סידן פלואורסצנטי הדמיה ובעקבות היברידיזציה באתרו לאפיון עצבי בלתי מבשר בקספוס זריזה

כל העבודה הכרוכה בבעלי חיים בוצעה בהתאם לפרוטוקולים שאושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול בבעלי חיים (IACUC) במכללה של ויליאם ומרי. 1. טיפול בבעלי חיים וטיפול בעובר לגרום ההזדווגות הטבעית על ידי ניהול הזרקה תת עורית של גונדוטרופין כוריוני אנושי (HCG) לתוך שק לימפה החלק הלבן של xenopus זריזה במינון של 600 u עבור נקבות ו 400 u עבור זכרים. לאחר ההזרקה, מניחים לפחות זכר אחד וצפרדע נקבה אחת במיכל המחזיק בטמפרטורת החדר למשך הלילה. ביצה הנחת בדרך כלל מתחיל 9-12 h לאחר הממשל HCG. לאסוף עוברים. Dejelly על ידי שטיפת בעדינות עם 2% ציסטאין (pH 8.0) עבור 2-4 דקות. לשטוף את העוברים 3x ב 0.1 x מארק שונה הפתרון של הצלצול (MMR) (100 מ”מ, 2 מ”מ KCl, 1 מ”מ MgSO4, 2 מ”מ cacl2, 5 מ”מ hepes, pH מותאם ל 7.4 – 7.6). העברת העוברים אל 100 מנות מזכוכית פטרי מכיל 0.1 x MMR ו 50 μg/mL בג. צפיפות של 50-100 עוברים לכל צלחת מתאימה. מודחלת את הכלים ב -14 ° c – 22 ° c ומאפשרים לעוברים להתפתח עד שיגיעו לשלב ההתפתחותי הרצוי. מדי פעם להסיר תאים מופרית, נמק או באופן חריג העוברים לפתח עם פיפטה העברה פלסטיק.הערה: כדי להבטיח עקביות, ההיערכות ההתפתחותית מבוצעת בהתאם לקריטריונים מורפולוגיים שהוגדרו על-ידי ניוקופ ופבר16. שלבי הריבית ישתנו בהתאם למיקוד הניסיוני. לדוגמה, ציוני דרך מרכזיים התפתחותיים משויכים לשלב 14 (התפרצות עצבים), שלב 18 (התפרצות של הסגר העצבי שפופרת), ו שלב 22 (תחילתה של התארכות זנב). 2. ניתוח העובר והכנת המדגם הכנה לפתרון להכין 2 מ”מ Ca2 + פתרון המכיל 116 מ”מ היאl, 0.67 Mm kcl, 2 מ מ”מ cacl2· 2h2O, 1.31 mm mgso4, ו 4.6 טריס mM. עבור כל פתרון 100 mL, להוסיף 1 mL של פניצילין/סטרפטומיצין (10,000 U/mL פניצילין; 10,000 μg/mL סטרפטומיצין). התאימו את ה-pH ל 7.8 והמסנן-חטא. הכנת פתרון סידן-ומגנזיום (CMF) על-ידי שילוב 116 מ”מ, 0.67 mM KCl, 4.6 mM Tris ו 0.4 מילימטר EDTA. להתאים את ה-pH ל 7.8 ו האוטוקלב לחטא. עבור כל פתרון 100 mL, להוסיף 1 mL של פניצילין/סטרפטומיצין (10,000 U/mL פניצילין; 10,000 μg/mL סטרפטומיצין). התאימו את ה-pH ל 7.8 והמסנן-חטא. הכנת צלחות לחיתוך והדמיה UV-לחטא 2 35 מ”מ מנות מפלסטיק פטרי ו 1 35 מילימטר התרבות תאים מאכל (ראה לוח חומרים). בזמן העבודה במכסה של זרם למינארי, להכין 2 50 mL שפופרות מפלסטיק המכיל 10 mL של 2 מ”מ Ca2 + פתרון כל. להישאר עובד במכסה הזרם למינארי ולהוסיף 2 מ מ 2 מילימטר Ca2 + פתרון 1 35 מ”מ צלחת פטרי, 2 מ מ 2 מילימטר ca2 + פתרון 1 35 Mm התרבות תא צלחת, ו 2 מ ל של פתרון cmf ל 1 35 מילימטר מפלסטיק צלחת פטרי. מחוץ למכסה המנוע של הזרם, ממלאים 