Chiarire e imaging Candida albicans Biofilms
Summary
Per visualizzare e quantificare le caratteristiche interne dei biofilm Candida albicans, prepariamo campioni intatti fissi che vengono chiariti dalla corrispondenza dell’indice di rifrazione. Quindi, la microscopia ottiva di sezionamento può essere utilizzata per ottenere dati immagine tridimensionali attraverso l’intero spessore del biofilm.
Abstract
Il fungo microbico Candida albicans può subire un cambiamento dalla colonizzazione commensale alla virulenza che è fortemente correlata con la sua capacità di passare dalla crescita di lievito-forma alla crescita dell’hyphal. Le cellule che iniziano questo processo diventano aderenti alle superfici e l’una all’altra, con il conseguente sviluppo di una colonia di biofilm. Questo si verifica comunemente non solo sulle superfici del tessuto mucosale nelle infezioni da lievito, ma anche su impianti medici come cateteri. È risaputo che le cellule del biofilm sono resistenti ai farmaci antifungini e che le cellule che versano dal biofilm possono portare a pericolose infezioni sistemiche. I biofilm vanno da fortemente traslucidi a opachi a causa dell’eterogeneità refrattiva. Pertanto, i biofilm fungini sono difficili da studiare con la microscopia ottica. Per visualizzare le caratteristiche strutturali, cellulari e subcellulari interne, chiariamo i biofilm intatti fissati per scambio di solventi graduale a un punto di corrispondenza ottimale dell’indice di rifrazione. Per i biofilm di C. albicans, si ottengono sufficienti chiarimenti con salicilato di metile (n – 1.537) per consentire la microscopia confocale dall’apice alla base in biofilm 600 m con poca attenuazione. In questo protocollo di visualizzazione illustreremo la refractometria di contrasto di fase, la crescita di biofilm di laboratorio, la fissazione, la colorazione, lo scambio di solventi, l’impostazione per la microscopia a fluorescenza confocale e i risultati rappresentativi.
Introduction
Candida albicans è un fungo microbico che è tipicamente commensale negli esseri umani. È di fondamentale interesse per i biologi perché l’organismo ha più morfologie. Ad esempio, in risposta a determinati segnali o fattori di stress ambientali, le cellule in erba nella forma di lievito passeranno alla crescita filamentosa come catene di settizi di cellule altamente allungate note come hyphae. La transizione è importante come esempio di espressione fenotipica di un passaggio tra un programma di espressione genica unicellulare e multicellulare. Allo stesso modo, C. albicans è di interesse biomedico perché l’organismo è un patogeno opportunistico ben noto. È responsabile di infezioni da lievito mucosale come il mughetto (candidiasi orale), le infezioni genitourinarie e una causa di infezioni invasive o sistemiche pericolose nei pazienti immunologicamente indeboliti.
Il potenziale di virulenza di questo organismo è strettamente collegato ai suoi morfotipi multipli e ad altri aspetti della sua versatilità genetica1,2,3,4. L’estensione del tubo di Germ, la prima fase visibile della transizione alla crescita dell’hyphal, avviene con sufficiente rapidità per consentire alle cellule C. albicans inghiottite di uscire dai fagociti e quindi sfuggire a una fase iniziale della risposta immunitaria cellulare dell’ospite5. Inoltre, la filamentazione è preceduta e accompagnata da un grande aumento dell’aderenza da cellula a cellula e da cellula a superficie che è dovuto all’espressione regolata di diverse classi di proteine della parete cellulare note come adhesins6,7,8,9. In un’ampia varietà di condizioni, la combinazione di aderenza e filamento si traduce in un drastico passaggio dalla crescita planctonica e unicellulare alla crescita coloniale associata alla superficie che forma un biofilm. C. albicans biofilm possono sviluppare su comuni dispositivi medici impiantati come cateteri venosi. Infezioni diffuse possono verificarsi quando tali biofilm iniziano a germogliare dalle cellule lievito-forma e versarli nel sangue circolante. Diversi studi hanno dimostrato che le cellule di biofilm sono più resistenti ai farmaci antifungini rispetto alle cellule planctoniche10,11, che possono essere dovute in parte al metabolismo abbassato12. Inoltre, l’elevata aderenza complessiva di un biofilm può fornire l’ancoraggio necessario per una crescita invasiva efficiente di ife nel tessuto ospite1.
