Уточнение и изображение Candida Альбиканс Biofilms
Summary
Для просмотра и количественной оценки внутренних особенностей биофильмов Candida Albicans мы готовим нетронутые образцы, которые уточняются с помощью сопоставления рефракционного индекса. Затем оптическая секционная микроскопия может быть использована для получения трехмерных данных изображения, хотя и полной толщины биопленки.
Abstract
Микробный грибОк Candida albicans может претерпеть переход от комменсальной колонизации к вирулентности, которая сильно коррелирует с его способностью переключаться с роста дрожжевой формы к росту гифального. Клетки, инициирующих этот процесс, становятся приверженцами поверхностей, а также друг к другу, что приводит к развитию биопленки колонии. Это обычно происходит не только на поверхности слизистой ткани в дрожжевых инфекций, но и на медицинских имплантатов, таких как катетеры. Хорошо известно, что биопленки клетки устойчивы к противогрибковым препаратам, и что клетки, которые проливают из биопленки может привести к опасным системных инфекций. Биопленки варьируются от сильно полупрозрачных до непрозрачных из-за рефракционной неоднородности. Поэтому грибковые биопленки трудно изучать с помощью оптической микроскопии. Чтобы визуализировать внутренние структурные, клеточные и субклеточные особенности, мы разъясняем фиксированные нетронутые биопленки по шаговой части обмена растворителями до точки оптимального соответствия рефракционного индекса. Для биопленк C. albicans, достаточное уточнение достигается с метилсалицилат (n No 1.537), чтобы конфокальная микроскопия от вершины до основания в 600 мкм биопленки с небольшим затуханием. В этом протоколе визуализации мы описываем фазовую контрастную рефрактометрию, рост лабораторных биопленок, фиксацию, окрашивание, обмен растворителя, установку для конфоковой флуоресценции микроскопии и репрезентативные результаты.
Introduction
Candida Albicans является микробный грибок, который, как правило, сопутствующие у людей. Он представляет фундаментальный интерес для биологов, потому что организм имеет множество морфологий. Например, в ответ на определенные экологические сигналы или стрессоры, дрожжевой форме подающий надежды клетки перейдут на нитевидный рост, как перепсечение цепи высокоудлинных клеток, известных как гифы. Переход важен как пример фенотипического выражения перехода между одноклеточной и многоклеточной программой экспрессии генов. Аналогичным образом, C. albicans представляет биомедицинский интерес, поскольку организм является известным оппортунистическим патогеном. Он отвечает за мукозные дрожжевые инфекции, такие как молочница (устный кандидоз), мочеполовой инфекции, и причиной опасных инвазивных или системных инфекций у ослабленных иммунитетом пациентов.
Потенциал вирулентности этого организма тесно связан с его многочисленными морфотипами и другими аспектами его генетической универсальности1,2,3,4. Расширение трубки зародыша, первый видимый этап перехода к росту гифального, происходит с достаточной быстротой, чтобы позволить поглощенные клетки C. albicans вырваться из фагоцитов и тем самым избежать ранней фазы клеточного иммунного ответа хозяина5. Кроме того, нити предшествует и сопровождается большим увеличением клеток к клетке и клеток к поверхности присоединения, что связано с регулируемым выражением нескольких классов белков клеточной стенки, известных как клеи6,7,8,9. В самых разнообразных условиях сочетание присоединения и нити приводит к резкому переходу от планктонного одноклеточного роста к связанного с поверхностью колониального роста, который образует биопленку. Биопленки C. Albicans могут развиваться на обычных имплантированных медицинских устройствах, таких как венозные катетеры. Распространение инфекций может привести, когда такие биопленки начинают бутон от дрожжевой формы клеток и пролить их в циркулирующей крови. Многочисленные исследования показали, что биопленки клетки более устойчивы к противогрибковым препаратам, чем планктонные клетки10,11, которые могут быть отчасти из-за снижения метаболизма12. Кроме того, высокая общая приверженность биопленки может обеспечить якорь, необходимый для эффективного инвазивного роста гифы в ткань хозяина1.