2 100 מ”מ מנות פטרי מפלסטיק ו 1 35 צלחת פטרי מפלסטיק עם 0.1 x MMR עם גנאמיצין (50 μg/mL). מילוי צלחת פטרי 60 מ”מ עם 70% אתנול. מיד לפני הניתוח, להוסיף 0.01 g של קולאגנאז B לאחד הצינורות 50 mL המכיל Ca2 + פתרון. מערבבים היטב ומעבירים את הפתרון לצלחת פטרי טרייה מפלסטיק 60 מ”מ. בעזרת מיקרוסקופ מבתר, זהה עוברים בשלב ההתפתחותי הרצוי. השתמש בפיפטה העברה סטרילית כדי להעביר לפחות שישה עוברים מתאימים לאחד 100 מ”מ לוחות המכילים 0.1 x MMR + בג הכין בשלב 2.2.4. . זה ישמש כלוחית האחיזה השתמש בצנרת העברה סטרילית כדי להעביר עובר אחד לצלחת 100 mm השני המכיל 0.1 x MMR + בג. . זה ישמש כלוחית הניתוח אם מבתר את העוברים מספיק כדי לעבור (בערך בשלב 23 או יותר), מורדם כל עובר לפני הניתוח על ידי העברת אותו למנה המכילה 0.1% 3-האמיזואיקון חומצה אתיל אסתר מדולל ב 0.1 x MMR עם גנאמיצין (50 μg/mL). לאחר העובר הוא ללא קיבוע, להעביר אותו בחזרה למנה המכילה 0.1 x MMR עם הג (50 μg/mL) ולהמשיך עם הקרע. הסר בזהירות את קרום vitelline המקיף את העובר. זה יכול בקלות ביותר להיעשות באמצעות זוג מלקחיים קהה לייצב את העובר תוך שימוש בזוג מלקחיים עדינים כדי לתפוס את הקרום. למשוך בזהירות עם מלקחיים עדינים לקלף את קרום vitelline בנפרד. השתמש מלקחיים עדינים כדי להפריד את האזורים האלה ואת החלק הגייתי של העובר. זה יכול להיעשות באמצעות מלקחיים כדי ‘ לצבוט ‘ העובר לאורך הציר האחורי הקדמי, חיתוך אותו לחצי. עם פיפטה העברה סטרילית, להעביר את החלק ה2.2.5 לצלחת 60 mm עם הפתרון הקולגן מוכן בשלב. התעלם מהחלק הגחוני. אפשר לחקור את המטה כדי הדגירה בתמיסה הקולגן עבור 1 – 2 דקות בטמפרטורת החדר. העבירו אותו בעדינות. ללוחית הניתוח להשלים את הניתוח על ידי הסרת בזהירות את כל שרידי זיהום שיורית ומזועורי מרקמת הרקמה העצבית השוערת של האקטועור. עבור עוברים בשלב 22 או מעלה, הצינור העצבי צריך גם להיות מוסר ונמחק.הערה: אם יש צורך במהלך הניתוח, את הצלחת של 70% אתנול מוכן בשלב 2.2.4 ניתן להשתמש כדי לנקות או לחטא מחדש את הלקחיים. לאחר הניתוח יושלם, בעדינות להעביר את ההסבר לצלחת 35 mm של Ca2 + פתרון מוכן בשלב 2.2.3. חזור על שלבים 2.4-2.9 עד לאיסוף ארבעה מפעלים. השתמש P1000 מיקרופיפטה כדי להעביר את כל ארבע explants לצלחת 35 מ”מ המכיל את הפתרון CMF, לטפל כדי למנוע כל קשר בין explants וממשק מים אוויר. מערבולת בעדינות את המנה כך כל אשכול explants במרכז הצלחת. מודלת 1 h בטמפרטורת החדר כדי לאפשר explants לנתק.