Il chiarimento ottico dei biofilm di C. albicans mediante la corrispondenza dell’indice refrattivo ha avuto un impatto importante sulla nostra capacità di visualizzare la struttura di questa comunità microbica e scoprire le relazioni tra espressione genica e fenotipo. I biofilm coltivati in laboratorio su superfici di prova sotto mezzo di coltura liquida per 48 h appaiono come un rivestimento biancastro abbastanza denso e abbastanza denso da essere opaco (Figura 1). Pertanto, molte caratteristiche fenotipiche interessanti del biofilm sono nascoste alla vista. I biofilm di tipo selvatico da 24 h coltivati in YPD, RPMI-1640, o Spider medium a 37 gradi centigradi, con 48 h di biofilm che spesso raggiungono i 500 m. L’opacità è dovuta alla dispersione della luce, che deriva dall’eterogeneità refrattiva: la parete cellulare fungina è più refrattiva del mezzo circostante e il citoplasma leggermente più refrattivo rispetto alla parete cellulare. L’elevata densità ottica risultante di un biofilm nativo oscura tutte le strutture profonde più di 30 m se viste con un microscopio convenzionale o addirittura con uno scanner confocale (Figura 2). Tuttavia, un grande grado di chiarimento può essere ottenuto infiltrandosi in biofilm fissi con un liquido ad alto indice di rifrazione che corrisponde approssimativamente alla refrattività dei principali costituenti cellulari. Dopo il chiarimento, l’imaging a risoluzione submicron può essere effettuato tramite microscopia confocale attraverso l’intero spessore di quasi tutti i biofilm C. albicans 13. Negli esemplari di tipo selvatico, è facile vedere che i biofilm sono costituiti da lunghe ife impigliate, grappoli di cellule di lievito germogliato-forma o cellule pseudoigienico, spazi vuoti, e una certa quantità di matrice extracellulare. Inoltre, i biofilm sono generalmente stratificati, mostrando differenze morfologiche spazialmente varianti nel tipo di cellula, nella densità cellulare e nella presenza di cellule in erba o ramificate. Molte variazioni in una o più di queste caratteristiche sono state osservate nei biofilm sviluppati da ceppi mutanti14,15. Inoltre, i ceppi di reporter mostrano differenze spaziali in situ nell’espressione genica16,9,13. Il sorprendente grado di chiarimento ottenibile con questo approccio relativamente semplice e poco costoso permette anche di vedere che molti biofilm includono hyphae apiliche e hyphae invasive basali che si estendono a distanze millimetriche.
In questo protocollo di visualizzazione, dimostriamo il fissaggio, l’etichettatura, il chiarimento e l’imaging di un biofilm C. albicans utilizzando un semplice marcatore a parete cellulare come macchia. L’origine dell’attuale versione del protocollo è la migliore chiarezza che abbiamo osservato quando i biofilm fissi di formaldeide sono stati infiltrati con il 97% del methacritilla glicole (GMA), che è stato poi polimerizzato per incorporare il biofilm in una plastica dura con un indice di refrattivo moderatamente elevato (n – 1,49). Abbiamo quindi utilizzato la microscopia a contrasto di fase convenzionale e una serie di liquidi di riferimento dell’indice di rifrazione per determinare con maggiore precisione il punto di inversione del contrasto (massima trasparenza) del biofilm (Figura 3). Per C. albicans biofilm questo si è verificato vicino a n – 1.530, che era sorprendentemente alto dato che una struttura proteica densa come la cheratina per capelli è solo leggermente più refrattiva (1.54–1.55). Anche se è all’estremità superiore della gamma ottimale in Figura 3, abbiamo adottato salicilato di metile (olio di wintergreen, n – 1.537) nel protocollo attuale perché è stato a lungo utilizzato come agente chiarificante per la microscopia in embriologia e istologia, ha bassa tossicità e bassa pressione del vapore, e ha dato ottimi risultati nelle nostre prove utilizzando moderata ottica di immersione dell’olio-NA.