Оптическое прояснение биопленок C. Albicans путем соответствия рефракционного индекса оказало большое влияние на нашу способность визуализировать структуру этого микробного сообщества и обнаружить взаимосвязь между экспрессией генов и фенотипом. Биопленки, выращенные в лаборатории на испытательных поверхностях под жидкой культурой среды для 48 ч появляются как беловатое покрытие, которое достаточно плотное и достаточно толстым, чтобы быть непрозрачным (Рисунок 1). Поэтому многие интересные фенотипические особенности биопленки скрыты от глаз. 24 ч диких биопленок типа, выращенных в YPD, RPMI-1640, или Спайдер среды на 37 градусов по Цельсию диапазоне до 300 мкм толщиной, с 48 ч биопленок часто достигает 500 мкм. Непрозрачность обусловлена рассеянием света, которое возникает из-за рефракционной неоднородности: грибковая клеточная стенка более рефракционна, чем окружающая среда, а цитоплазма немного более рефракционная, чем клеточная стенка. В результате высокой оптической плотности родной биопленки скрывает все структуры более чем на 30 мкм глубиной при просмотре с обычным микроскопом или даже конфокальный сканер (Рисунок 2). Тем не менее, большая степень прояснения может быть достигнуто путем проникновения фиксированных биопленок с высоким рефракционным индексом жидкости, что примерно соответствует рефракции основных клеточных компонентов. После уточнения, визуализация в субмикроном разрешении может быть выполнена путем конфокальной микроскопии через всю толщину практически любого биопленки C. albicans 13. В диких образцах типа, легко увидеть, что биопленки состоят из длинных запутанных гиф, кластеры подающий надежды дрожжевой формы клеток или псевдогифальных клеток, пустоты пространства, и некоторое количество внеклеточной матрицы. Кроме того, биопленки обычно стратифицированы, показывая пространственно вариант морфологических различий в типе клеток, плотности клеток, и наличие подающих надежды или ветвящиеся клетки. Многие вариации в одной или нескольких из этих функций наблюдались в биопленках, разработанных штаммами мутантов14,15. Дополнительно, штаммы репортера показывают на месте пространственные различия в экспрессиигенов 16,9,13. Удивительная степень разъяснения, получаемого с помощью этого относительно простого и недорогого подхода, также позволяет увидеть, что многие биопленки включают апикатические гифы и базальные инвазивные гифы, простирающиеся на миллиметровые расстояния.
В этом протоколе визуализации мы демонстрируем фиксацию, маркировку, разъяснение и визуализацию биопленки C. Albicans с помощью простого маркера клеточной стены в качестве пятна. Происхождение нынешней версии протокола является улучшение ясности мы наблюдали, когда формальдегид фиксированной биопленки были проникли с 97% гликол метакрилат (GMA), который затем полимеризован для встраиваемого биопленки в жесткий пластик, имеющих умеренно высокий рефракционный индекс (n 1.49). Затем мы использовали обычную фазовую контрастную микроскопию и серию рефракционных индексных справочных жидкостей для более точного определения точки разворота контраста (максимальная прозрачность) биопленки(рисунок 3). Для биопленок C. Albicans это произошло близко к n 1.530, что было удивительно высоко, учитывая, что плотная структура белка, такая как кератин волос, лишь немного более рефракционна (1.54-1.55). Хотя это на верхнем конце оптимального диапазона на рисунке 3, мы приняли метил салицилат (масло зимнего зеленого цвета, n 1.537) в текущем протоколе, потому что он уже давно используется в качестве прояснительного агента для микроскопии в эмбриологии и гистологии, он имеет низкую токсичность и низкое давление пара, и он дал отличные результаты в наших испытаниях с использованием умеренно-NA погружения нефти оптики.
Четыре момента должны быть сделаны здесь:
(1) За редким исключением, идеальная ситуация в микроскопии является то, что рефракционный индекс образца должен быть равен рефракционный индекс объективного погружения объектива жидкости17,18,13. Для трехмерных (3D) исследований изображений, где необходима глубокая фокусировка, это всегда важно.
(2) Наш экспериментальный результат для оптимальной очистки (n No 1.525-1.535) немного выше, чем стандартные масла погружения (n 1.515, 1.518) и, следовательно, нарушает точку (1), и таким образом вводит источник сферической аберрации при использовании стандартной масляной оптики погружения. Одним из решений этой проблемы является использование цели, предназначенной для индекса погружения в более высоком диапазоне. Из-за возрождения интереса к образу очищенных образцов, специальные цели с необходимой коррекцией становятся доступными. Другим решением является корректировка индекса прояснения среды до 1,515 или 1,518 путем добавления небольшого количества бутанола (n no 1.399) для оптимальной производительности погружения масла, и принять слегка ухудшившееся ясность.