הערה: כדי לסייע בדיסוציאציה, 0.025% – 0.01% טריפסין ניתן להוסיף לפתרון CMF. הדבר עשוי להיות הכרחי לדיסוציאציה יעילה של עוברים מבוגרים (שלב 22 ומעלה). בשלב זה, לפחות שני עוברים מבוים כראוי צריך להישאר על צלחת ההחזקה. להעביר את העוברים האלה לתבשיל טרי מלא עם 0.1 x MMR עם הטוב ביותר בשלב 2.2.4 ולאפשר להם לפתח ללא הפרעה עם הצלחת מכוסה להתאים את הצלחת לחקור. העוברים האלה ישמשו כבקרת אחים. השתמש בדבק על מנת לצרף שמיכות מיקרו הנשלט (ראה טבלת חומרים) לחלק התחתון של 35 Mm התרבות תא תבשיל הכין בשלב 2.2.3.הערה: המקום דבס קטן של דבק סביב הקצוות של שמיכות, ואז ללחוץ אותו בחוזקה על החלק התחתון של המנה תרבות התא. הסימונים המיקום יהיה מוסתר בכל מקום את אנשי הקשר הדבק את הרשת, כך חשוב לשמור את החלק המרכזי של gridded של coverslip ללא דבק. לאחר explants יש הנתק עבור 1 h, השתמש P100 מיקרופיפטה כדי להעביר אותם לצלחת תרבות התא. על מנת לוחית כמו תאים רבים ככל האפשר על החלק gridded של המנה, להחזיק את הפיפטה בזווית רדודה קרוב לפני השטח של המנה, מיקום את העצה הפיפטה בפינה של הרשת פונה פנימה, ובחוזקה לגרש את ההשעיה התא על פני gridded. ea. באופן אידיאלי, תאים יהיה ליישב באשכול צפוף הדוק. דגירה של 1 h בטמפרטורת החדר כדי לאפשר לתאים לדבוק לצלחת. קבע ותעד את השלב ההתפתחותי של העוברים בקרת אחים כאשר הדגירה מתחילה. לשלב 5 μL 1 מילימטר Fluo-4 AM ( לראות את הטבלה של חומרים) עם 2 μl של 10% בצורת הריבוי של F-127 חומצה.הערה: Fluo-4 AM הוא רגיש בהיר ויש לשמור בשפופרת בטוחה או מכוסה בנייר כסף בכל עת. לאחר שהדגירה תושלם, הזז את המנה המדגם לחדר חושך או למיקום אחר המוגן באור. השתמש מיקרופיפטה כדי להסיר את 100 μL של פתרון מקצה המנה. הוסף את הפתרון הזה כדי להוריד את התמיסה של Fluo-4 AM/הפלורליסטית F-127 חומצה, פיפטה למעלה ולמטה כדי לערבב, ולהחזיר את הנפח המלא למנה לדוגמה. מערבולת בעדינות לערבב. לכסות את הצלחת עם רדיד אלומיניום ולאפשר דגירה של 1 h בטמפרטורת החדר. קבע ותעד את השלב ההתפתחותי של העוברים בקרת אחים כאשר הדגירה מתחילה. , בסוף הדגירה להשתמש בצינור החרוט הנותרים של 2 מ”מ Ca2 + כדי לבצע שלוש שוטף מדיה בדרך הבאה: 1) להסיר 1 ml של פתרון ממנה, להוסיף 3 מ ל של פתרון טרי, 2) להסיר 3 מ ל של הצלחת, להוסיף 3 מ ל של פתרון טרי, 3) להסיר 3 מ ל של המנה, ל 3. סידן הדמיה הערה: הדמיה בסידן בוצעה באמצעות מיקרוסקופ קונקמיות הפוך (טבלת חומרים). מניחים את צלחת המדגם על הבמה במיקרוסקופ, מטפלת להגן עליו מפני חשיפה לאור סביבתי. לאחר הצלחת מאובטח, השתמש סמן כדי לסמן את הנקודה הקדמית של הלוח כך שאותו שדה של השקפה ניתן למצוא הדמיה הבאים. אתר את המדגם מתחת למיקרוסקופ-ראשית ב-10X ולאחר מכן בהגדלה של 20X-ובחר בשדה תצוגה מתאים לדימות. שדה תצוגה אידיאלי הוא תא צפוף, אך לא כל כך צפוף שתאים מצופפים או קשים להבחנה בנפרד. כוונן את מוקד המיקרוסקופ כך שהמסווה שנשלט על-ידי הרשת יהיה גלוי. המספרים המסומנים על הכיסויים משמשים כמזהים ייחודיים