JoVE Journal > Developmental Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
العربية

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Developmental Biology

تصوير الكالسيوم الفلوري والتهجين في الموقع اللاحق لتوصيف السلائف العصبية في زينوبوس laevis

Published: February 18, 2020
doi:
10.3791/60726
, , , , , , ,
1Department of Biological Chemistry and Molecular Pharmacology, Harvard Medical School,Harvard University, 2Department of Biology,College of William and Mary, 3Harvard Medical School,Harvard University, 4Department of Bioengineering,California Institute of Technology, 5Department of Computer Science,College of William and Mary

Summary

نقدم بروتوكولًا من جزئين يجمع بين تصوير الكالسيوم الفلوري مع التهجين في الموقع ، مما يسمح للمجرب بربط أنماط نشاط الكالسيوم بملفات تعريف التعبير الجيني على مستوى خلية واحدة.

Abstract

يمكن ملاحظة نشاط الكالسيوم داخل الخلايا في مجموعة متنوعة من أنواع الخلايا ويقترح أن تلعب أدوارًا حاسمة في مجموعة متنوعة من العمليات الفسيولوجية. على وجه الخصوص ، فإن التنظيم المناسب لأنماط نشاط الكالسيوم أثناء تكوين الأجنة ضروري للعديد من جوانب التطور العصبي الفقاري ، بما في ذلك إغلاق الأنبوب العصبي المناسب ، والتكوين العصبي ، ومواصفات النمط الظاهري للناقل العصبي. في حين أن الملاحظة بأن أنماط نشاط الكالسيوم يمكن أن تختلف في كل من التردد والسعة تشير إلى آلية مقنعة يمكن من خلالها نقل هذه التدفقات إشارات مشفرة إلى المؤثرات النهائية وتنظيم التعبير الجيني ، القائمة وتفتقر النُهج على مستوى السكان إلى الدقة اللازمة لمواصلة استكشاف هذه الإمكانية. وعلاوة على ذلك، تحد هذه النهج من دراسات دور التفاعلات بين الخلايا الخلية عن طريق منع القدرة على تحليل حالة تحديد الخلايا العصبية في غياب الاتصال بالخلية. لذلك ، أنشأنا سير عمل تجريبيًا يجمع بين تصوير الكالسيوم الفاصل بين الوقت والانتشار للنباتات العصبية المنفصلة مع تحليل التهجين في الموقع ، مما يسمح بالارتباط الواضح لنمط نشاط الكالسيوم مع الجزيئية النمط الظاهري على مستوى خلية واحدة. تمكنا بنجاح من استخدام هذا النهج لتمييز وتوصيف أنماط معينة من نشاط الكالسيوم المرتبطة بتمييز الخلايا العصبية وخلايا السلف العصبية، على التوالي. غير أن الإطار التجريبي الموصوف في هذه المقالة يمكن تكييفه بسهولة للتحقيق في الارتباطات بين أي ملف تعريف لنشاط السلاسل الزمنية والتعبير عن جين أو جينات ذات أهمية.

Introduction

الكالسيوم الخلوي الحر أمر بالغ الأهمية لمجموعة متنوعة من العمليات البيولوجية، بدءا من انتشار الخلايا والهجرة إلى موت الخلايا وautohagy1،2،3. ضمن هذه المسارات، يمكن للكالسيوم أن يمارس تأثيرات في المراحل النهائية على التعبير الجيني من خلال التفاعل مع مجالات ربط الكالسيوم للحث على تغييرات تشكيلية تعدل نشاط البروتين وتفاعلاته. على سبيل المثال، يتم عقد جهاز استشعار الكالسيوم الخلايا العصبية المعروفة باسم المغير خصم عنصر تنظيمي المصب (دريم) في تشكيل المتوسطة تتكشف عندما ملزمة الكالسيوم، ومنعه من التفاعل مع البروتين والحمض النووي أهداف4. أبعد من العمل كجزيء إشارة بسيطة ، ومع ذلك ، فإن الطبيعة الديناميكية للعابرين الكالسيوم داخل الخلايا تسمح لهذه الأنماط النشاط لترميز أكثر تعقيدا السعة أو إشارات تستند إلى التردد5،6. يتم تعزيز النقل النووي لعامل النسخ النووي للخلايا التائية المنشطة (NFAT) من خلال تذبذبات الكالسيوم عالية التردد ولكن تمنعها التذبذبات منخفضة التردد7. بشكل مقنع ، وقد اقترح العمل الأخير أن NFAT قد تستجيب في الواقع للتعرض التراكمي للكالسيوم8. كل من الكالسينيورين وكاليفورنيا2 +/ كالدودولين تعتمد على البروتين كيناز الثاني (CaMKII) أيضا يحمل استجابات متميزة لمعابري الكالسيوم من تردد معين، المدة، أو السعة9. لإضافة مستوى إضافي من التعقيد التنظيمي ، تشير النماذج الحسابية إلى أن العديد من البروتينات الملزمة للكالسيوم في المصب تصبح تعتمد بشكل أو بآخر على التردد استجابة لوجود أو عدم وجود منافسين ملزمين10،11.

داخل الجهاز العصبي النامية، تم تحديد فئتين رئيسيتين من سلوكيات نشاط الكالسيوم وترتبط مع عمليات بيولوجية محددة. يتم تصنيف تدفقات الكالسيوم على أنها “طفرات” إذا حدثت داخل الخلايا الفردية ، وتصل إلى ذروة كثافة ~ 400 ٪ من خط الأساس في غضون خمس ثوان ، وتظهر الاضمحلال الأسي المزدوج12. ويرتبط هذا النوع من الإشارات في المقام الأول مع مواصفات النمط الظاهري الناقل العصبي13. في المقابل ، يتم تعريف “الموجات” على أنها أقل عابرة من الكالسيوم أبطأ وأقل تطرفاً حيث يرتفع تركيز الكالسيوم داخل الخلية إلى ~ 200٪ من خط الأساس على مدى ثلاثين ثانية أو أكثر ، ثم يتحلل على مدى عدة دقائق12. هذه الإشارات تنتشر في كثير من الأحيان عبر خلايا مجاورة متعددة، وقد ارتبط وجودها مع نمو النيوتر وانتشار الخلايا14،15. ومع ذلك، على الرغم من أن هاتين الفئتين قد تم تعريفهما على أساس الملامح الحركية المميزة، إلا أنه لا يزال من غير الواضح بالضبط ما هي خصائص هذه الأنماط التي يتم اكتشافها بالفعل بواسطة الخلايا وترجمتها بواسطة المؤثرات النهائية.

إن فهم العلاقة بين تذبذبات الكالسيوم داخل الخلايا والتعبير الجيني من شأنه أن يوفر نظرة ثاقبة حاسمة في واحدة من الآليات التنظيمية التي تضمن التطوير المناسب ونقش الجهاز العصبي. وتحقيقا لهذه الغاية، أظهرت دراسات الحبل الشوكي الجنينية أن زيادة نشاط ارتفاع الكالسيوم أثناء التنمية يرتبط مع مستويات أعلى من الخلايا العصبية المثبطة، في حين يرتبط انخفاض نشاط ارتفاع الكالسيوم مع مستويات أعلى من الخلايا العصبية المثيرة13. ومع ذلك، لم يتم استخدام هذه الاختبارات على مستوى السكان لربط نشاط الكالسيوم بالتعبير الجيني على مستوى خلية واحدة.

الاقتراب من هذه الأسئلة على مستوى الخلية الواحدة يقدم العديد من المزايا المتميزة على العمل السابق. فمن ناحية، تسمح القدرة على تقييم نشاط الكالسيوم والتعبير الجيني في العديد من الخلايا بشكل فردي بملاحظة الذخيرة الكاملة لأنماط النشاط المتميزة دون أن يتم التعتيم عليها من خلال قياس المستوى السائب. بالإضافة إلى ذلك، فإن دراسة هذه العلاقات في الثقافة الأولية أحادية الخلية تعني أنه سيتم الحفاظ على الروابط المستقلة للخلايا بين نشاط الكالسيوم والتعبير الجيني، في حين سيتم إلغاء التفاعلات التي تتطلب الاتصال بين الخلايا. ولذلك، يسمح هذا النهج بدراسة هذه الآليات المستقلة للخلايا بمعزل عن غيرها. ومع ذلك ، فإنه يسمح أيضا دور غير خلية مستقلة عن نشاط الكالسيوم ليتم توضيحها واستجوابها. على سبيل المثال، يمكن تشريح الخلايا من الجنين في مرحلة اللوحة العصبية، واستزراعها حتى تصل الضوابط الأخوية إلى مرحلة الأنبوب العصبي، ومن ثم مقارنتها بالخلايا التي تم تشريحها حديثًا من جنين في مرحلة الأنبوب العصبي. وهذا يسمح بالمقارنة المباشرة بين الخلايا التي احتفظت بالاتصالات الخلوية عبر فترة نمو رئيسية لتلك التي تم فيها إلغاء الاتصال بين الخلايا.