(3) Микроскопия нетронутых биопленок (и других образцов такого масштаба) требует значительного рабочего расстояния для размещения толщины образца. Это важное практическое соображение. Большое рабочее расстояние ограничивает оптику умеренной численной диафрагмой (NA 0.6-1.25), которая ограничивает разрешение, но также ограничивает тяжесть сферической аберрации.
(4) Оптимальный рефракционный индекс для уточнения может отличаться для других типов фиксированных образцов. Specimens должны быть проверены соответствующим образом с использованием фазового контраста и серии рефракционных индексных справочных жидкостей, как показано на рисунке 3.
Protocol
Representative Results
Discussion
Достижения в флуоресценционной микроскопии в оптическом сечении, разрешении, скорости, избежании или компенсации аберрации, многоканального приобретения, а также в вычислительной мощности, вызвали возрождение в визуализации нетронутыми образцами. Для фиксированных образцов, как классические, так и новые методы уточнения и расширения оказали значительное влияние19,20,21,22,23,24. В этом случае мы применили быстрый и простой подход к сопоставлению индекса на основе растворителя для изучения структуры грибковых биопленок, которые сильно полупрозрачны, к непрозрачным.
Предыдущие протоколы были протестированы с рядом образцов. В нашей лаборатории биопленки Candida Albicans чаще всего выращиваются на 14 мм квадратов, вырезанных из листа силиконовой резины медицинского класса (см. Таблицу Материалов). Этот субстрат используется потому, что рост pdMS (поли-диметилсилоксана), погруженного в среде жидкой культуры, был установлен в качестве важной модели in vitro для инфекций, связанных с медицинскими имплантатами, особенно в жилых катетерах. Подчеркнутые клетки, инициирующих нити, быстро прилипают к неполярным поверхностям, таким как PDMS. На практике, используемые квадраты, которые были очищены и resterilized в автоклаве (сухой цикл) дают наиболее последовательные биопленки для любого конкретного штамма. Биопленки также обычно выращиваются на крышках стаканов, в крышке стеклянных донных культурных блюд, в стандартных бактериологических полистироловых блюдах и на агаре. Поскольку клетки C. albicans не хорошо прилипают к стеклу, крышку стаканов следует обработать лектином, который свяжет полисахариды клеточной стенки. Мы применяем 40 кл 1 мг/мл ConA или WGA в стерильной воде на каждой поверхности покрытия. После высыхания, крышка стаканы обрабатываются с 40 Зл 1% 1% глютаральдегида в течение 3 минут, чтобы перекрестно белка в нерастворимые пленки. Затем они промывают стерильной дистиллированной водой, чтобы удалить фиксатор и любой растворимый лектин и высушенный воздухом. При необходимости обработанные крышки стаканов или посуды рестерифицируются под гермицидальной ультрафиолетовой лампой в течение 10 мин.
Толщина протеже повлияет на необходимые инкубационные периоды в протоколах. Фиксированная диффузия в биопленку мощностью 300 мкм требует нескольких минут, чтобы уравновесить. Этот период времени увеличивается как квадрат толщины образца, и должен быть продлен до часа или более для очень толстых биопленок или образцов агар блока, которые могут быть 2-3 мм толщиной. Период равновесия для окрашивания также зависит от толщины образца, как описано для фиксации и вымывания. Однако, поскольку лектины рассеивается медленнее, чем низкой МВт фиксаторов, особенно в агар гель, окрашивание должно быть продлено на ночь. То же самое должно быть сделано для вымывания избыточного пятна.
Пятна различных типов могут быть включены в протоколы. Мы используем пятно клеточной стенки для структурной визуализации, чаще всего Calcofluor White M2R (Fluor. Brightener #28) или красителя помечены лектин, такие как ConA-Alexafluor 594 или WGA-Alexafluor 594. Следует обратить внимание на валентность белка. Тетрамер ConA может вызвать перекрестное соединение очень гибких гиф в апикатической области биопленки. Это менее очевидно с WGA dimer. Канонические особенности этих маркеров Calcofluor для хитина, ConA для остатков маннозы, и WGA для N-ацетил-D-глюкозамин и сиаловая кислота остатков.