Quattro punti dovrebbero essere fatti qui:
(1) Con poche eccezioni, la situazione ideale in microscopia è che l’indice di rifrazione del campione dovrebbe essere uguale all’indice di rifrazione del fluido di immersione obiettivo17,18,13. Per gli studi di imaging tridimensionale (3D) in cui è necessaria una messa a fuoco profonda, questo è sempre importante.
(2) Il nostro risultato sperimentale per la compensazione ottimale (n – 1,525–1,535) è leggermente superiore rispetto agli oli di immersione standard (n – 1,515, 1,518) e quindi viola il punto (1), e quindi introduce una fonte di aberrazione sferica quando si utilizzano ottiche di immersione dell’olio standard. Una soluzione a questo problema è l’uso di un obiettivo progettato per un indice di immersione nella gamma superiore. A causa di una rinascita dell’interesse per l’imaging di esemplari cancellati, gli obiettivi speciali con la correzione necessaria stanno diventando disponibili. L’altra soluzione è quella di regolare l’indice del mezzo chiarificatore fino a 1.515 o 1.518 con l’aggiunta di una piccola quantità di butanolo (n – 1.399) per prestazioni ottimali di immersione dell’olio, e accettare la chiarezza leggermente degradata.
(3) La microscopia di biofilm intatti (e di altri campioni su questa scala) richiede una distanza di lavoro significativa per ospitare lo spessore del campione. Si tratta di una considerazione pratica importante. Una lunga distanza di lavoro limita l’ottica a un’apertura numerica moderata (NA – 0,6–1,25), che limita la risoluzione ma limita anche la gravità dell’aberrazione sferica.
(4) L’indice di rifrazione ottimale per il chiarimento può essere diverso per altri tipi di campioni fissi. Le spettre devono essere testate di conseguenza utilizzando il contrasto di fase e una serie di liquidi di riferimento dell’indice di rifrazione, come illustrato nella Figura 3.
Protocol
Representative Results
Discussion
I progressi nella microscopia a fluorescenza nel sezionamento ottico, nella risoluzione, nella velocità, nell’elusione o nella compensazione dell’aberrazione, nell’acquisizione multicanale e nella potenza di calcolo, hanno causato una rinascita nell’imaging di campioni intatti. Per gli esemplari fissi, sia i metodi di chiarimento e di espansione classici che nuovi hanno avuto un impatto importante19,20,21,22,23,24. In questo caso, abbiamo applicato un approccio rapido e semplice di corrispondenza dell’indice basato sul solvente per studiare la struttura dei biofilm fungini fortemente traslucidi in opaco.
I protocolli precedenti sono stati testati con una serie di campioni. Nel nostro laboratorio Candida albicans i biofilm sono più spesso coltivati su quadrati da 14 mm tagliati da un foglio di gomma medicale in silicone (vedi Tabella dei materiali). Questo substrato viene utilizzato perché la crescita sul PDMS (poli-dimetilsiloxane) sommersa nel mezzo di coltura liquida è stata stabilita come un importante modello in vitro per le infezioni associate agli impianti medici, in particolare i cateteri che abitano. Le cellule sollecitate che hanno avvistato il filamento aderiscono rapidamente a superfici non polari come la PDMS. In pratica, i quadrati usati che sono stati puliti e risterilizzati in un’autoclave (ciclo secco) danno i biofilm più coerenti per qualsiasi ceppo particolare. I biofilm sono anche comunemente coltivati su bicchieri di copertura, in piatti di coltura di fondo di vetro di copertura, in piatti in polistirolo di grado batteriologico standard, e su agar. Poiché le cellule di C. albicans non aderiscono bene al vetro, gli occhiali di copertura devono essere trattati con una lectina che legherà i polisafini della parete cellulare. Applichiamo 40 L di 1 mg/mL ConA o WGA in acqua sterile su ogni superficie di coverslip. Dopo l’essiccazione, gli occhiali di copertura vengono trattati con 40 – L dell’1% di glutaldeide per 3 min per incrociare la proteina in una pellicola insolubile. Vengono poi lavati con acqua distillata sterile per rimuovere la lectina fissativa e qualsiasi solubile e asciugata all’aria. Se necessario, gli occhiali o i piatti di copertura trattati vengono risterilizzati sotto una lampada UV germicida per 10 min.