في سعينا لمعالجة قيود النهج التجريبية السابقة ، وضعنا بروتوكولًا من شأنه تمكين تقييم كل من نشاط الكالسيوم والتعبير الجيني في خلايا السلف العصبية الفردية ، مما يسهل ارتباط أنماط نشاط معين ببرامج التمايز اللاحقة. تم تشريح الأنسجة العصبية من Xenopus laevis في مراحل مختلفة من التطور العصبي ، وفصلها إلى خلايا واحدة ، وتصويرها عبر المجهر المتجانس في وجود مؤشر الكالسيوم الفلوري. بعد التصوير بالخلايا الحية، تم إصلاح العينات وتصويرها عن طريق التهجين الموضعي (FISH) للكشف عن التعبير عن جين أو شكل متساوي من الاهتمام. الأهم من ذلك، يمكن تتبع الخلايا الفردية عبر كل من تجارب التصوير، مما يعني أن ملف تعريف نشاط الكالسيوم في الخلية ومستوى التعبير الجيني الخاص بها يمكن ربطهما مع بعضهما البعض(الشكل 1). البروتوكول ذكرت هنا يهدف إلى التحقيق في العلاقات بين أنماط نشاط الكالسيوم والتعبير الجيني عبر التطور العصبي الجنينية في زينوبوس laevis. ومع ذلك ، يمكن تعديل الإطار التجريبي الأوسع (التصوير الزمني أحادي الخلية يليه FISH والتسجيل المشترك للصورة) وتطبيقه على أي نوع من الخلايا تقريبًا ، ومراسل الفلورسنت ، وجين الفائدة.