Поскольку протокол обмена растворителям градуируется из PBS или воды, хотя метанол в метилсалицилат, образцы контейнеры должны быть платежеспособными. Метилсалицилат (МС) быстро смягчит полистирол пластичной посуды и медленно смягчит другие пластмассы. Протокол шагов до использования аккуратного метанола может осуществляться в пластичной посуде, но в этот момент в протоколе мы обычно переключаемся на стандартные 20 мл стеклянных флаконов с растворителем. Флаконы удобны для биопленки на силиконовой квадратной субстрате, так как квадраты можно подобрать и перенести с помощью тонкого пинцета. Кроме того, флакон может быть осушена и пополнена плоским квадратом, опираясь на внутреннюю изогнутую поверхность, чтобы биопленка не контактировала со стеклом. Субстрат должен быть биопленкой, когда он погружен в вертикальном флакон. Флаконы отлично подходят для длительного хранения образцов.
В протоколе уточнения более градуированные шаги обмена растворителями сводят к минимуму риск деформации образца из-за эффектов смешивания растворителя. Для скорости и удобства в базовом протоколе, Есть четыре шага: 1) шаг 3.3, PBS до 50:50 PBS: метанол; 2) шаги 3.4 и 3.5, PBS: метанол к опрятной метанолу, 3) шаг 3.6, аккуратный метанол до 50:50 метанол:MS; и 4) шаги 3.7 и 3.8, метанол:MS к опрятному MS. Метанол обеспечивает переходную неправомерность. Однако, поскольку вода и РАССЕЯНный см почти невозможны, важно, чтобы вся вода была вытеснена метанолом до введения какого-либо MS. Кроме того, потому что метанол является весьма неустойчивым, важно, чтобы вытеснить все метанола MS. В противном случае, продолжается испарение остаточного метанола вызовет рефракционные колебания индекса в образце. В течение четырех шагов последовательности, повторяя второй и четвертый шаги, добавив еще одно изменение аккуратный растворитель, или даже третье изменение, рекомендуется. Для особо хрупких образцов изменения растворителя могут быть сформулированы меньшими процентами.
С образцами агар-блока, шаги 3.4 и 3.5 (neat метанол) могут причинить возникновение кристаллов соли внутри агар из-за insolubility остаточных сол ТОС в метаноле. Этого можно избежать с помощью дистиллированной воды (DW) в первом смешанном шаге растворителя вместо PBS для разбавления солей во время воды: метанол обмена. Альтернативная последовательность обмена растворителями для фиксированных биопленок затем состоит из этих шагов: 1) шаг 3.3, перенос образца из PBS в 50:50 DW:метанол (позволяет дополнительное время для диффузии через агар); 2) шаг 3.4, перенос образца от 50:50 DW: метанол в аккуратный метанол (повторите 2x с метанолом как в шаге 3.5); 3) шаг 3.6, перенос образца из метанола в 50:50 метанола: метил салицилат; и 4) шаг 3.7, передача образца от 50:50 метанола: MS аккуратно MS (повторить 2x с MS, как в шаге 3.8).
Поскольку метил-салицилат быстро смягчает полистирол пластичной посуды, мы используем анодированное алюминиевое блюдо с крышкой стеклянного дна, чтобы держать очищенную биопленку на сцене перевернутого микроскопа. Крышка стекла удерживается на месте с использованием УФ-лелечения оптического цемента (Норланд оптический клей #61, см. Таблица материалов). При условии, что MS удаляется в конце дня путем мытья блюда с изопропанол следуют мыльной воды и промывки, цементированные крышка стекла будет служить в течение многих месяцев.
