНП, выраженные в тканях / клетках¹⁸. Хотя этот подход предлагает преимущество использования природного холестерина гомеостаза машины клетки, он имеет несколько ограничений. Во-первых, ткани и клетки, которые не выражают рецептор ЛПНП не могут быть обогащены с помощью этого подхода. Во-вторых, частицы ЛПНП содержат другие липиды в дополнение к холестерину. В частности, ЛПНП состоит из белка ApoB₁₀₀ (25%) и следующие липиды (75%): 6-8% холестерина, 45-50% холестериновый эфир, 18-24% фосфолипидов и 4-8% триацилглицерола³⁴. Таким образом, доставка холестерина через частицы ЛПНП является неспецифической. В-третьих, процент увеличения содержания холестерина ЛПНП в тканях и клетках, которые выражают рецептор ЛПНП может быть значительно ниже, чем увеличение наблюдается с помощью циклодекстрин насыщенхолестерина холестерина. Например, в предыдущем исследовании, обогащение грызунов мозговых артерий с холестерином через ЛПНП привело только 10-15% увеличение уровня холестерина³⁵. В отличие от этого, обогащение этих артерий циклодекстрином, насыщенным холестерином, как описано в разделе протокола, привело к увеличению содержания холестерина на 50% (см. раздел «Результаты представительства», рисунок 1).

Изменение уровня холестерина в яйцеклетках Ксенопуса
Ксенопусские яйцеклетки представляют собой гетерологовую систему экспрессии, обычно используемую для изучения функции клеток и белков. Более ранние исследования показали, что соотношение холестерина к фосфолипидным молярным соотношению у ооцитов Ксенопуса составляет 0,5 и 0,1³⁶. Из-за этого внутренне высокий уровень холестерина, повышение содержания холестерина в этой системе является сложной задачей, но может быть достигнуто с помощью дисперсии из мембранных фосфолипидов и холестерина. Фосфолипиды, которые мы выбрали для этой цели, аналогичны тем, которые используются для формирования искусственных планарных липидных бислой и включают L-я-фосфатидидаланоламин (POPE) и 1-palmitoyl-2-олеоил-сн-глицеро-3-фосфо-л-серин (POPS), как описано в разделе протокола. Такой подход может привести к увеличению содержания холестерина на 50% (см. раздел “Результаты представлений”, рисунок 2).

Альтернативный подход к обогащению ооцитов ксенопуса фосфолипидными дисперсиями предполагает использование циклодекстрин, насыщенный холестерином, который похож на то, как обогащаются ткани и клетки. Тем не менее, мы обнаружили, что этот подход имеет низкую воспроизводимость и эффективность, в среднем на 25% больше содержания холестерина. Это, возможно, связано с различной грузоподъемностью этих двух подходов (см. раздел “Результаты представитель”, рисунок 3). В отличие от этого, было показано, что использование циклодекстрин для истощения холестерина из ооцитов Ксенопуса может привести к снижению^{содержания}холестерина на 40%.

Здесь мы сосредоточиваемся на обогащении холестерина тканей и клеток млекопитающих путем применения циклодекстрин насыщенных холестерином, и ксенопусов ооцитов с использованием липосом. Оба подхода могут быть использованы для разграничения влияния повышенного уровня холестерина на функцию белка. Механизмы модуляции холестерина функции белка могут включать прямые взаимодействия⁸ и/или косвенные эффекты^9. Когда холестерин влияет на функцию белка через прямые взаимодействия, влияние повышения уровня холестерина на активность белка, вероятно, не зависит от типа клеток, системы выражения или подхода обогащения. Например, мы использовали эти два подхода, чтобы определить влияние холестерина на G-белок закрытых внутренне выправляя калия (GIRK) каналов, выраженных в предсердий миоцитов³⁷, гиппокампа нейронов^32,38, HEK293³⁹ клеток, и Ксенопус ооцитов^32,37. Результаты, полученные в этих исследованиях, были последовательными: во всех трех типах клеток млекопитающих и в оицитах амфибий холестерина upregulated GIRK функции канала (см. Представитель Результаты раздела, Рисунок 4, для гиппокампа нейронов и соответствующие эксперименты в ооцитов Ксенопуса). Кроме того, наблюдения, сделанные в этих исследованиях, также согласуются с результатами исследований, проведенных в предсердий миоцитов^37,40 и гиппокампа нейронов^32,38 свежеизолированных от животных, подвергаемых высоким уровнем холестерина диеты⁴⁰. Примечательно, что обогащение холестерина гиппокампа нейронов с помощью МЗКД обратить вспять эффект аторвастатина терапии, используемой для решения воздействия диеты с высоким уровнем холестерина как на уровень холестерина и GIRK функции³⁸. В других исследованиях мы исследовали влияние мутаций на чувствительность холестерина внутренне выправляющего калийный канал Kir2.1 с использованием обоих клеток Xenopus и клеток HEK293^41. Опять же, влияние мутаций на чувствительность канала было аналогичным в двух системах.

Применение обоих методов обогащения для определения влияния повышенного уровня холестерина на молекулярную, клеточную и органную функцию многочисленны. В частности, использование циклодекстрин-холестериновых комплексов для обогащения клеток и тканей очень распространено во многом благодаря своей специфичности. Недавние примеры такого подхода включают определение влияния холестерина на активацию канала HERG и основные механизмы⁴², открытие, что холестерин активирует G белка связаны рецептор Smoothened содействовать Ежик сигнализации⁴³, и определение роли холестерина в биомеханики стволовых клеток и адипогенеза через мембраны связанных связующих белков⁴⁴. В нашей собственной работе, мы использовали обогащение тканей млекопитающих с комплексом M’CD: холестерин для изучения влияния обогащения холестерина на основную функцию и фармакологический профиль кальция- и напряжения-gated каналов большой проводимости (BK, MaxiK) в сосудистой гладкой мышце^35,45,46. В других исследованиях, мы использовали фосфолипид основе дисперсии подход для обогащения ксенопусов ооцитов с холестерином, чтобы определить роли различных регионов в Kir2.1 и GIRK каналов в холестериновой чувствительности^41,47,48,49, а также для определения предполагаемых холестеринсвязных сайтов в этих каналах^32,50,51.