Protocol

تم تنفيذ جميع الأعمال التي تنطوي على الحيوانات وفقا للبروتوكولات التي وافقت عليها لجنة رعاية الحيوانات المؤسسية واستخدامها (IACUC) في كلية وليام وماري. 1. رعاية الحيوانات والتعامل مع الأجنة حث التزاوج الطبيعي عن طريق إعطاء حقن تحت الجلد من gonadotropin المشيمي البشري (HCG) في الكيس الليمفاوي الظهري من الراشدين زينوبوس laevis بجرعة من 600 U للإناث و 400 U للذكور. بعد الحقن، ضع ضفدع واحد على الأقل وأنثى واحدة في خزان احتجاز درجة حرارة الغرفة بين عشية وضحاها. وضع البيض يبدأ عادة 9-12 ح بعد إدارة قوات حرس السواحل الهايتية. جمع الأجنة. Dejelly عن طريق الغسيل بلطف مع 2٪ السيستين (درجة الحموضة 8.0) لمدة 2-4 دقيقة. شطف الأجنة 3x في 0.1x مارك تعديل حل رينجر (MMR) (100 mM NaCl، 2 MM KCl، 1 mM MgSO4، 2 mM CaCl2، 5 mM HEPES، درجة الحموضة المعدلة إلى 7.4-7.6). نقل الأجنة إلى 100 ملم الزجاج بيتري الأطباق التي تحتوي على 0.1x MMR و 50 ميكروغرام / مل جنتامايسين. كثافة 50-100 جنين لكل طبق مناسب. احتضان الأطباق عند درجة حرارة 14 درجة مئوية إلى 22 درجة مئوية والسماح للأجنة بالتطور حتى تصل إلى مرحلة النمو المطلوبة. إزالة الخلايا غير المخصبة بشكل دوري والأجنة النخرية أو النامية بشكل غير طبيعي مع ماصة نقل البلاستيك.ملاحظة: لضمان الاتساق، يتم تنفيذ التدريج التنموي وفقًا للمعايير المورفولوجية التي حددها Nieuwkoop و Faber16. ستختلف مراحل الاهتمام استنادًا إلى التركيز التجريبي. على سبيل المثال، ترتبط المعالم العصبية النمائية الرئيسية بالمرحلة 14 (بداية النيوروليشن)، والمرحلة 18 (بداية إغلاق الأنبوب العصبي)، والمرحلة 22 (بداية اطالة الساعد الخلفي). 2. تشريح الجنين وإعداد العينة إعداد الحل إعداد 2 mM Ca2+ حل يحتوي على 116 mM NaCl, 0.67 mM KCl, 2 mM CaCl2·2H2O, 1.31 mM MgSO4,و 4.6 mM Tris. لكل محلول 100 مل، أضف 1 مل من البنسلين/ستريبتومسين (10,000 يو/مل بنسلين؛ 10,000 ميكروغرام/مل من الستريبتوماتسين). ضبط درجة الحموضة إلى 7.8 وتصفية تعقيم. إعداد محلول خالي من الكالسيوم والمغنيسيوم (CMF) من خلال الجمع بين 116 mM NaCl و 0.67 mM KCl و 4.6 mM Tris و 0.4 mM EDTA. ضبط درجة الحموضة إلى 7.8 والأوتوكلاف لتعقيم. لكل محلول 100 مل، أضف 1 مل من البنسلين/ستريبتومسين (10,000 يو/مل بنسلين؛ 10,000 ميكروغرام/مل من الستريبتوماتسين). ضبط درجة الحموضة إلى 7.8 وتصفية تعقيم. إعداد لوحات للتشريح والتصوير الأشعة فوق البنفسجية تعقيم اثنين من البلاستيك 35 ملم أطباق بيتري وواحد 35 ملم طبق ثقافة الخلية (انظر جدول المواد). أثناء العمل في غطاء تدفق لامينار، قم بإعداد أنبوبين مخروطيتين بلاستيكيتين 50 مل تحتويان على 10 مل من 2 مل كاليفورنيا2+ حل لكل منهما. تبقى تعمل في غطاء محرك السيارة تدفق laminar وإضافة 2 مل من 2 mM Ca2 + حل واحد 35 ملم البلاستيك بيتري طبق, 2 مل من 2 mM Ca2+ حل واحد 35 مم طبق ثقافة الخلية, و 2 مل من حل CMF إلى واحد 35 مم البلاستيك بيتري طبق. خارج غطاء محرك السيارة تدفق لامينار، وملء اثنين من 100 ملم أطباق بيتري البلاستيكية وواحد 35 ملم من البلاستيك بيتري طبق مع 0.1x MMR مع جنتامايسين (50 ميكروغرام / مل). ملء 60 ملم البلاستيك بيتري طبق مع الإيثانول 70٪. مباشرة قبل تشريح، إضافة 0.01 غرام من الكولاجين B إلى واحدة من أنابيب 50 مل التي تحتوي على محلول Ca2+ . مزيج جيد ونقل الحل إلى طبق بيتري البلاستيك الطازج 60 ملم. مع مساعدة من المجهر تشريح، وتحديد الأجنة من مرحلة النمو المطلوب. استخدم ماصة نقل معقمة لنقل مالاصة مناسبة على الأقل إلى واحدة من لوحات 100 مم التي تحتوي على 0.1x MMR + جنتاليسين أعدت في الخطوة 2.2.4. هذا سيكون بمثابة لوحة عقد. استخدم ماصة نقل معقمة لنقل جنين واحد إلى اللوحة الثانية مقاس 100 مم التي تحتوي على 0.1x MMR + جنتاموسين. هذا سيكون بمثابة لوحة تشريح. إذا كان تشريح الأجنة القديمة بما يكفي للتحرك (تقريبا المرحلة 23 أو أكثر)، وتشريح كل جنين قبل تشريح عن طريق نقله إلى طبق يحتوي على 0.1٪ 3-aminobenzoic استر حمض الإيثيل المخفف في 0.1x MMR مع جنتاميتشين (50 ميكروغرام / مل). بمجرد أن يتم شل الجنين، نقله مرة أخرى إلى الطبق الذي يحتوي على 0.1x MMR مع جنتاليسين (50 ميكروغرام/مل) والاستمرار في تشريح. قم بإزالة غشاء الفيتيلين الذي يحيط بالجنين بعناية. ويمكن القيام بذلك بسهولة أكبر باستخدام زوج من ملقط حادة لتحقيق الاستقرار في الجنين أثناء استخدام زوج من ملقط غرامة لفهم الغشاء. سحب بعناية مع ملقط غرامة لتقشير غشاء vitelline وبصرف النظر. استخدام ملقط غرامة لفصل المناطق الظهرية والبطنية من الجنين. ويمكن القيام بذلك باستخدام ملقط ل ‘قرصة’ الجنين على طول المحور الأمامي الخلفي، وقطع في النصف. مع ماصة نقل معقمة، نقل الجزء الظهري إلى لوحة 60 ملم مع محلول الكولاجين أعدت في الخطوة 2.2.5. تجاهل الجزء البطني. اسمح للطارد الظهري باحتضان محلول الكولاجين لمدة 1-2 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. نقلبلطف مرة أخرى إلى لوحة تشريح. إكمال تشريح عن طريق إزالة بعناية جميع التلوث endodermal وmesodermal المتبقية من الأنسجة العصبية المفترضة من ectoderm. بالنسبة للأجنة في المرحلة 22 أو أكثر، يجب أيضًا إزالة الأنبوب العصبي والتخلص منه.ملاحظة: إذا لزم الأمر أثناء تشريح، يمكن استخدام طبق الإيثانول 70٪ أعدت في الخطوة 2.2.4 لمسح أو إعادة تعقيم ملقط. بمجرد الانتهاء من تشريح، نقل بلطف explant إلى لوحة 35 ملم من كاليفورنيا2 + حل أعدت في الخطوة 2.2.3. كرر الخطوات 2.4-2.9 حتى تم جمع أربعة explants. استخدام Micropipette P1000 لنقل جميع explants الأربعة إلى لوحة 35 ملم التي تحتوي على حل CMF، مع الحرص على تجنب أي اتصال بين explants واجهة الهواء والماء. دوامة بلطف الطبق بحيث كل من الكتلة explants في وسط لوحة. احتضان 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة للسماح للنباتات الخارجية أن تنفصل.ملاحظة: للمساعدة في التفكك، يمكن إضافة 0.025%-0.01% التربسين إلى حل CMF. قد يكون هذا ضروريًا لفصل الأجنة الأكبر سنًا بكفاءة (المرحلة 22 وما فوق). عند هذه النقطة، يجب أن يبقى جنينان على الأقل على لوحة الاحتجاز. نقل هذه الأجنة إلى طبق جديد مليئة 0.1x MMR مع جنتامايسين أعدت في الخطوة 2.2.4 والسماح لهم لتطوير دون عائق مع الطبق مغطاة لتتناسب مع طبق explant. هذه الأجنة ستكون بمثابة ضوابط الأشقاء. استخدام superglue لإرفاق قسيمة تغطية صغيرة القاعدة (انظر جدول المواد)إلى الجزء السفلي من طبق ثقافة الخلية 35 ملم أعدت في الخطوة 2.2.3.ملاحظة: ضع الدبس الصغيرة من superglue حول حواف قسيمة الغلاف، ثم اضغط عليه بحزم ضد الجانب السفلي من طبق ثقافة الخلية. سيتم حجب العلامات الموضعية في أي مكان يتصل الغراء الشبكة ، لذلك من المهم الحفاظ على الجزء المركزي من قسيمة الغلاف خالية من اللاصق. بعد أن انفصلت النباتات الخارجية لمدة ساعة واحدة ، استخدم ميكروبيبات P100 لنقلها إلى طبق ثقافة الخلية. من أجل لوحة أكبر عدد ممكن من الخلايا على الجزء الشبكي من الطبق، عقد ماصة في زاوية ضحلة قريبة من سطح الطبق، ووضع تلميح ماصة في زاوية الشبكة التي تواجه الداخل، وطرد بحزم تعليق الخلية عبر شبكية ع ea. من الناحية المثالية، سوف تستقر الخلايا في كتلة كثيفة ضيقة. احتضان لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة للسماح للخلايا بالانضمام إلى لوحة. تحديد وتسجيل مرحلة النمو لأجنة التحكّم في الأشقاء عند بدء هذه الحضانة. الجمع بين 5 μL 1 m Fluo-4 AM (انظر جدول المواد)مع 2 ميكرولتر من 10٪ بلورونيتش F-127 حمض.