Объективный отбор объективов имеет решающее значение при крупномасштабной визуализации уточненных образцов из-за важности минимизации сферической аберрации и необходимости достаточного рабочего расстояния. У нас есть опыт работы с тремя целями в этих исследованиях. В перевернутой установки микроскопа, мы используем большое рабочее расстояние, умеренное численное отверстие (NA) объективное масло, погруженное под крышкой стекла с биопленкой, погруженной в метилсалицилат в блюде над крышкой стекла. Большая часть нашей работы была выполнена с ахроматической целью серии Зейсс, тип 461708, 40x 0.85NA Oel 160/1.5, используемый с отрицательным 160-мм фокусным адаптером для номинальной бесконечной совместимости (IC) совместимости. Эта цель первоначально была разработана для нефти погружен просмотра через 1,5 мм микроскоп слайды с 0,35 мм рабочего расстояния25. При использовании со стандартным стеклом крышки (0,17 мм), рабочая дистанция гораздо больше: 1,5 и 0,35-0,17 и 1,68 мм и 1680 мкм. Мы также используем новую цель мультипогружения Зейсса, тип 420852, 25x 0.8NA LD LCI Plan-apochromat с рабочим расстоянием, превышающим 540 мкм, с коррекцией погружения, установленной на высокой стороне ‘масла’. Эта цель очень исправлена и производит превосходное изображение. На вертикальном подставке микроскопа мы использовали новую цель мультипогружения Nikon, тип MRD71120, 10x 0.5NA CFI Plan-apochromat с рабочим расстоянием, превышающим 5000 мкм (5 мм), также с коррекцией погружения, установленной на высокой стороне «масла» (п. 1.518). Хотя эта цель имеет более низкую NA, чем другие, она имеет то преимущество, что непосредственно погружения в метил-салицилат.
Для оптимизации сбора данных с точки зрения скорости и разрешения, настройки конфокального микроскопа в идеале должны соответствовать как поперечной, так и осевой плотности выборки Nyquist18. Используя обычные критерии, установите диаметр конфокальной пинхола номинально до 1 Airy единицы. В увеличенных координатах,
dP (мкм) – 1,22 х увеличение x (длина волны выбросов в мкм) / NA
Поперечная выборка (расстояние пикселей) не должна превышать (1/2) х лимит разрешения Abbe. В координатах объекта-пространства,
Хх, у й (длина волны выбросов в нм) / (4 NA)
Осевой выборки (фокусный приращение) не должен превышать обратную осевую пропускную способность,
Зз (индекс погружения) x (длина волны выбросов в нм) / (NA2)
Конфокальная оптическая система расширяет пропускную способность микроскопа и обостряет как поперечное, так и осевое разрешение, по крайней мере, на 1 / 2.
Для 40x 0,85 NA цели, которые мы используем чаще всего, см. Таблица 1 для результатов этих формул для 600 нм длины волны выбросов (Alexa Fluor 594).
| Формула | х 1 / 2 евро | набор (типичный) | |
| dP (мкм) | 34,5 мкм | – | 25 или 50 мкм |
| Кс, кю | 176 нм | 125 нм | 161 нм |
| Оз | 1200 нм | 848 нм | 900 нм |
Таблица 1: Диаметр конфокальной пинхола, поперечная проба и значения осевой выборки для длины волны эмиссии 600 нм.
Используя вращающийся диск конфокальный сканер с этими настройками и 1,392 х 1040 пикселей сканирование поле, данные из биопленки образцов могут быть приобретены с разумной скоростью и разрешением. Типичные одноцветные 3D-изображения работают 0,35-1,55 ГБ.
Разъяснение носителей в широком использовании охватывает значительный диапазон рефракционных индексов. По темного поля освещения и визуального осмотра, мы обнаружили, что фиксированные C. Albicans биопленки были наиболее прозрачными выше n 1.5. Это было уточнено фазовой контрастной микроскопией до n No 1.530-1.535. По ряду практических причин мы используем метилсалицилат (n no 1.537) в качестве конечного индекса, сопрягаемого растворителем. Хотя обмен растворителями приносит риск деформации образца или других артефактов, клетки в фиксированных, уточненных образцах имеют аналогичные размеры тела клетки, диаметр гифы, и межсептальные размеры длины как живые образцы.
Возможны многочисленные вариации в процессе обмена растворителями (например, использование другого переходного растворителя или другого конечного растворителя). Метанол был выбран из-за его высокой полярности и быстрой диффузии, но этанол был показан, чтобы лучше сохранить красный флуоресцентный белок (RFP) квантовый выход26 в качестве переходного растворителя. Метилсалицилат был выбран для его индекса, умеренной полярности, низкого давления пара и совместимости со многими пятнами, красителями и флуоресцентными белками. Тем не менее, окончательный растворитель с несколько более низким индексом, или смесь метил-салицилата и более низкого индекса растворителя, таких как бутанол, может служить лучше.