עבור מקור רשת מסוים וניתן להשתמש בהם כדי לאתר את אותו שדה תצוגה עבור הדמיה נוספת. אם השדה המקורי של התצוגה שנבחר אינו חופף למספרים כלשהם, המשך לקרוא רק עד שמספר הזיהוי יהיה במסגרת. קח תמונה של שדה בהיר של השדה הנבחר של התצוגה עם שמיכות הרשת הנשלטת בפוקוס. כוונן את הגדרות המיקוד ובנה תמונה בעלת שדה בהיר של שדה התצוגה הנבחר כאשר התאים בפוקוס. עם שכבת התא בפוקוס, להאיר את הדגימות עם לייזר 488 ננומטר. ערכי HV ו-היסט יכולים להיות ממוטבים עבור כל ניסוי כדי להבטיח שטווח דינמי של פלואורסצנטית מזוהה בערוץ ה-FITC. עבור תמונה של שעתיים, לשנות את תצורת ההדמיה כדי להקליט 901 מסגרות עם זמן סריקה של 3.93 s ומרווח של 8 s. הפעל את התצורה כדי לרכוש תמונה. לאחר הדמיה הושלמה, להסיר את הצלחת משלב המיקרוסקופ. הסרת 1 mL של הפתרון מלוחית ולהחליף אותו עם 1 מ ל של 2x MFA (200 mM מגבים, 2 מ”מ EGTA, ו 2 מ”מ m Gso4 ב 7.4% פורמלדהיד). מודקת את הצלחת עבור 2 h בטמפרטורת החדר או לילה ב 4 ° c. קבע ותעד את השלב ההתפתחותי של העוברים בקרת אחים כאשר הדגירה מתחילה. לאחר קיבעון הושלמה, להסיר את כל הפתרון מלוחית ולהחליף אותו עם 2 מ ל של 1x PBS. חנות צלחות ב -4 ° צ’ לעיבוד נוסף. 4. ביטוי גנטי ניתוח: בדיקה סינתזה כפי שמתואר להלן, ליצור בדיקת RNA אנטי תחושה עבור היברידיזציה באתרו. בנוסף, ליצור בדיקה הגיוני לאותו גן לשימוש כפקד שלילי. כדי לטהר את ה-DNA המכיל את רצף התבנית בדיקה, האיחסן 150 mL של ציר LB עם מניות גלירול בקטריאלי המכיל את התבנית פלבאמצע. מודטה ב 37 ° c עם טלטול של לילה או עד התרבות הוא turbid. לטהר את הדנ א הפלסטי מהתרבות. החיידקית באמצעות שיטת הבחירה שלךהערה: אנו משתמשים בערכת ההכנה midi-Nagel כדי לקבל תשואה גבוהה של דנ א פלמיד. כדי לוודא כי הפלסמיד מכיל את ההכנסה הצפויה, לבצע תקציר הגבלה ולנתח את המוצרים על ג’ל agarose. פלביניים נימול ניתן גם לנתח על ג’ל agarose לבדוק זיהום DNA גנומית. כדי להתאים את ה-DNA של התבנית, להגדיר התגובה תקציר 100 μL הגבלה המכילה 20 μg של דנ א פלמיד, 2 μL של אנזים הגבלה מתאים, ו-1x מאגר המתאים. מודטה ב 37 ° c עבור לפחות 2 h. לחלץ דנ א ליניאריות על ידי ביצוע חילוץ פנול/כלורופורם ואחריו חילוץ כלורופורם. . מזרז דנ א עם 100% אתנול זה יכול להיעשות במהירות על ידי הוספת שני כרכים של אתנול קר כדי לדגום את זה ב-80 ° צ’ עד שהוא מתגבש (15-30 דקות). השתמש צנטריפוגה בקירור כדי כדור DNA על ידי ספינינג עבור 20 דקות ב 12,000 x g/4 ° צ’. הסר את supernatant ולשטוף את הגלולה עם 200 μL של 70% אתנול. ספין עבור 5 דקות ב 12,000 x/4 ° c. הסר את הגלולה הסופרנטאנט והאוויר היבש במשך כ-5 דקות. השהה מחדש ב -20 μL של 1x TE ואחסן ב-4 ° צ’ עד לשימוש נוסף. כדי לסנתז ולטהר אנטי היגיון