ملاحظة: Fluo-4 AM حساس للضوء ويجب أن يبقى في أنبوب آمن بالضوء أو مغطى بالرقائق في جميع الأوقات. بعد اكتمال الحضانة، قم بنقل طبق العينة إلى غرفة مظلمة أو موقع آخر محمي بالضوء. استخدام ميكروبيبيت لإزالة 100 ميكرولتر من الحل من حافة الطبق. إضافة هذا الحل إلى aliquot من حمض فلو-4 AM/Pluronic F-127، ماصة صعودا وهبوطا لخلط، والعودة إلى حجم كامل طبق العينة. دوامة بلطف لخلط. تغطية لوحة مع رقائق الألومنيوم والسماح لاحتضان لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة. تحديد وتسجيل مرحلة النمو لأجنة التحكّم في الأشقاء عند بدء هذه الحضانة. في نهاية الحضانة، استخدم الأنبوب المخروطي المتبقي من 2 مل كاليفورنيا2+ لأداء ثلاث وسائط غسل على النحو التالي: 1) إزالة 1 مل من الحل من الطبق، إضافة 3 مل من محلول طازج، 2) إزالة 3 مل من الحل من الطبق، إضافة 3 مل من محلول طازج، 3) إزالة 3 مل من محلول من الطبق، إضافة 3 مل من الحل الطازج من الطبق، إضافة 3 مل من محلول جديد. 3. تصوير الكالسيوم ملاحظة: تم إجراء تصوير الكالسيوم باستخدام مجهر مقلوب(جدول المواد). ضع لوحة العينة على مرحلة المجهر، مع الحرص على حمايتها من التعرض للضوء المحيط. بمجرد تأمين اللوحة ، استخدم علامة لتسمية النقطة الأمامية لللوحة بحيث يمكن العثور على نفس مجال الرؤية في التصوير اللاحق. حدد موقع العينة تحت المجهر — أولاً عند 10 X ثم عند التكبير 20X — وحدد مجال رؤية مناسب للتصوير. مجال الرؤية المثالي هو كثيف الخلية، ولكن ليس كثيفة بحيث يتم تجميع الخلايا أو يصعب تمييزها بشكل فردي. ضبط تركيز المجهر بحيث يكون قسيمة الغطاء التي تحكم هاوية الشبكة مرئية. تعمل الأرقام التي تم وضع علامة عليها على قسيمة الغلاف كمعرفات فريدة لموضع شبكة معين ويمكن استخدامها لتحديد موقع نفس مجال العرض للتصوير الإضافي. إذا لم يتداخل حقل العرض المحدد في الأصل مع أي أرقام، فأعد ّالحتى يكون الرقم الذي يمكن التعرف عليه في الإطار. التقاط صورة حقل مشرق من حقل العرض المحدد مع غطاء الشبكة التي يحكمها في التركيز. ضبط إعدادات التركيز والتقاط صورة حقل مشرق من حقل العرض المحدد مع الخلايا في التركيز. مع طبقة الخلية في التركيز، وإلقاء الضوء على العينات مع ليزر 488 نانومتر. يمكن تحسين قيم HV و Offset لكل تجربة لضمان اكتشاف نطاق ديناميكي من الفلورية على قناة FITC. للحصول على صورة لمدة ساعتين، قم بتعديل تكوين التصوير لتسجيل إطارات 901 مع وقت مسح 3.93 ثانية وفاصل زمني من 8 s. تشغيل التكوين للحصول على صورة. بمجرد اكتمال التصوير، قم بإزالة اللوحة من مرحلة المجهر. إزالة 1 مل من الحل من لوحة واستبداله امل 1 من 2x MEMFA (200 mM MOPS، 2 mM EGTA، و 2 مل ملغسو4 في 7.4٪ الفورمالديهايد). احتضان لوحة لمدة 2 ساعة في درجة حرارة الغرفة أو بين عشية وضحاها في 4 °C. تحديد وتسجيل مرحلة النمو لأجنة التحكّم في الأشقاء عند بدء هذه الحضانة. بعد اكتمال التثبيت ، قم بإزالة جميع المحلول من اللوحة واستبداله بـ 2 مل من 1x PBS. تخزين لوحات في 4 درجة مئوية لمزيد من المعالجة. 4. تحليل التعبير الجيني: توليف التحقيق كما هو موضح أدناه ، توليد antisense RNA التحقيق في الموقع التهجين. بالإضافة إلى ذلك، توليد مسبار الشعور لنفس الجين لاستخدامها كسيطرة سلبية. من أجل تنقية الحمض النووي البلازميد التي تحتوي على تسلسل قالب التحقيق، inoculate 150 مل من مرق LB مع مخزون الجلسرين البكتيرية التي تحتوي على بلازميد القالب. احتضان في 37 درجة مئوية مع اهتزاز بين عشية وضحاها أو حتى الثقافة عكرة. تنقية الحمض النووي البلازميد من الثقافة البكتيرية باستخدام الطريقة التي تختارها.ملاحظة: نحن نستخدم مجموعة McNary-Nagel midi-prep للحصول على عوائد عالية من الحمض النووي البلازميد. للتأكد من أن البلازميد يحتوي على إدراج المتوقع، وإجراء هضم تقييد وتحليل المنتجات على هلام أغاروز. يمكن أيضًا تحليل البلازميد غير المصقول على هلام أغاروز للتحقق من وجود تلوث الحمض النووي الجينومي. لإضفاء الطابع الخطي على الحمض النووي القالب، قم بإعداد تفاعل هضم تقييد 100 ميكرولتر يحتوي على 20 ميكروغرام من الحمض النووي البلازميد، و2 ميكرولتر من إنزيم التقييد المناسب، والمخزن المؤقت المناسب 1x. احتضان في 37 درجة مئوية لمدة 2 ساعة على الأقل. استخراج الحمض النووي الخطي عن طريق إجراء استخراج الفينول / الكلوروفورم تليها استخراج الكلوروفورم. يُعجّل الحمض النووي بالإيثانول بنسبة 100%. ويمكن القيام بذلك بسرعة عن طريق إضافة مجلدين من الإيثانول البارد إلى العينة واحتضانه عند -80 درجة مئوية حتى يتماسك (15-30 دقيقة). استخدام جهاز طرد مركزي مبرد ة لبيليه الحمض النووي عن طريق الغزل لمدة 20 دقيقة في 12،000 × ز / 4 درجة مئوية. إزالة supernatant وغسل بيليه مع 200 ميكرولتر من الإيثانول 70٪. تدور لمدة 5 دقيقة في 12،000 × ز / 4 درجة مئوية. إزالة supernatant والهواء الجاف بيليه لمدة 5 دقيقة تقريبا. Resuspend في 20 ميكرولتر من 1x TE وتخزينها في 4 درجة مئوية حتى مزيد من الاستخدام. لتوليف وتنقية مسبار الحمض النووي الريبي المضاد للتحسس، قم بإنشاء مزيج rNTP 2.5 مل من خلال الجمع بين 15 ميكرولتر من 10 mM rCTP، و 15 ميكرولتر من 10 mM rGTP، و 15 ميكرولتر من 10 mM rATP، و 9.75 ميكرولتر من 10 mM rUTP، و 5.25 ميكرولتر من 10 mM dig-11 UTP (انظر جدول المواد). إعداد 50 ميكرولتر في تفاعل النسخ المختبري الذي يحتوي على 4 ميكروغرام من الحمض النووي للقالب الخطي من الخطوة 4.2-4.10، 15 ميكرولتر من مزيج 2.5 مل rNTP من الخطوة 4.11، 10 ميكرولتر من المخزن المؤقت النسخ 5x، 5 ميكرولتر من 0.1 M DTT، 0.5 ميكرولتر من مثبط الحمض النووي الريبي (20 U/μL)، و 1.5 ميكرولتر من البوليمر الحمض النووي الريبي المناسبة (T3، T7، أو SP6). احتضان 1 ساعة في 37 درجة مئوية. إضافة 1.5 ميكرولتر إضافية من البوليميراز الحمض النووي الريبي إلى رد الفعل والعودة إلى 37 درجة مئوية لمدة ساعة إضافية. أضف 1 ميكرولتر من RQ1 DNAse إلى التفاعل واحتضان ها37 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة لتدهور قالب الحمض النووي. إضافة 30 ميكرولتر من محلول LiCl 7.5 M إلى عينة. ماسيت لخلط واحتضان في -20 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة على الأقل. باستخدام جهاز طرد مركزي مبرد، قم بتدوير العينة 25 دقيقة عند 14,000 × ز/4 درجة مئوية. إزالة supernatant وشطف بيليه مع 500 ميكرولتر من الإيثانول 70٪. تدور لمدة 5 دقيقة في 14،000 × ز / 4 درجة مئوية. إزالة supernatant والهواء الجاف بيليه لمدة 5 دقيقة تقريبا. Resuspend في 20 ميكرولتر من المياه الخالية من nuclease. إنشاء في مخزون التحقيق 10x عن طريق تخفيف العينة إلى تركيز 10 نانوغرام / ميكرولتر في العازلة التهجين (50٪ formamide، 5x SSC (سترات الصوديوم المالحة؛ 750 mM NaCl، 75 mM سترات الصوديوم، درجة الحموضة 7.0)، 1 ملغ/مل تورولا RNA، 0.1% Tween-20، 1x حل Denhardt،0.1% CHAPS، 10 mM EDTA، و 100 ميكروغرام/مل الهيبارين). تخزين في -20 درجة مئوية حتى مزيد من الاستخدام. 