Lo spessore dell’oggetto influenzerà i periodi di incubazione richiesti nei protocolli. La diffusione fissativa in un biofilm da 300 m richiede diversi minuti per l’equilibrate. Questo periodo di tempo aumenta con lo spessore del quadrato del campione e deve essere esteso a un’ora o più per biofilm molto spessi o campioni di blocchi di agar che possono essere spessi 2-3 mm. Il periodo di tempo di acchiognimento per la colorazione dipende anche dallo spessore del campione descritto per il fissaggio e il lavaggio. Tuttavia, poiché le lectine si diffondono più lentamente dei fissativi a basso MW, specialmente all’interno di un gel di agar, la colorazione deve essere estesa durante la notte. Lo stesso dovrebbe essere fatto per il lavaggio della macchia in eccesso.
Le macchie di vario tipo possono essere incorporate nei protocolli. Usiamo una macchia a parete cellulare per l’imaging strutturale, più comunemente Calcofluor White M2R (Fluor. Brightener #28) o una lectina con tag coloranti come ConA-Alexafluor 594 o WGA-Alexafluor 594. L’attenzione dovrebbe essere prestata alla valenza della proteina. Il tetramerO ConA può causare il crosslink di ife altamente flessibili nella regione apicale di un biofilm. Questo è meno evidente con il dimero WGA. Le specificità canoniche di questi marcatori sono Calcofluor per la chitina, ConA per i residui di mansidui e WGA per i residui di acido X-acetyl-D e sialic.
Poiché il protocollo di scambio di solventi è classificato da PBS o acqua attraverso il metanolo in salicilato metilico, i contenitori di campioni devono essere resistenti ai solventi. Il salicitore di metile (MS) ammorbidisce rapidamente i plastici in polistirolo e ammorbidisce lentamente altre materie plastiche. I gradini del protocollo fino all’uso del metanolo pulito possono essere effettuati in plasticware, ma a quel punto del protocollo generalmente passiamo alle fiale di vetro standard da 20 mL con tappi a vite resistenti ai solventi. Le fiale sono convenienti per biofilm su substrati quadrati in silicone, perché i quadrati possono essere raccolti e trasferiti utilizzando pinzette sottili. Inoltre, una fiala può essere drenata e riempita con il quadrato piatto appoggiato sulla superficie curva interna in modo che il biofilm non contatti il vetro. Il substrato dovrebbe essere biofilm-up quando è immerso nella fiala verticale. Le fiale sono eccellenti per lo stoccaggio di campioni a lungo termine.
Nel protocollo di chiarificazione, passaggi di scambio di solventi più graduati riducono al minimo il rischio di deformazione del campione a causa degli effetti di miscelazione del solvente. Per velocità e convenienza nel protocollo di base, ci sono quattro passaggi: 1) passo 3.3, PBS a 50:50 PBS:metanolo; 2) passaggi 3.4 e 3.5, PBS:metanolo per il metanolo pulito, 3) passo 3.6, metanolo pulito a 50:50 metanolo:MS; e 4) i passaggi 3.7 e 3.8, metanolo:MS per la smuna ordinata. Tuttavia, poiché l’acqua e la SM sono quasi immiscibili, è essenziale che tutta l’acqua sia spostata dal metanolo prima dell’introduzione di qualsiasi SM. Allo stesso modo, poiché il metanolo è altamente volatile, è importante spostando tutto il metanolo da parte della SM. l’evaporazione del metanolo residuo causerà variazioni dell’indice refrattivo all’interno del campione. All’interno della sequenza di quattro fasi, si consiglia di ripetere il secondo e il quarto passo aggiungendo un altro cambiamento di solvente pulito, o anche una terza modifica. Per gli esemplari particolarmente fragili, i cambiamenti dei solventi potrebbero essere formulati in piccoli passi percentuali.