Неожиданно, способность видеть через биопленку показывает не только его стратифицированные внутренние особенности, но и помогает в просмотре происхождения расширенных структур, таких как длинные, незапутанные аптические гифы и инвазивные базальные гифы на определенных субстратах. Оппортунистическая вирулентность у C. Albicans зависит от ее генетической универсальности (т.е. перехода к росту гифального, upregulation клеточного субстрата и присоединения клеток, генерации осмолитов для подачек и удлинения клеток, а также использования альтернативных питательных веществ). Hyphal расширение позволяет прорыв отдельных клеток C. Albicans из фагоцитических иммунных клеток, но также имеет важное значение для вторжения. Biofilm адгезии и гифальной запутанности, как представляется, обеспечивают поверхность якорь, необходимые для гифы эффективно вторгнуться в субстрат. Когда этот субстрат является тканью-хозяином, может возникнуть повышенная вирулентность.
Imaging нетронутыми биопленки позволяет огромное количество информативных экспериментов с использованием репортер штаммов для экспрессии генов, модель ткани substrata, и включение других организмов, таких как бактерии, найденные в природных биопленки. Даже в самом простом случае чисто структурной визуализации с пятном клеточной стенки, на месте обнаружены фенотипы, которые затем могут быть количественно и генетически проанализированы.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Это исследование было частично поддержано NIH гранты R01 AI067703, R21 AI100270, и R21 AI135178 А.П. Митчелл. Авторы благодарны Гринфилду ‘Kip’ Sluder за предоставление дальней рабочей цели погружения нефти, используемой в этой работе, и Даниэлю Шиварски за конфоковую микроскопию с прямым погружением метил-салицилата.
Materials
| Biohazardous waste receptacle | |||
| Biosafety cabinet with germicidal UV lamp | |||
| Calcofluor White M2R (2.5 mg/mL in methanol) | |||
| Concanavalin A – Alexafluor-594 or other conjugate | |||
| Distilled water | DW | ||
| Distilled water, sterile | |||
| Ethanol, absolute | EtOH | ||
| Fetal bovine serum (FBS), sterile | |||
| Fixative waste bottle in secondary containment | |||
| Formaldehyde 20% in water, ampules | Electron Microscopy Sciences | ||
| Formaldehyde alternatives: paraformaldehyde powder, formalin 37% | Electron Microscopy Sciences | ||
| Fume hood | |||
| Glutaraldehyde 25% in water, ampules | Electron Microscopy Sciences | ||
| Incubator – 30 deg C, with rotary mixer (60 rpm) for culture tubes | |||
| Incubator – 37 deg C, with orbital mixer for culture plates | |||
| Isopropanol 70% | iPrOH 70% | ||
| Longwave (365 nm) UV lamp, 5Watt | Cole-Parmer Scientific | for curing NOA-61 cement | |
| Medical grade silicone sheet, 0.060" (1.52 mm) thick | Bentec Medical, Inc., http://bentecmed.com/ | Non-reinforced medical grade silicone sheeting | |
| Methanol 99.9% | MeOH | ||
| Methyl salicylate 99% | MS | ||
| Millipore Swinnex 13mm white silicone ring gaskets | Millipore Corp. | SX0001301 | |
| Norland UV-curing optical adhesive – type NOA-61 | Edmund Optics, Inc., https://www.edmundoptics.com | NOA-61 | |
| Orbital mixer, benchtop | |||
| Phosphate-buffered saline (PBS), sterile | |||
| Refractive index standard liquids, n=1.500 to 1.640 (29 liquids, 0.005 increment) | Cargille Laboratories, https://cargille.com | Series E | Cedar Grove, NJ 07009, USA |
| RPMI-1640 base medium, HEPES buffered, sterile | |||
| Scintillation vials, 20 mL – Wheaton, Urea cap PE cone cap liner | Fisher Scientific Co. | 03-341-25H | for specimen processing and storage |
| Solvent waste bottle in secondary containment | |||
| Spider medium with mannitol, sterile (1% Difco nutrient broth, 0.2% K2HPO4, 1% D-Mannitol) | |||
| Wheat germ agglutinin – Alexafluor-594 or other conjugate | |||
| Yeast-peptone-dextrose (YPD) agar plates, sterile (1% yeast extract, 2% Bacto peptone, 2% dextrose, 2% Bacto agar) | |||
| YPD medium, liquid, sterile (1% yeast extract, 2% Bacto peptone, 2% dextrose) |
References
- Desai, J. V., et al. Coordination of Candida albicans invasion and infection functions by phosphoglycerol phosphatase Rh2. Pathogens. 4, 573-589 (2015).