5. تحليل التعبير الجيني: التهجين في الموقع ملاحظة: يجب إجراء جميع الغسل مع ما يقرب من 1 مل من الحل باستخدام ماصة نقل معقمة وملفوفة بشكل فردي. يجب وضع الماصة على حافة اللوحة عند إزالة أو إضافة الحل ، ويجب إجراء الغسل بلطف قدر الإمكان لضمان عدم إزاحة الخلايا من سطح اللوحة وفقدانها. إزالة 1x PBS من لوحة (من الخطوة 3.10). استبدال مع 1x PBS الطازجة واحتضان 5 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. الجمع بين 25 مل من 0.1 M تريإيثانولامين (درجة الحموضة 8.0) مع 62.5 ميكرولتر من أنهيدريد الخل. مزيج جيد. غسل لوحة مع هذا الحل لمدة 10 دقيقة. غسل لوحة مع 1x SSC لمدة 5 دقيقة. غسل لوحة مع 0.02 M HCl لمدة 10 دقيقة لpermeabilize الخلايا. غسل 2x مع 1x PBS لمدة 5 دقيقة لكل منهما. إزالة الحل وإضافة 1 مل من المخزن المؤقت التهجين (50٪ formamide، 5x SSC (750 mM NaCl, 75 mM سترات الصوديوم, درجة الحموضة 7.0), 1 ملغ/مل torula RNA, 0.1% Tween-20, 1x حل Denhardt,0.1% CHAPS, 10 mM EDTA, و 100 ميكروغرام/مل الهيبارين) إلى لوحة. احتضان مع اهتزاز لمدة 6 ساعة على الأقل في 60 درجة مئوية. إزالة التهجين المخزن المؤقت واستبدال مع 750 ميكرولتر من 1x محلول التحقيق الجيش الملكي النيبالي (شكل مخفف الأسهم 10x المحرز في الخطوة 4.19. يمكن استخدام تحقيقات الحمض النووي الريبي الإحساس كتحكم سلبي. احتضان مع اهتزاز ل8-14 ساعة في 60 درجة مئوية. إزالة التحقيق وتخزينها في -20 درجة مئوية.ملاحظة: يمكن إعادة استخدام تخفيف مسبار 1x حتى ثلاث مرات قبل التخلص منه. شطف لوحة مع 0.2x SSC. يغسل مع الطازجة 0.2x SSC لمدة ساعة واحدة في 60 درجة مئوية. نقل لوحات إلى درجة حرارة الغرفة وequilibrate لمدة 5 دقيقة. غسل لوحة مع 0.2x SSC لمدة 5 دقيقة. غسل لوحة مع 1x PBT لمدة 15 دقيقة. غسل لوحة مع 2٪ H2O2 في 1x PBT (0.1٪ تريتون-x-100) لمدة 1 ساعة.ملاحظة: هذا الحل حساس للضوء، لذلك يجب أن يكون طازجًا لكل تجربة ومحميًا من الضوء. كما يجب حماية اللوحات من الضوء أو إحباطها أثناء هذه الحضانة. غسل لوحة مع 1x TBST (150 mM NaCl، 50 mM Tris-HCl، درجة الحموضة 7.5، 0.1٪ Tween-20) لمدة 15 دقيقة. تمييع الكاشف المنع إلى 2٪ في المخزن المؤقت حمض ماليك (100 mM حمض ماليك، 150 mM NaCl، درجة الحموضة 7.5). منع الخلايا في هذا الخليط لمدة ساعة واحدة على الأقل في درجة حرارة الغرفة. استبدال منع الحل مع الأجسام المضادة لdigoxygenin-POD المخفف 1:1000 في 2٪ حجب الكاشف في العازلة حمض ماليك. احتضان بين عشية وضحاها في 4 °C. شطف لوحة 3x مع 1x TBST. غسل 4x مع 2مل من 1x TBST لمدة 15 دقيقة على الأقل لكل غسل مع هزاز مستمر. غسل 2x مع 1x PBT لمدة 10 دقيقة على الأقل لكل غسل مع هزاز مستمر. تمييع Cy3-مترافق tyramide 1:25 في 1x PBT. غسل لوحة مع 750 ميكرولتر من هذا التخفيف لمدة 5 دقيقة.ملاحظة: هذا الحل حساس للغاية، ويجب الاحتفاظ بألواح تم إحباطها أو حمايتها من الضوء لبقية التجربة لتجنب تدهور الإشارة. أضف 2.5 ميكرولتر من 0.3% H2O2 إلى هذا الحل واحتضان مع هزاز مستمر لمدة 40 دقيقة إضافية في درجة حرارة الغرفة. غسل 4x مع 1x TBST لمدة 15 دقيقة على الأقل لكل غسل مع هزاز مستمر. شطف مع 1x PBT. إصلاح الخلايا عن طريق احتضان لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة في 1x MEMFA (100 mM MOPS، 1 mM EGTA، و 1 mM MgSO4 في 3.7٪ الفورمالديهايد). إزالة الحل واستبدالها مع 1x PBS. تخزين لوحات في وعاء أحبطت في 4 درجة مئوية حتى مزيد من المعالجة. 6. خلايا التصوير ملاحظة: تم إجراء التصوير باستخدام مجهر مقلوب. ضع لوحة العينة على مرحلة المجهر ، ومحاذاة العلامة المصنوعة في الخطوة 3.1 إلى الجزء الأمامي من المرحلة. قم بتركيز الصورة بحيث تكون قسيمة الغطاء المبطنة بالشبكة مرئية، وباستخدام صورة الشبكة المأخوذة في الخطوة 3.4 كمرجع، قم بضبط مجال الرؤية لتتناسب مع مجال الرؤية الذي تم التقاطه في صورة الكالسيوم (القسم 3). الحصول على صور الحقل الساطع لكل من الشبكة والخلايا. إلقاء الضوء على العينات مع ليزر TRITC 595 نانومتر. ضبط قيم الكسب لتمييز الإشارة من الخلفية بشكل مناسب باستخدام الصور من خلايا التحكم السلبية والحصول على صورة ثابتة.ملاحظة: من الناحية المثالية، يتم تحديد مستويات الفلورسينس الخلفية استناداً إلى لوحة التحكم السلبية معالجتها بالتوازي مع التحقيق الحمض النووي الريبي الشعور غير المستهدف. يتم ضبط إعدادات الكسب بحيث تظهر هذه اللوحة سوداء تمامًا (المقابلة لمستويات الخلفية) ، ثم يتم الاحتفاظ بها ثابتة لللوحات الأخرى التي تم تصميمها من تلك الدفعة التجريبية. 7- معالجة البيانات ملاحظة: تم تنفيذ معالجة البيانات باستخدام برنامج عناصر نيكون. افتح صورة الكالسيوم 2 ساعة من الخطوة 3.7. تحديد بكسل المقابلة لكل خلية على حدة عن طريق تحديد ثنائي > الكشف عن بقعة > النقاط المضيئة. تأكد من تحديد قناة FITC. ستظهر الدوائر الملونة فوق الخلايا الفردية بعد إنشاء هذه الطبقة. ضبط معلمات توزيع الخلايا وحجمها بحيث يتم التعرف على أكبر عدد ممكن من الخلايا واقترانها بمعرف فريد. تتبع الخلايا عبر جميع إطارات الصورة من خلال التنقل إلى عرض > ضوابط التحليل > خيارات التتبع. تعيين 5 إطارات كفجوة قصوى بين المسارات، وحذف الكائنات المرتبطة بأقل من 600 إطار، وحدد خيار إغلاق الفجوات. حدد تتبع الثنائيات لتطبيق تتبع الخلية على الصورة. بعد تعقب الخلايا، قم بحذف أي كائن لا يتوافق مع خلية فردية يدويًا (على سبيل المثال كتلة من الخلايا). ومع ذلك، لا ينبغي استبعاد نقاط البيانات من إجراء مزيد من التحليل على أساس مورفولوجيا أثر نشاط الكالسيوم. على جزء الصورة، حدد عرض تراكب > إظهار معرف الكائن الثنائي. انتقل إلى نهاية الصورة (الإطار 901) وحدد تحرير > إنشاء لقطة عرض (8bit RGB)> الإطار الحالي > موافق. سيؤدي ذلك إلى إنشاء لقطة للإطار الأخير للصورة مع المعرف الثنائي المرتبط بكل خلية مرئي. حفظ هذه الصورة. تصدير بيانات السلاسل الزمنية عن طريق تحديد كافة الكائنات متبوعة ببيانات التصدير إلى Excel. حفظ الإخراج كملف CSV. افتح صورة FISH. قم بتحسين الكشف عن النقاط كما هو الحال في الخطوات 7.1-7.2، باستخدام قناة TRITC بدلاً من قناة FITC. حذف أي ثنائيات معينة بشكل غير صحيح يدويًا، ثم حدد نتائج القياس التلقائية > تحديث القياس لحساب كثافة الإشارة لكل خلية. تصدير لقطة صورة وجدول بيانات عن طريق تكرار الخطوات 7.5 و 7.6. إنشاء جدول بيانات حيث يسمى العمود A معرف ثنائي FISH والعمود B يسمى معرف ثنائي الكالسيوم. افتح الصور المصدرة في الخطوتين 7.5 و7.7. لكل كائن تم تعريفه في صورة FISH (الخطوة 7.7)، قم بتسجيل المعرف الثنائي في العمود A. ثم حدد موقع الخلية المقابلة في صورة الكالسيوم (الخطوة 7.5) وسجل هذا المعرف الثنائي في العمود B. لا يجب إضافة الخلايا التي لا يمكن تعريفها بثقة في كلتا الصورتين إلى جدول البيانات.ملاحظة: قد يكون من المفيد استخدام برنامج تحرير الصور مثل Adobe Photoshop أو محرر الصور GIMP لفتح الصورتين، وجعل صورة واحدة شبه شفافة، وتراكبها على صورة شريكها لتحديد وربط المعبريتين الثنائيتين المرتبطتين بكل خلية بسهولة أكبر. لكل خلية محددة، قم بتجميع بيانات الكالسيوم الخاصة بها (المرتبطة بمعرف ثنائي الكالسيوم وتصديرها في الخطوة 7.6) وبيانات التعبير الجيني الخاص بها (المرتبطة بمعرف ثنائي FISH وتصديرها في الخطوة 7.7).ملاحظة: قد تتضمن معالجة البيانات والتحليل في المصب تجميع هذه البيانات في جدول بيانات واحد وتطبيق مجموعة من التقنيات التحليلية بما في ذلك عد المسامير، والتحليل الكسورية، والإنتروبيا الماركوفية التي تسمح للمحقق بتمييز الأنماط الجديدة لنشاط الكالسيوم 17،18.