Con gli esemplari di agar block, i gradini 3.4 e 3.5 (metanolo pulito) possono causare la comparsa di cristalli di sale all’interno dell’agar a causa dell’insorgarsibilità dei sali PBS residui nel metanolo. Ciò può essere evitato utilizzando acqua distillata (DW) nel primo passo solvente misto al posto della PBS per diluire i sali durante lo scambio di acqua:metanolo. La sequenza alternativa di scambio di solventi per biofilm fissi consiste quindi di questi passaggi: 1) fase 3.3, trasferire il campione da PBS in 50:50 DW:metanolo (consentire tempi supplementari per la diffusione attraverso l’agar); 2) passo 3.4, trasferire il campione da 50:50 DW:metanolo nel metanolo pulito (ripetere 2x con metanolo come nel passo 3.5); 3) passo 3.6, trasferire l’esemplare dal metanolo alle 50:50 metanolo:salicila di metile; e 4) passo 3.7, trasferire il campione da 50:50 metanolo:MS a SM pulito (ripetere 2x con SM come nel passo 3.8).
Poiché il salicilato di metile ammorbidisce rapidamente i plastici in polistirolo, utilizziamo un piatto di alluminio anodizzato con un fondo di vetro di copertura per contenere il biofilm chiarificato sullo stage di un microscopio invertito. Il vetro di copertura è tenuto in posizione utilizzando cemento ottico UV-curing (Norland Optical Adhesive #61, vedi Tabella dei materiali). A condizione che la SM venga rimossa alla fine della giornata lavando il piatto con isopropanolo seguito da acqua saponata e risciacquo, il vetro di copertura cementato servirà per molti mesi.
La selezione obiettiva delle lenti è di fondamentale importanza nell’imaging su larga scala di campioni chiarificati a causa dell’importanza di ridurre al minimo l’aberrazione sferica e la necessità di una distanza di lavoro sufficiente. Abbiamo esperienza con tre obiettivi in questi studi. Nella configurazione invertita del microscopio, utilizziamo un olio obiettivo a lunga distanza di lavoro, a apertura numerica moderata (NA) immerso sotto il vetro di copertura con il biofilm immerso nel salicilato metilico nel piatto sopra il vetro di copertura. La maggior parte del nostro lavoro è stato fatto con un obiettivo acromatico della serie Universal, tipo 461708, 40x 0.85NA Oel 160/1.5, utilizzato con un adattatore focale di lunghezza negativo 160 mm per la compatibilità nominale conconiugato infinito (IC). Questo obiettivo è stato originariamente progettato per la visualizzazione immersa nell’olio attraverso vetrini al microscopio da 1,5 mm con una distanza di lavoro di 0,35 mm25. Se utilizzato con un vetro di copertura standard (0,17 mm), la distanza di lavoro è molto maggiore: 1,5 x 0,35–0,17 , 1,68 mm e 1.680 m. Usiamo anche un nuovo obiettivo multi-immersione zeiss, tipo 420852, 25x 0.8NA LD LCI Plan-apochromat con una distanza di lavoro superiore a 540 m, con la correzione di immersione impostata sul lato alto di ‘olio’. Questo obiettivo è altamente corretto e produce un’immagine superba. Su un supporto al microscopio verticale, abbiamo usato un nuovo obiettivo multi-immersione Nikon, tipo MRD71120, 10x 0.5NA CFI Plan-apochromat con una distanza di lavoro superiore a 5.000 m (5 mm), anche con la correzione dell’immersione impostata sul lato alto di ‘olio’ (n – 1.518). Anche se questo obiettivo ha un NA inferiore rispetto agli altri, ha il vantaggio di essere direttamente immersibile in salicilato metilico.