בדיקה RNA, ליצור מיקס 2.5 mM rNTP ידי שילוב 15 μL של 10 מ”מ rCTP, 15 μL של 10 מ”מ rGTP, 15 μL של 10 מ”מ rATP, 9.75 μL של 10 מ”מ rUTP, ו 5.25 μL של 10 מ”מ לחפור -11 UTP (ראה לוח חומרים) הגדר את 50 μL בתגובה לתמלול ושעתוק מבחנה המכילה 4 μg של DNA תבנית לינבית משלב 4.2-4.10, 15 μL של 2.5 mM rNTP ערבוב משלב 4.11, 10 μL של מאגר תמלול 5x, 5 μL של 0.1 M DTT, 0.5 μL של מעכב RNAse (20 U/μL), ו-1.5 μL של RNA פולימו (T3, T7, או SP6). מודטה 1 h ב 37 ° c. הוסף 1.5 נוסף μL של RNA פולימראז לתגובה ולחזור 37 ° c לשעה נוספת. הוסף 1 μL של RQ1 DNAse לתגובה ו-דגירה ב 37 ° צ’ עבור 10 דקות לבזות תבנית DNA. הוסף 30 μL של 7.5 ליטר פתרון למדגם. בפיפטה לערבב ולהדגירה ב-20 ° c לפחות 1 h. באמצעות צנטריפוגה בקירור, לסובב את המדגם 25 דקות ב 14,000 x g/4 ° c. הסר את supernatant ולשטוף את הגלולה עם 500 μL של 70% אתנול. ספין עבור 5 דקות ב 14,000 x/4 ° c. הסר את הגלולה הסופרנטאנט והאוויר היבש במשך כ-5 דקות. השהה מחדש ב -20 μL של המים ללא שכירות. צור במלאי בדיקה 10x על ידי דילול המדגם לריכוז של 10 ng/μL במאגר היברידיזציה (50% הטופסאחר, 5x מתחת למטה (מלוחים-נתרן ציטראט; 750 מ”מ היום, 75 mM נתרן ציטראט, pH 7.0), 1 מ”ג/mL torula RNA, 0.1% ברצף-20, 1x הפתרון של Denhardt, 0.1% ברנשים, 10 מ”מ EDTA, ו 100 μg/mL הפארין). אחסן ב-20 ° c עד שימוש נוסף. 5. גנטית ביטוי ניתוח: קרינה פלואורסצנטית היברידיזציה הערה: יש לבצע את כל הניקוי עם כ-1 מ ל של פתרון באמצעות מעטפת סטרילי, העברה עטופה בנפרד. יש למקם את הפיפטה בקצה הצלחת בעת הסרה או הוספה של פתרון, ושוטפים יש לבצע בעדינות ככל האפשר כדי להבטיח שתאים לא ייעברו ממשטח הצלחת ויאבדו. הסר 1x PBS מלוחית (משלב 3.10). החלף עם חדש 1x PBS ו הדגירה 5 דקות בטמפרטורת החדר. שילוב 25 מ ל של 0.1 M ידרוקסיאתיל (pH 8.0) עם 62.5 μl של אנהידריד אצטית. . תערבב היטב לשטוף את הצלחת עם הפתרון הזה עבור 10 דקות. שטוף את הצלחת באמצעות מידע מהאס. פי. לשטוף את הצלחת עם 0.02 M HCl עבור 10 דקות כדי לחדור תאים. שטוף 2x ב-1x PBS עבור 5 דקות כל אחד. הסר את הפתרון ולהוסיף 1 מ ל של מאגר היברידיזציה (50% מתוך הטופסה, 5x למטה (750 mM הנרוג, 75 מ”מ נתרן ציטראט, pH 7.0), 1 מ”ג/mL-RNA, 0.1% ברצף-20, 1x הפתרון של Denhardt, 0.1% ברנשים, 10 מ”מ EDTA, ו דגירה עם טלטול לפחות 6 h ב 60 ° c. הסרת מאגר הכלאה ולהחליף עם 750 μL של 1 x RNA פתרון בדיקה (מדולל טופס מלאי 10x עשה בשלב 4.19. לחוש בבדיקות RNA ניתן להשתמש כשליטה שלילית. מודטה עם טלטול עבור 8-14 h ב 60 ° c. הסר את הגשוש ואחסן ב-20 ° c.