Representative Results

يمكن رؤية مثال ناجح للخلايا المنفصلة المعدة لتصوير الكالسيوم في الشكل 2A. الخلايا مطلية بكثافة، مما يسمح بجمع أكبر قدر ممكن من المعلومات من كل صورة، ولكن ليس مطلياً بكثافة بحيث لا يمكن تمييز الخلايا الفردية بثقة. يتم الكشف عن الفلورسينس لكل خلية محددة خلال فترة التصوير 2 ساعة. يكشف تصور مؤامرة مركبة تحتوي على آثار لجميع الخلايا المسجلة في تجربة عن الدرجة التي يمكن أن تحجب بها القياسات السائبة أو السكانية أنماطًا أكثر دقة لسلوك التكيّف(الشكل 2B). عندما يتم عزل الملامح المسجلة للخلايا الفردية، يمكن تحديد أمثلة على نشاط التكيّف غير المنتظم الذي يميز خلايا السلف العصبية بوضوح. على عكس الخلايا العصبية الناضجة ، تظهر الخلايا العصبية الجنينية طبيعة غير منتظمة ومتغيرة للغاية ومعقدة لنشاط الكالسيوم(الشكل 2B). من أجل تحديد هذا التعقيد ، تم تطبيق أساليب تحليل البيانات المختلفة17،18، بما في ذلك معلمات متنوعة لتحديد ارتفاع(الشكل 2C). يمكن تقييم التفلور الناجح في التهجين الموقعي ، بما في ذلك التصميم الناجح وتوليف مسبار مرنا المضاد للتحسس ، من خلال مقارنة اللوحة التجريبية ضد التحكم في الخلفية المحتضنة مع التحكم في الحمض النووي الريبي غير الملزم(الشكل 3A ، B). ويمكن أيضا إجراء مراقبة التحقيق إيجابية عن طريق معالجة نوع الخلية المعروفة للتعبير عن مرنا الهدف في مستويات يمكن الكشف عنها. يتطلب تحديد نفس الخلية عبر الكالسيوم وتصوير FISH أن تحتفظ الخلايا بنفس الوضع تقريبًا أثناء تهجين التحقيق ومعالجته. إذا تم التعامل مع اللوحات تقريبًا أو تم تنفيذ السُلم بقوة كبيرة ، يمكن إزاحة الخلايا من سطح اللوحة وإما فقدانها عند التخلص من المحلول أو إيداعه في موقع مختلف على اللوحة ، مما يجعل من المستحيل عليها أن تكون متطابقة عبر الصور(الشكل 4A). إذا كان هذا التعطيل يؤثر فقط على بعض الخلايا في مجال الرؤية، قد يكون من الممكن الكشف عن وتعيين بعض الخلايا داخل الصورة(الشكل 4B). ومع ذلك ، يتم الحصول على الحد الأقصى من كمية البيانات من تجربة يتم فيها تنفيذ FISH بعناية ويتم فقدان عدد قليل من الخلايا أو إعادة وضعها بين الصور(الشكل 4C). بمجرد جمع البيانات لوصف كل من نشاط الكالسيوم والتعبير الجيني لعدد معقول من الخلايا في مرحلة النمو (الخلايا) ذات الأهمية ، يمكن إجراء المزيد من التحليلات لتقييم الارتباطات بين هاتين الميزتين(الشكل 1). وقد تم تطبيق عدد من المقاييس لتحديد أنماط نشاط الكالسيوم ، بما في ذلك ارتفاع العد / التردد ، ومتوسط الطاقة ، وتقدير الأس هيرست ، وقياس الانتروبيا ماركوفيا17،18. يمكن تعريف التعبير الجيني كمًا حسب مستوى الفلورية المطلق أو تصنيفه على مقياس ثنائي (نعم/لا) اعتمادًا على الأسئلة التجريبية التي يتم تناولها. كشفت نتائج التجارب التي جمعت نشاط الكالسيوم مع التعبير عن جينات علامة السلف العصبية عن العديد من الروابط بين أنماط محددة من نشاط الكالسيوم والأنماط الظاهرية للناقل العصبي. في مرحلة اللوحة العصبية (المرحلة 14) ، الخلايا GABAergic التعبير عن علامة الخلايا العصبية المثبطة gad1.1 يحمل نشاط الكالسيوم الذي هو أكثر انتظاما وأعلى السعة من تلك الخلايا التي تفتقر إلى التعبير gad1.1 (الشكل 5A). وعلاوة على ذلك، في حين ترتبط هذه الخلايا gad1.1- التعبير مع مستويات أعلى من ارتفاع السعة ارتفاع، ارتفاع السعة منخفضة هو أكثر تواترا في الخلايا الجلوتامات التعبير عن علامة العصبية مثير slc17a7. الشكل 1: تخطيطي لسير العمل التجريبي. مقياس شريط = 100 ميكرون. تم التقاط الصور في لوحات 3-5 من Paudel وآخرون (2019)17. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. الشكل 2: تصوير الكالسيوم ومثال على ملامح النشاط. (أ)نشاط الكالسيوم داخل الخلايا كما ذكرت فلو4-AM. كل صورة 2 h يتكون من 901 إطارات، مع عرض إطار تمثيلي واحد هنا. (ب)مؤامرة مركبة من شدة الفلورسينس مع مرور الوقت في جميع الخلايا داخل مجال الرؤية المصوّرة. تشير الآثار بوضوح إلى التبييض الضوئي لصبغة المؤشر (Fluo4) العمل الإضافي. مؤامرة راستر على أعلى اليسار يظهر آثار تمثيلية من نشاط الكالسيوم بعد تطبيق خوارزمية دي تتجه التي وضعتها Eilers وBoelen19, حيث تظهر الخلايا هنا تظهر نمط متنوع من السلوك spiking. (ج)تطبيق عتبات مختلفة (150% و200% من خط الأساس، حيث يكون خط الأساس هو متوسط كثافة الفلورسنت غير الموجهة) لتعريف ارتفاع (الأسهم الخضراء والزرقاء). مقياس شريط = 100 ميكرون. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. الشكل 3: تصوير الأسماك. (أ)الأسماك التي أجريت مع غير ملزمة بمعنى RNA التحقيق كسيطرة سلبية. تم ضبط إعدادات التصوير بحيث لا تظهر أي خلايا فلورية. وقد تشمل بعض مجالات الرؤية الحطام غير الخلوي مع بعض الفلورسينس، كما هو الحال في الزوايا اليمنى العليا والسفلية من (A)؛ يمكن تجاهل هذه لغرض إعداد الخلفية. (ب)ثم تستخدم إعدادات التصوير نفسه لتصوير لوحة تجريبية (مسبار الحمض النووي الريبي المضاد للتحسس). الفلورة في ظل هذه الظروف يتوافق مع التعبير الجيني فوق الخلفية. مقياس شريط = 100 ميكرون. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. الشكل 4: تراكب الصورة والتسجيل المشترك. التمثيلات التخطيطية لعينة مصوّرة لنشاط الكالسيوم (الخلايا التي تمثلها الدوائر الخضراء المملوءة) وبعد FISH (الخلايا التي تمثلها دوائر حمراء ملقّت). (أ)الخلايا التي تحركت بشكل كبير أثناء معالجة العينة ومعالجتها لا يمكن التعرف عليها بشكل موثوق عبر الصورتين. (ب)قد يؤثر اضطراب الخلايا على بعض الخلايا فقط في مجال الرؤية. يمكن تحديد بعض الخلايا بوضوح في كلتا الصورتين، بينما لا يمكن مطابقة خلايا أخرى بثقة. (C)إذا تم التعامل مع العينات بعناية، فإن معظم الخلايا ستبقى دون عائق ويمكن التعرف عليها في كلتا الصورتين. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. الشكل 5: مثال على تطبيق هذه الطريقة، boxplots تظهر الجمعيات بين نشاط الكالسيوم والتعبير الجيني (GABA والتخمة للجينات gad1.1 وslc17a7 على التوالي) في مرحلة اللوحة العصبية زينوبوس laevis. في المرحلة 14, gad1.1-postive الخلايا (GABA) يحمل أعلى السعة وأكثر انتظاما نشاط الكالسيوم على النحو المحدد من قبل (A) ماركوفيان entropy18 و(B)ارتفاع التهم باستخدام عتبات 125%, 150%, 200% و 300% من متوسط كثافة الفلورسنت دي تتجه (خط الأساس)17 من slc s17a7 الخلايا الإيجابية (تخمة). تشير النجوم إلى اختلافات ذات دلالة إحصائية وفقًا لكل من اختبار كولموجوروف-سميرنوف الذي تم تصحيحه من Bonferroni (p 100 خلية؛ * 0.2 ≤ |d| |d| < 0.5). وأعيد رسم الرقم وتكييفه من مجموعة البيانات التي تمالحصول عليها من باوديل وآخرون. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Discussion

وقد لوحظت أنماط مميزة من نشاط الكالسيوم في الخلايا التي تشكل الجهاز العصبي النامية، مع أنواع محددة من النشاط المرتبطة بعمليات النمو العصبي المتميز. ومع ذلك، فإن زيادة فهم الآليات التي تترجم بها أنماط النشاط الكثيفة المعلومات هذه إلى استجابات نسخية يتطلب معلومات عن نشاط الكالسيوم والتعبير الجيني ليتم جمعها بدقة الخلية الواحدة. في حين أن الأنظمة التي تظهر نشاط الكالسيوم أكثر نمطية، مثل الخلايا العصبية الناضجة، يمكن أن تكون منعامة بشكل معقول على مستوى السائبة، فإن الأنماط غير المنتظمة التي تميز الجهاز العصبي الجنيني يتم ملثمين بسهولة من خلال تسجيلات أقل دقة.