Per ottimizzare l’acquisizione dei dati in termini di velocità e risoluzione, le impostazioni del microscopio confocale idealmente dovrebbero soddisfare densità di campionamento Nyquist trasversali e assiali18. Utilizzando i criteri convenzionali, impostare il diametro del foro stenopeico confocale nominalmente su 1 unità Airy. In coordinate ingrandite,
dP (M) – 1,22 x ingrandimento x (lunghezza d’onda di emissione in m) / NA
Il campionamento trasversale (spaziatura pixel) non deve superare il limite di risoluzione di Abbe (1/2) x. Nelle coordinate dello spazio oggetto,
(lunghezza d’onda di emissione in nm) / (4 NA)
Il campionamento assiale (incremento di messa a fuoco) non deve superare la larghezza di banda assiale inversa,
(indice di immersione) x (lunghezza d’onda di emissione in nm) / (NA2)
Il sistema ottico confocale espande la larghezza di banda del microscopio e affina la risoluzione trasversale e assiale di almeno 1/2.
Per l’obiettivo 40x 0,85 NA che utilizziamo più spesso, vedere la Tabella 1 per i risultati di queste formule per una lunghezza d’onda di emissione di 600 nm (Alexa Fluor 594).
| Formula | x 1/ 2 | set (tipico) | |
| dP (m) | 34,5 m | – | 25 o 50 m |
| x, y | 176 nm | 125 nm | 161 nm |
| z (z) | 1200 nm | 848 nm | 900 nm |
Tabella 1: diametro del foro stenopeico confocale, campionamento trasversale e valori di campionamento assiale per una lunghezza d’onda di emissione di 600 nm.
Utilizzando uno scanner confocale del disco rotante con queste impostazioni e un campo di scansione di 1.392 x 1.040 pixel, i dati dei campioni di biofilm possono essere acquisiti con velocità e risoluzione ragionevoli. Tipici stack di immagini 3D a colore singolo esecano da 0,35 a 1,55 GB.
Il supporto di chiarimento in un ampio utilizzo copre un intervallo di indici di rifrazione significativo. Con l’illuminazione di darkfield e l’ispezione visiva, abbiamo scoperto che i biofilm fissi di C. albicans erano più trasparenti al di sopra di n.5. Questo è stato perfezionato dalla microscopia a contrasto di fase a n – 1.530–1.535. Per una serie di motivi pratici, usiamo il salicilato di metile (n – 1.537) come solvente di corrispondenza dell’indice finale. Anche se lo scambio di solventi comporta il rischio di deformazione dei campioni o di altri artefatti, le cellule in esemplari fissi e chiari hanno dimensioni del corpo cellulare simili, diametro dell’ipfa e dimensioni di lunghezza intersettale come campioni vivi.
Sono possibili molte variazioni nel processo di scambio di solventi (ad esempio, utilizzando un solvente transitorio diverso o un solvente finale diverso). Il metanolo è stato scelto per la sua alta polarità e la sua rapida diffusione, ma l’etanolo è stato indicato per preservare meglio la resa quantistica delle proteine fluorescenti rosse (RFP)26 come solvente transitorio. Il salicilato di metile è stato selezionato per il suo indice, la polarità moderata, la bassa pressione del vapore e la compatibilità con molte macchie, coloranti e proteine fluorescenti. Tuttavia, un solvente finale con indice leggermente più basso, o una miscela di salicilato di metile e un solvente indice inferiore, come il butanolo, può servire meglio.
Inaspettatamente, la capacità di vedere attraverso un biofilm rivela non solo le sue caratteristiche interne stratificate, ma aiuta anche a visualizzare l’origine di strutture estese come lunghe ifae apicali lunghe e invasive e ipie basali invasive su alcuni substrati. La virulenza opportunistica nei C. albicans dipende dalla sua versatilità genetica (cioè il passaggio alla crescita dell’hyphal, l’upregulation del substrato cellulare e l’aderenza cellulare, la generazione di osmoitti per il germogliamento e l’allungamento delle cellule e l’uso di sostanze nutritive alternative). L’estensione della hyphal consente l’evasione di singole cellule C. albicans da cellule immunitarie fagocitiche, ma è anche essenziale per l’invasione. L’adesione del biofilm e l’entanglement dell’ifapale sembrano fornire l’ancoraggio superficiale necessario alle ife per invadere in modo efficiente un substrato. Quando tale substrato è tessuto ospite, può provocare una maggiore virulenza.