הערה: ניתן להשתמש בדילול בדיקה של 1x עד שלוש פעמים לפני המחיקה. לשטוף את הצלחת עם 0.2 x היבריס. שוטפים עם המלון בשעה 60 מעלות צלזיוס של 0.2 x. הזיזו את הצלחות לטמפרטורת החדר ולטמפרטורה של 5 דקות. לשטוף את הצלחת עם היבריס 0.2 x עבור 5 דקות. לשטוף את הצלחת עם PBT 1x עבור 15 דקות. לשטוף את הצלחת עם 2% H2O2 ב 1x pbt (0.1% טריטון-x-100) עבור 1 H.הערה: פתרון זה הוא רגיש לאור, כך שהוא צריך להיות טרי עבור כל ניסוי מוגן מפני אור. כמו כן, יש לסוכך על הלוחות מפני אור או במהלך הדגירה. לשטוף את הצלחת עם 1 x TBST (150 מ”מ היאl, 50 mM טריס-HCl, pH 7.5, 0.1% רצף-20) עבור 15 דקות. לדלל את חסימת מגיב 2% במאגר חומצה מלפימית (100 מ”מ חומצה מלפיאית, 150 מ”מ הנאל, pH 7.5). לחסום את התאים בתערובת זו לפחות 1 h בטמפרטורת החדר. החלף פתרון חסימה עם נוגדן אנטי digoxygenin-POD מדולל 1:1000 ב 2% חסימת מגיב במאגר חומצה מלפימית. המלון משלב בין לילה ב -4 ° c. שטפו את הצלחת 3x עם ה-TBST 1. שטוף 4x עם 2mL של 1 x TBST עבור לפחות 15 דקות לשטוף עם נדנדה רציפה. לשטוף 2x עם PBT 1x עבור לפחות 10 דקות לשטוף עם נדנדה רציפה. לדלל Cy3 מעלה מצודה 1:25 ב 1x PBT. לשטוף את הצלחת עם 750 μL של דילול זה 5 דקות.הערה: פתרון זה הוא רגיש ביותר באור, ולוחיות הרישוי צריכות להישמר מאור לשארית הניסוי כדי למנוע בליית אותות. הוסף 2.5 μL של 0.3% H2O2 כדי לפתור את הפתרון הזה ואת הדגירה עם נדנדה רציפה עבור 40 נוספים מינימום בטמפרטורת החדר. לשטוף 4x עם TBST 1 x עבור לפחות 15 דקות לשטוף עם נדנדה רציפה. לשטוף עם PBT 1x. תקן את התאים על-ידי המאגררות עבור 1 h בטמפרטורת החדר ב-1x MFA (100 מ”מ ביותר, 1 מ”מ EGTA, ו-1 מ”מ m4 ב 3.7% פורמלדהיד). הסר את הפתרון והחלף ב-1x PBS. אחסן את הלוחות במיכל שאינו מכיל ב-4 ° צ’ עד לעיבוד נוסף. 6. הדמיה תאים הערה: הדמיה בוצעה באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלית וקד הפוך. מניחים את לוחית המדגם על הבמה במיקרוסקופ, יישור הסימון עשה בשלב 3.1 לקדמת הבמה. למקד את התמונה כך את הרשת מרופדת coverslip גלוי, באמצעות תמונת הרשת נלקח בשלב 3.4 כהפניה, להתאים את שדה התצוגה כדי להתאים את שדה התצוגה שנתפסו בתמונת הסידן (סעיף 3). לרכוש תמונות בשדה בהיר של הרשת והן את התאים. להאיר את הדגימות עם לייזר TRITC 595 ננומטר. התאימו את ערכי הרווח כדי להבדיל כראוי לאות מהרקע באמצעות התמונות מתאי הבקרה השליליים ורוכשים תמונת סטילס.הערה: באופן אידיאלי, רמות הזריחה ברקע נקבעים על בסיס לוחית שליטה שלילית מעובד במקביל עם בדיקה ללא מיקוד תחושה RNA. הגדרות הרווח מותאמות כך שלוחית זו תופיע לגמרי שחורה (המתאימה לרמות הרקע), ולאחר מכן הוחזק קבוע עבור לוחות אחרים הנמצאים בתמונה מתוך האצווה הניסיונית. 