- Miramón, P., Lorenz, M. C. A feast for Candida: Metabolic plasticity confers an edge for virulence. PLoS Pathogens. 13 (2), 1006144 (2017).
- Bonhomme, J., et al. Contribution of the glycolytic flux and hypoxia adaptation to efficient biofilm formation by Candida albicans. Molecular Microbiology. 80, 995-1013 (2011).
- Ramírez-Zavala, B., et al. The Snf1-activating kinase Sak1 is a key regulator of metabolic adaptation and in vivo fitness of Candida albicans. Molecular Microbiology. 104, 989-1007 (2017).
- Westman, J., Moran, G., Mogavero, S., Hube, B., Grinstein, S. Candida albicans hyphal expansion causes phagosomal membrane damage and luminal alkalinization. mBio. 9, 01226 (2018).
- Finkel, J. S., Mitchell, A. P. Genetic control of Candida albicans biofilm development. Nature Reviews Microbiology. 9, 109-118 (2011).
- Finkel, J. S., et al. Portrait of Candida albicans adherence regulators. PLoS Pathogens. 8, 1002525 (2012).
- de Groot, P. W., Bader, O., de Boer, A. D., Weig, M., Chauhan, N. Adhesins in human fungal pathogens: glue with plenty of stick. Eukaryotic Cell. 12, 470-481 (2013).
- Lagree, K., Mitchell, A. P. Fungal Biofilms: Inside Out. Microbiology Spectrum. 5, (2017).
- Hawser, S. P., Douglas, L. J. Resistance of Candida albicans biofilms to antifungal agents in vitro. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 39, 2128-2131 (1995).
- Chandra, J., et al. Biofilm formation by the fungal pathogen Candida albicans: development, architecture, and drug resistance. Journal of Bacteriology. 183, 5385-5394 (2001).
- LaFleur, M. D., Kumamoto, C. A., Lewis, K. Candida albicans biofilms produce antifungal-tolerant persister cells. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 50, 3839-3846 (2006).
- Lagree, K., Desai, J. V., Finkel, J. S., Lanni, F. Microscopy of fungal biofilms. Current Opinion in Microbiology. 43, 100-107 (2018).
- Woolford, C. A., et al. Bypass of Candida albicans filamentation/biofilm regulators though diminished expression of protein kinase Cak1. PLoS Genetics. 12, 1006487 (2016).
- Huang, M. Y., Woolford, C. A., May, G., McManus, C. J., Mitchell, A. P. Circuit diversification in a biofilm regulatory network. PLoS Pathogens. 15 (5), 1007787 (2019).
- Ganguly, S., et al. Zap1 control of cell-cell signaling in Candida albicans biofilms. Eukaryotic Cell. 10, 1448-1454 (2011).
- Frisken, G. S., Lanni, F. Experimental test of an analytical model of aberration in an oil-immersion objective lens used in three-dimensional light microscopy. Journal of the Optical Society of America. 8, 1601-1613 (1991).
- Lanni, F., Keller, H. E., Yuste, R. M. Microscope principles and optical systems. Imaging, A Laboratory Manual. , 1-55 (2011).
- Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497, 332-337 (2013).
- Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues. Nature Protocols. 9, 1682-1697 (2014).
- Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying tissue clearing. Cell. 162, 246-257 (2015).
- Chen, F., Tillberg, P. W., Boyden, E. S. Expansion microscopy. Science. 347, 543-548 (2015).
- Zhao, Y., et al. Nanoscale imaging of clinical specimens using pathology-optimized expansion microscopy. Nature Biotechnology. 35, 757-764 (2017).
- Gao, R., et al. Cortical column and whole brain imaging with molecular contrast and nanoscale resolution. Science. 363, (2019).
- Carl Zeiss. Optical Systems for the Microscope publication 41-101-e. Carl Zeiss. , 48 (1971).
- Oldham, M., Sakhalkar, H., Oliver, T., Johnson, G. A., Dewhirst, M. Optical clearing of unsectioned specimens for three-dimensional imaging via optical transmission and emission tomography. Journal of Biomedical Optics. 13 (2), 021113 (2008).