L’imaging di biofilm intatti consente un gran numero di esperimenti informativi che utilizzano ceppi di reporter per l’espressione genica, i substrati del tessuto modello e l’inclusione di altri organismi come i batteri presenti nei biofilm naturali. Anche nel caso più semplice dell’imaging puramente strutturale con una macchia a parete cellulare, vengono rivelati fenotipi in situ che possono essere quantificati e analizzati geneticamente.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questa ricerca è stata sostenuta in parte dalle sovvenzioni NIH R01 AI067703, R21 AI100270 e R21 AI135178 a A.P. Mitchell. Gli autori sono grati a Greenfield ‘Kip’ Sluder per aver fornito l’obiettivo di immersione petrolifera a lunga distanza di lavoro utilizzato in questo lavoro, e a Daniel Shiwarski per la microscopia confocale con immersione metilato diretto.
Materials
| Biohazardous waste receptacle | |||
| Biosafety cabinet with germicidal UV lamp | |||
| Calcofluor White M2R (2.5 mg/mL in methanol) | |||
| Concanavalin A – Alexafluor-594 or other conjugate | |||
| Distilled water | DW | ||
| Distilled water, sterile | |||
| Ethanol, absolute | EtOH | ||
| Fetal bovine serum (FBS), sterile | |||
| Fixative waste bottle in secondary containment | |||
| Formaldehyde 20% in water, ampules | Electron Microscopy Sciences | ||
| Formaldehyde alternatives: paraformaldehyde powder, formalin 37% | Electron Microscopy Sciences | ||
| Fume hood | |||
| Glutaraldehyde 25% in water, ampules | Electron Microscopy Sciences | ||
| Incubator – 30 deg C, with rotary mixer (60 rpm) for culture tubes | |||
| Incubator – 37 deg C, with orbital mixer for culture plates | |||
| Isopropanol 70% | iPrOH 70% | ||
| Longwave (365 nm) UV lamp, 5Watt | Cole-Parmer Scientific | for curing NOA-61 cement | |
| Medical grade silicone sheet, 0.060" (1.52 mm) thick | Bentec Medical, Inc., http://bentecmed.com/ | Non-reinforced medical grade silicone sheeting | |
| Methanol 99.9% | MeOH | ||
| Methyl salicylate 99% | MS | ||
| Millipore Swinnex 13mm white silicone ring gaskets | Millipore Corp. | SX0001301 | |
| Norland UV-curing optical adhesive – type NOA-61 | Edmund Optics, Inc., https://www.edmundoptics.com | NOA-61 | |
| Orbital mixer, benchtop | |||
| Phosphate-buffered saline (PBS), sterile | |||
| Refractive index standard liquids, n=1.500 to 1.640 (29 liquids, 0.005 increment) | Cargille Laboratories, https://cargille.com | Series E | Cedar Grove, NJ 07009, USA |
| RPMI-1640 base medium, HEPES buffered, sterile | |||
| Scintillation vials, 20 mL – Wheaton, Urea cap PE cone cap liner | Fisher Scientific Co. | 03-341-25H | for specimen processing and storage |
| Solvent waste bottle in secondary containment | |||
| Spider medium with mannitol, sterile (1% Difco nutrient broth, 0.2% K2HPO4, 1% D-Mannitol) | |||
| Wheat germ agglutinin – Alexafluor-594 or other conjugate | |||
| Yeast-peptone-dextrose (YPD) agar plates, sterile (1% yeast extract, 2% Bacto peptone, 2% dextrose, 2% Bacto agar) | |||
| YPD medium, liquid, sterile (1% yeast extract, 2% Bacto peptone, 2% dextrose) |
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