7. עיבוד נתונים הערה: עיבוד נתונים בוצע באמצעות תוכנת ניקון אלמנטס. פתח את התמונה 2 h סידן משלב 3.7. זהה את הפיקסלים המתאימים לכל תא בודד על-ידי בחירה באפשרות זיהוי ספוט בינארי ≫ > נקודות בהירות. ודא שערוץ ה-FITC נבחר. עיגולים צבעוניים יופיעו מעל תאים בודדים לאחר ששכבה זו נוצרה. התאם את פרמטרי ההפצה והגודל של התא כך שתאים רבים ככל האפשר יזוהו וישויך למזהה ייחודי. עקוב אחר התאים על-פני כל מסגרות התמונה על-ידי ניווט כדי להציג ≫ פקדי ניתוח > אפשרויות מעקב. הגדר 5 מסגרות כפער המירבי בין רצועות, מחק אובייקטים המשויכים לפחות מ-600 מסגרות ובחר באפשרות סגור פערים . בחר ‘ עקוב אחר קבצים בינאריים ‘ כדי להחיל מעקב אחר תאים על התמונה. לאחר מעקב אחר התאים, מחק ידנית כל אובייקט שאינו תואם לתא בודד (לדוגמה, גוש תאים). עם זאת, אין להוציא נקודות נתונים מניתוח נוסף בהתבסס על המבנה של מעקב פעילות הסידן. בחלונית ‘ תמונה ‘, בחר ‘ הצג כיסוי > הצג מזהה אובייקט בינארי’. גלול לסוף התמונה (מסגרת 901) ובחר ‘ עריכה ‘ ≫ יצירת תמונת תצוגה (8bit RGB)≫ סגרת נוכחית > אישור. פעולה זו תיצור תמונת תמונה של המסגרת האחרונה של התמונה עם המזהה הבינארי המשויך של כל תא גלוי. . שמור את התמונה הזו יצא נתוני סידרת זמן על-ידי בחירת כל האובייקטים ואחריהם ייצוא נתונים ל-Excel. שמירת פלט כקובץ CSV. פתח את תמונת הדג. מטב את זיהוי הספוט כמו בשלבים 7.1 – 7.2, באמצעות ערוץ TRITC במקום בערוץ FITC. מחק ידנית את כל הקבצים הבינאריים שהוקצו בצורה שגויה ולאחר מכן בחר באפשרות תוצאות מדידה אוטומטיות > עדכן מדידה כדי לחשב את עוצמת האות של כל תא. יצא תמונת תמונה וטבלת נתונים על-ידי שלבים חוזרים 7.5 ו-7.6. צור גיליון אלקטרוני שבו עמודה A נקראת מזהה בינארי של דגים ועמודה B נקראת מזהה סידן בינארי. פתח את התמונות שיוצאו בשלבים 7.5 ו 7.7. עבור כל אובייקט המזוהה בתמונת הדג (שלב 7.7), הקלט את המזהה הבינארי בעמודה A. לאחר מכן, אתר את התא המתאים בתמונת הסידן (שלב 7.5) והקלט את המזהה הבינארי בעמודה B. תאים שלא ניתן לזהותם בביטחון בשתי התמונות לא יתווספו לגיליון האלקטרוני.הערה: ייתכן שיהיה שימושי להשתמש בתוכנית לעריכת תמונות כגון Adobe Photoshop או עורך תמונות GIMP כדי לפתוח את שתי התמונות, להפוך אחד שקוף למחצה, ולערוך אותו על התמונה התאומה שלו כדי לזהות בקלות רבה יותר את שני המזהים הבינאריים המשויכים לכל תא. עבור כל תא מזוהה, לאסוף (באופן ידני או עם סקריפט) את נתוני הסידן של סדרת הזמן (משויך מזהה בינארי סידן ומיוצא בשלב 7.6) ואת הנתונים הגנים שלה ביטוי (משויך מזהה בינארי של הדג ומיוצא בשלב 7.7).הערה: עיבוד וניתוח נתונים במורד הזרם עשוי לכלול איסוף נתונים אלה לתוך טבלת נתונים יחידה והחלת מערך של טכניקות אנליטיות, לרבות ספירת ספייק, ניתוח פרקטלית ואנטרופיה של markovian המאפשרים לחוקר להבחין בדפוסי הרומן של פעילות הסידן 17,18.