الإطار التجريبي الذي تم إنشاؤه في هذا البروتوكول يمكن تكييفه بسهولة مع مجموعة واسعة من أنواع الخلايا ومراسلي الفلورسنت. يمكن تشريح الأنسجة التي تحتوي على أي نوع خلية أو مجموعة من أنواع الخلايا تقريبًا من كائن حي نموذجي مهم ومطلية بالتصوير أحادي الخلية. بالإضافة إلى السماح بتحديد الخلية وعزل تأثير العمليات المستقلة للخلية ، يسمح نهج ثقافة الخلية الأساسية للمجرب بتعريف مكونات الوسائط على النحو المطلوب. على سبيل المثال، تم إجراء تجارب مقارنة نشاط السلائف العصبية في 2 mM Ca2+ حل للتحقيق في ما إذا كانت العلاقات بين تردد ارتفاع والنمط الظاهري الناقل العصبي في الحبل الشوكي الجنينية يمكن تلخيصها دون تأثير التفاعلات الخلية الخلية13،20.

في حين أن هذا البروتوكول يستفيد من علامة الفلورسنت Fluo4-AM للكشف عن نشاط الكالسيوم داخل الخلايا ، اعتمادًا على معايير الاختيار ، يمكن للمستخدمين تحديد علامات أخرى متاحة تجاريًا21، بما في ذلك مؤشرات الكالسيوم المشفرة وراثياً. وبالمثل، يمكن استخدام علامات بديلة لرصد التغيرات الديناميكية لتركيز أيون الفائدة (بما في ذلك K+، Na+، و Zn2 +)، أو احتمال الغشاء ، أو درجة الحموضة الخلوية. يمكن تعديل إعدادات التصوير ومدة الصورة حسب الضرورة.

على الرغم من أننا ربط نشاط الكالسيوم والنمط الظاهري العصبي كتطبيق معين، وهذا الأسلوب ينطبق أيضا على مجموعة متنوعة من الخصائص الخلوية الأخرى. على سبيل المثال ، يمكن إجراء التهجين في الموقع مع تحقيقات ضد أي جين مهم ، بما في ذلك علامة الخلايا العصبية ChAT أو عامل النسخ Engrailed ، مما يسمح بالكشف الحساس عن لوحة قابلة للتخصيص من أنواع مرنا. ويمكن تصميم هذه المسابير لتكون محددة isoform، ودعم خصوصية الهدف إضافية إذا رغبت في ذلك. يمكن إجراء الـ FISH مزدوجة باستخدام تحقيقات مترافقة مع عدة فلوروفورات مختلفة ، مما يسمح بإجراء تقييم متزامن للتعبير عن جينات متعددة. ومع ذلك، ترتبط السُلُم الإضافية التي يتطلبها هذا النوع من التجارب بزيادة فرصة فقدان الخلايا أو حركتها وتتطلب خبرة وحساسية ليتم تنفيذها بنجاح.

بغض النظر عن أي تغييرات خاصة بالتجربة التي تم إجراؤها على هذا البروتوكول، هناك العديد من الخطوات الرئيسية التي تتطلب الانتباه الدقيق. وينبغي إجراء التشريح بعناية لإزالة جميع الأنسجة الملوثة أو مجموعات الخلايا؛ لأن الأنماط المكانية تضيع عندما يتم فصل explants، أي الخلايا المتبقية من الأنسجة المجاورة سوف تصبح تتخللها ولا يمكن تمييزها عن الخلايا ذات الاهتمام. بعد أن يتم مطلي الخلايا، يجب التعامل مع العينات بلطف قدر الإمكان لمنع الخلايا من أن يتم طردها. الأهم من ذلك، وهذا يعني أن جميع التغييرات الحل ينبغي أن يتم تنفيذببطء وبعناية، مع ماصة وضعت على حافة لوحة عندما يتم إزالة الحل وإضافته. وهذا يضمن أن الخلايا يمكن التعرف عليها بثقة في كل من الكالسيوم وصور FISH. إذا تعطلت الخلايا أثناء المعالجة، فقد يكون من المستحيل تحديد بعض أو كل الخلايا المقابلة بين الصورتين. وننصح بتوخي الحذر في هذه التعيينات، بحيث لا تستخدم سوى الخلايا المقابلة بشكل لا لبس فيه لإجراء مزيد من التحليل.

وتبعاً للمسألة البيولوجية التي يجري تناولها، قد يكون من المناسب اتباع مجموعة متنوعة من نُهج التحليل. يمكن معالجة نشاط الكالسيوم في السلسلة الزمنية وقياسه كمياً بطرق متنوعة، مع مرونة مجربة في اختيار معلمات إزالة الاتجاه، ومقاييس التحليل، ومعلمات التحليل (على سبيل المثال، النسبة المئوية لعتبة خط الأساس المستخدمة لتعريف ارتفاع الكالسيوم). يمكن رسم الارتباطات بين نشاط الكالسيوم ومستوى التعبير الجيني من خلال تحليل التعبير الجيني كقيمة فلورية مطلقة أو نسبية مستخرجة من صورة FISH. وبدلاً من ذلك، يمكن رسم الارتباطات بين نشاط الكالسيوم والتعبير الجيني (الحضور/الغياب) من خلال تحديد عتبة الفلورللة لإشارة التعبير الجيني الإيجابي وتعيين معرفات “نعم” أو “لا” للخلايا الفردية. ككل ، يوفر هذا المخطط التجريبي خط أنابيب مرن بشكل لا يصدق لجمع وتحليل أولي لبيانات السلسلة الزمنية بالاقتران مع بيانات التعبير الجيني المطابق للخلايا. وستكون هذه التجارب حاسمة من أجل فهم أفضل للعلاقات المعقدة بين الديناميات الخلوية والتغيرات النسخية، كما يتضح من تحديد أنماط نشاط الكالسيوم المميزة للسلائف العصبية المثبطة والمثيرة في الخلايا العصبية الجنينية زينوبوس لايفيس.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

ونشكر ويندي هيربست وليندساي شلايفر على إسهاماتهما في وضع هذه البروتوكولات. تم دعم هذا العمل من خلال المنح المقدمة من المعاهد الوطنية للصحة (1R15NS067566-01، 1R15HD077624-01 و 1R15HD096415-01) إلى MSS.

