Транскриптом-широкое профилирование белково-РНК-взаимодействий путем перекрестного связывания и иммунопреципиентации при посредничестве FLAG-Biotin Tandem Purification

РНК и РНК-связывающие белки (РБП) контролируют различные клеточные процессы, включая сращивание, перевод, рибосомный биогенез, эпигенетическую^{регуляции и переход судьбы клеток 1,2,3,4,5,6.} Тонкие механизмы этих процессов зависят от уникального пространственного и временного расположения РНК и РРБ. Поэтому важным шагом на пути к пониманию регулирования РНК на молекулярном уровне является выявление позиционной информации о связывающих участках РРБ.

Разработана стратегия, именуемая перекрестными соединениями и иммунопреципитацией (CLIP-seq) для захвата белково-РНК-взаимодействий с УФ-перекрестными соединениями с последующим иммунопреципитацией^{белка интереса 7}. Ключевой особенностью методологии является индукция ковалентных перекрестных связей между РНК-связывающим белком и его непосредственно связанными молекулами РНК (в пределах 1 евро) путем^{УФ-облучения 8.} Следы RBP могут быть определены кластеризацией тегов CLIP и пиковым вызовом, разрешение которого обычно составляет 30–60 nt. Кроме того, обратный этап транскрипции CLIP может привести к indels (вставки или удаления) или замены кросс-связывающих сайтов, что позволяет идентифицировать белковые связывающие сайты на РНК при одном нуклеотидном разрешении. Трубопроводы, такие как Novoalign и CIMS, были разработаны для анализа результатов секвенирования высокой пропускной способности CLIP-seq^8. Несколько модифицированных методов CLIP-seq также были предложены, в том числе индивидуальное нуклеотидное разрешение кросс-ссылок и иммунопреципиентации (iCLIP), расширенный CLIP (eCLIP), irCLIP, и фотоактивируемый рибонуклеозид-улучшенной перекрестной связи и иммунопреципиентации (PAR-CLIP)^9,10,11,12.

Несмотря на широкое использование традиционных методов CLIP-seq при изучении RBPs, методы CLIP имеют несколько недостатков. Во-первых, утомительный денатурированный гель электрофорез и процедура переноса мембраны могут привести к потере информации и вызвать ограниченную сложность последовательности. Во-вторых, белок конкретных антител на основе метода CLIP может тянуть вниз белковый комплекс вместо одного целевого белка, что может привести к ложноположим белково-РНК взаимодействий с copurified RBPs. В-третьих, антитела на основе стратегии требует большого количества высококачественных антител, что делает применение этих методов недостаточным для изучения RBPs без высококачественных антител доступны. В-четвертых, традиционный метод CLIP требует радиозаклейм АТФ для обозначения связанных с белком РНК.

Высокое сродство стрептавидина к биотинилированным белкам делает его очень мощным подходом к очистке конкретных белков или белковых комплексов. Эффективное биотинилирование белков, несущих искусственную пептидную последовательность эктопически выраженной бактериальной биотиновой лигазой BirA в клетках млекопитающих, делает его эффективной стратегией для выполнения биотиновой очистки in vivo^13. Мы разработали модифицированный метод CLIP-seq под ^{названием Fbio}CLIP-seq(FLAG- Bioолово-опосредованное Cross-lчернила и Immuno p recipitation с последующим секвенированием высокой пропускной способности) с использованием FLAG-биотина тега^{тандема очистки 14} (Рисунок 1). Благодаря тандемной очистке и строгим условиям мытья, почти все взаимодействующие RBPs удаляются(рисунок 2). Строгие условия мытья также позволяют обойти SDS-PAGE и мембраны передачи, которая является трудоемкой и технически сложной задачей. И подобно eCLIP и IRCLIP, ^{метод Fbio}CLIP-seq не имеет изотопов. Пропуск геля на ход и перенос шагов позволяет избежать потери информации, сохраняет аутентичные взаимодействия белка и РНК нетронутыми, а также увеличивает сложность библиотеки. Кроме того, высокая эффективность системы маркировки делает ее хорошим выбором для RBPs без высококачественных антител доступны.

Здесь мы предоставляем пошаговое описание протокола ^FbioCLIP-seq для клеток млекопитающих. Короче говоря, клетки связаны между собой 254 нм УФ, а затем клеточный лиз и FLAG иммунопреципитации (FLAG-IP). Далее белково-РНК-комплексы дополнительно очищаются путем захвата биотинов, а РНК фрагментированы частичным пищеварением с помощью MNase. Затем РНК, связанная с белком, дефосфорилируется и привязается к связующим звену 3′ 5′ РНК linker добавляется после РНК фосфорилируется с PNK и eluted по proteinase K пищеварения. После обратной транскрипции сигналы РНК, связанные с белком, усиливаются ПЦР и очищаются путем очистки геля агарозы. Два RBPs были выбраны в качестве примера ^fbioCLIP-seq результат. LIN28 является хорошо охарактеризованным РНК-связывающим белком, участвующим в созревании микроРНК, переводе белка и^{перепрограммировании клеток 15,16,17.} WDR43 является WD40 домен-содержащий белок считается координировать рибосомы биогенез, эукариотической транскрипции, и эмбриональных стволовых клеток плюрипотентности^{управления 14,18}. В соответствии с ранее сообщенные результаты для LIN28 с CLIP-seq, ^FbioCLIP-seq показывает связывающие сайты LIN28 на “GGAG” мотивы в микроРНК мир-let7g и mRNAs^16,19 (Рисунок 3). WDR43 ^FbioCLIP-seq также определил связывающее предпочтение WDR43 с 5′ внешними транскрибированными spacers (5′-ETS) предварительно rRNAs²⁰ (Рисунок 4). Эти результаты подтверждают надежность метода ^FbioCLIP-seq.