Materials

For Animal Husbandry & Cell Culture
CHORULON (chorionic gonodotropin) Merck Animal Health
Gentamycin sulfate salt Millipore Sigma G1264
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) Thermo Fisher Scientific 15140122
Pyrex petri dishes, 100 mm x 20 mm Millipore Sigma CLS3160102
Corning Falcon Easy-Grip Tissue Culture Dishes, 35mm Fisher Scientific 08-772A
Corning Falcon Easy-Grip Tissue Culture Dishes, 60mm Fisher Scientific 08-772F
Falcon Standard Tissue Culture Dishes Fisher Scientific 08-772E
Thermo Scientifc Nunc Cell Culture / Petri Dishes, 35x10mm Dish, Nunclon Delta Fisher Scientific 12-565-90
Fisherbrand Standard Disposable Transfer Pipettes, Nongraduated; Length: 5.875 in.; Capacity: 7.7 mL Fisher Scientific 13-711-7M
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate Millipore Sigma E10521
Collagenase B Millipore Sigma 11088807001
Dumont #55 Forceps, Dumostar Fine Science Tools 11295-51
Dumont #5 Forceps, Dumostar Fine Science Tools 11295-00
Cellattice Micro-Ruled Cell Culture Surface Nexcelom Bioscience CLS5-25D-050
For Calcium Imaging
Fluo-4, AM, cell permeant Thermo Fisher Scientific F14201
Pluronic F-127, 0.2 µm filtered (10% Solution in Water) Thermo Fisher Scientific P6866
For RNA Probe Generation
PureYield Plasmid Miniprep System Promega A1222
rATP Promega P1132
rCTP Promega P1142
rGTP Promega P1152
rUTP Promega P1162
Digoxigenin-11-UTP Millipore Sigma 3359247910
Rnase Inhibitor Thermo Fisher Scientific N8080119
T3 RNA Polymerase Promega P2083
T7 RNA Polymerase Promega P2075
SP6 RNA Polymerase Promega P1085
RQ1 Rnase-Free Dnase Promega M6101
LiCl Precipitation Solution (7.5 M) Thermo Fisher Scientific AM9480
For Fluorescence In Situ Hybridization
Acetic Anhydride Thermo Fisher Scientific 320102
Blocking Reagent Millipore Sigma 11096176001
Anti-Digoxigenin-POD, Fab fragments Millipore Sigma 11207733910
Cy3 Mono-Reactive NHS Ester Millipore Sigma GEPA13105
Solution Components
Calcium chloride, 96% extra pure, powder, anhydrous, ACROS Organixs Fisher Scientific AC349610
Calcium chloride dihydrate Millipore Sigma C3306
CHAPS hydrate Millipore Sigma C3023
Denhardt's Solution (50X) Thermo Fisher Scientific 750018
DTT, Molecular Grade (DL-Dithiothreitol) Promega P1171
Ethylenediaminetetraacetic Acid, Disodium Salt Dihydrate Fisher Scientific S311
Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid Millipore Sigma E3889
Formamide (Deionized) Thermo Fisher Scientific AM9342
Herparin sodium salt from porcine intestinal mucosa Millipore Sigma H3393
HEPES (Ultra Pure) Thermo Fisher Scientific 11344041
Hydrogen peroxide solution Millipore Sigma H1109
L-Cysteine Millipore Sigma 168149
Magnesium chloride, pure, ACROS Organics Fisher Scientific AC223211000
Magnesium sulfate, 97% pure, ACROS Organixs, anhydrous Fisher Scientific AC413480050
Maleic Acid, 99%, ACROS Organics Fisher Scientific ACS125231000
MOPS (Fine White Crystals/Molecular Biology), Fisher BioReagents Fisher Scientific BP308
Potassium chloride Millipore Sigma P9541
Ribonucleic acid from torula yeast, Type IX Millipore Sigma R3629
Sodium chloride Millipore Sigma S7653
Triethanolamine Millipore Sigma 90279
Tris Millipore Sigma GE17-1321-01
TWEEN 20 Millipore Sigma P9416
Equipment
Laminar Flow Hood model of choice
Dissecting Microscope model of choice
Inverted Fluorescence Microscope Nikon TE200
NIS-Elements Imaging Software Nikon
Shaking Incubator model of choice
Refrigerated Centrifuge model of choice
Miscellaneous
Corning bottle-top vaccum filter system, 0.22 μm pore, 500 mL bottle capacity Millipore Sigma CLS430769
Falcon 50mL Conical Centrifuge Tubes Fisher Scientific 14-432-22
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Humeau, J., et al. Calcium signaling and cell cycle: Progression or death. Cell Calcium. 70, 3-15 (2017).
  2. Kim, J. M., Lee, M., Kim, N., Heo, W. D. Optogenetic toolkit reveals the role of Ca2+ sparklets in coordinated cell migration. PNAS. 112 (21), 5951-5957 (2016).
  3. Orrenius, S., Zhivotovsky, B., Nicotera, P. Regulation of cell death: the calcium-apoptosis link. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 4 (7), 552-565 (2003).
  4. Pham, K., et al. Ca2+ and Mg2+ module conformational dynamics and stability of downstream regulatory element antagonist modulator. Protein Science. 24 (5), 741-751 (2015).
  5. Smedler, E., Uhlén, P. Frequency decoding of calcium oscillations. Biochimica et Biophysica Acta. 1840 (3), 964-969 (2014).
  6. Moreau, M., Néant, I., Webb, S. E., Miller, A. L., Riou, J. F., Leclerc, C. Ca(2+) coding and decoding strategies for the specification of neural and renal precursor cells during development. Cell Calcium. 59 (2-3), 75-83 (2016).
  7. Tomida, T., Hirose, K., Takizawa, A., Shibasaki, F., Iino, M. NFAT functions as a working memory of Ca2+ signals in decoding Ca2+ oscillation. EMBO. 22 (15), 3825-3832 (2003).
  8. Hannanta-Anan, P., Chow, B. Y. Optogenetic Control of Calcium Oscillation Waveform Defines NFAT as an Integrator of Calcium Load. Cell Systems. 2 (4), 283-288 (2016).
  9. Li, L., Stefan, M. I. Le Novère N. Calcium input frequency, duration and amplitude differentially module the relative activation of calcineurin and CaMKII. PLoS One. 7 (9), 43810 (2012).
  10. Romano, D. R., Pharris, M. C., Patel, N. M., Kinzer-Ursem, T. L. Competitive tuning: Competition’s role in setting the frequency-dependence of Ca2+-dependent proteins. PLoS Computational Biology. 13 (11), 1005820 (2017).
  11. Pharris, M. C., Patel, N. M., Kinzer-Ursen, T. L. Competitive Tuning Among Ca2+/Calmodulin-Dependent Proteins: Analysis of in silico Model Robustness and Parameter Variability. Cellular and Molecular Bioengineering. 11 (5), 353-365 (2018).
  12. Gu, X., Olson, E. C., Spitzer, N. C. Spontaneous neuronal calcium spikes during early differentiation. Journal of Neuroscience. 14 (11), 6325-6335 (1994).
  13. Borodinsky, L. N., Root, C. M., Cronin, J. A., Sann, S. B., Gu, X., Spitzer, N. C. Activity-dependent homeostatic specification of transmitter expression in embryonic neurons. Nature. 429 (6991), 523-530 (2004).
  14. Ciccolini, F., Collins, T. J., Sudhoelter, J., Lipp, P., Berridge, M. J., Bootman, M. D. Local and Global Spontaneous Calcium Events Regulate Neurite Outgrowth and Onset of GABAergic Phenotype during Neural Precursor Differentiation. Journal of Neuroscience. 23 (1), 103-111 (2003).
  15. Weissman, T. A., Riquelme, P. A., Ivic, L., Flint, A. C., Kriegstein, A. R. Calcium Waves Propagate through Radial Glial Cells and Modulate Proliferation in the Developing Neocortex. Neuron. 43 (5), 647-661 (2004).
  16. Nieuewkoop, P. D., Faber, J. . The stages of Xenopus embryonic development. Normal Table of Xenopus laevis. , (1994).
  17. Paudel, S., et al. Calcium Activity Dynamics Correlate with Neuronal Phenotype at a Single Cell Level and in a Threshold-Dependent Manner. International Journal of Molecular Science. 20 (8), 1880 (2019).
  18. Marken, J. P., et al. A Markovian Entropy Measure for the Analysis of Calcium Activity Time Series. PLoS One. 11 (12), 0168342 (2016).
  19. Eilers, P. H. C., Boelens, H. F. M. Baseline Correction with Asymmetric Least Squares Smoothing. Leiden University Medical Centre Report. , (2005).
  20. Guemez-Gamboa, A., et al. Non-cell-autonomous mechanism of activity-dependent neurotransmitter switching. Neuron. 82 (5), 1004-1016 (2014).
  21. Paredes, R., Madelaine, , et al. Chemical calcium indicators. Methods. 46 (3), 143-151 (2008).

Tags

Fluorescent Calcium ImagingIn Situ HybridizationNeuronal PrecursorXenopus LaevisSingle Cell AnalysisCalcium ActivityGene ExpressionDissectionCollagenase

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Ablondi, E. F., Paudel, S., Sehdev, M., Marken, J. P., Halleran, A. D., Rahman, A., Kemper, P., Saha, M. S. Fluorescent Calcium Imaging and Subsequent In Situ Hybridization for Neuronal Precursor Characterization in Xenopus laevis. J. Vis. Exp. (156), e60726, doi:10.3791/60726 (2020).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image