Klärende und Bildgebung Candida albicans Biofilme
Summary
Um die internen Merkmale von Candida albicans Biofilmen zu sehen und zu quantifizieren, bereiten wir feste intakte Proben vor, die durch Brechungsindex-Matching geklärt werden. Dann kann die optische Schnittmikroskopie verwendet werden, um dreidimensionale Bilddaten durch die volle Dicke des Biofilms zu erhalten.
Abstract
Der mikrobielle Pilz Candida albicans kann einen Wechsel von der kommensalen Kolonisation zu Virulenz durchlaufen, die stark mit seiner Fähigkeit korreliert, von Hefe-Form-Wachstum zu Hyphenwachstum zu wechseln. Zellen, die diesen Prozess einleiten, werden mit der daraus resultierenden Entwicklung einer Biofilmkolonie an Oberflächen und einander haften. Dies tritt häufig nicht nur auf Schleimhautgewebeoberflächen bei Hefeinfektionen auf, sondern auch auf medizinischen Implantaten wie Kathetern. Es ist allgemein bekannt, dass Biofilmzellen gegen Antimykotika resistent sind und dass Zellen, die aus dem Biofilm vergossen werden, zu gefährlichen systemischen Infektionen führen können. Biofilme reichen von stark transluzent bis undurchsichtig durch refraktive Heterogenität. Daher sind Pilzbiofilme durch optische Mikroskopie schwer zu untersuchen. Um interne strukturelle, zelluläre und subzelluläre Merkmale zu visualisieren, klären wir feste intakte Biofilme durch schrittweisen Lösungsmittelaustausch bis hin zu einem Punkt optimalen Brechungsindex-Abgleichs. Bei C. albicans Biofilmen wird eine ausreichende Klärung mit Methylsalicylat (n = 1.537) erreicht, um eine konfokale Mikroskopie von der Spitze zur Basis in 600 m Biofilmen mit geringer Dämpfung zu ermöglichen. In diesem Visualisierungsprotokoll skizzieren wir Phasenkontrastrefraktometrie, das Wachstum von Laborbiofilmen, Fixierung, Färbung, Lösungsmittelaustausch, den Aufbau für konfokale Fluoreszenzmikroskopie und repräsentative Ergebnisse.
Introduction
Candida albicans ist ein mikrobieller Pilz, der typischerweise beim Menschen vorkommenkann. Es ist von grundsätzlichem Interesse für Biologen, weil der Organismus mehrere Morphologien hat. Als Reaktion auf bestimmte Umwelthinweise oder Stressoren werden beispielsweise hefeförmige angehende Zellen zu fadenförmigem Wachstum als Septikulierende Ketten hochlängsseitiger Zellen, die als Hyphen bekannt sind, umschalten. Der Übergang ist wichtig als Beispiel für die phänotypische Expression einer Umstellung zwischen einem einzelligen und einem mehrzelligen Genexpressionsprogramm. Ebenso ist C. albicans von biomedizinischem Interesse, weil der Organismus ein bekannter opportunistischer Erreger ist. Es ist verantwortlich für Schleimhauthefe-Infektionen wie Soor (orale Candidiasis), Genitourinäre Infektionen, und eine Ursache für gefährliche invasive oder systemische Infektionen bei immunologisch geschwächten Patienten.
Das Potenzial dieses Organismus für Virulenz ist eng mit seinen multiplen Morphotypen und anderen Aspekten seiner genetischen Vielseitigkeit1,2,3,4verbunden. Die Keimröhrenverlängerung, die erste sichtbare Stufe des Übergangs zum Hyphalwachstum, tritt mit ausreichender Schnelligkeit auf, um verschlungenen C. albicans-Zellen zu ermöglichen, aus Phagozyten auszubrechen und dadurch einer frühen Phase der zellulären Immunantwort des Wirts zu entkommen5. Zusätzlich wird der Filamentierung ein großer Anstieg der Zell-zu-Zell- und Zell-zu-Oberfläche-Haftung vorausgestellt, die auf die regulierte Expression mehrerer Klassen von Zellwandproteinen zurückzuführen ist, die als Adhäsine6,7,8,9bekannt sind. Unter den verschiedensten Bedingungen führt die Kombination von Adhärenz und Filamentierung zu einer dramatischen Verschiebung vom planktonischen, einzelzellulären Wachstum hin zu oberflächenassoziiertem kolonialem Wachstum, das einen Biofilm bildet. C. Albicans Biofilme können sich auf gängigen implantierten Medizinprodukten wie Venenkathetern entwickeln. Disseminierte Infektionen können entstehen, wenn solche Biofilme beginnen, Hefe-formierte Zellen abzuzapfen und sie in zirkulierendes Blut zu vergießen. Mehrere Studien haben gezeigt, dass Biofilmzellen resistenter gegen Antimykotika sind als planktonische Zellen10,11, die zum Teil auf einen abgesenkten Stoffwechsel zurückzuführen sein können12. Darüber hinaus kann die hohe Gesamthaftung eines Biofilms die Verankerung für ein effizientes invasives Wachstum von Hyphen in Wirtsgewebe1liefern.
Die optische Klärung von C. albicans Biofilmen durch Brechungsindex-Matching hat unsere Fähigkeit, die Struktur dieser mikrobiellen Gemeinschaft zu visualisieren und Zusammenhänge zwischen Genexpression und Phänotyp zu entdecken, stark beeinflusst. Biofilme, die im Labor auf Testflächen unter flüssigem Kulturmedium für 48 h angebaut werden, erscheinen als eine weißliche Beschichtung, die dicht genug und dick genug ist, um undurchsichtig zu sein (Abbildung 1). Daher sind viele interessante phänotypische Merkmale des Biofilms verborgen. Die 24 h Wild-Biofilme, die in YPD, RPMI-1640 oder Spider Medium mit einer Reichweite von 37 °C bis zu 300 m Dicke angebaut werden, mit 48 h Biofilmen, die oft 500 m erreichen. Die Deckkraft ist auf die Lichtstreuung zurückzuführen, die durch refraktive Heterogenität entsteht: Die Pilzzellwand ist refraktiver als das umgebende Medium und das Zytoplasma etwas refraktiver als die Zellwand. Die daraus resultierende hohe optische Dichte eines nativen Biofilms verdeckt alle Strukturen, die mehr als 30 m tief sind, wenn man sie mit einem herkömmlichen Mikroskop oder sogar einem konfokalen Scanner betrachtet (Abbildung 2). Ein hohes Maß an Klärung kann jedoch durch das Infiltrieren fester Biofilme mit einer flüssigkeitsstarken Flüssigkeit mit hohem Brechungsindex erreicht werden, die in etwa der Refraktivität wichtiger zellulärer Bestandteile entspricht. Nach der Klärung kann die Bildgebung bei Submikron-Auflösung durch konfokale Mikroskopie durch die gesamte Dicke fast jedes C. albicans Biofilms13durchgeführt werden. Bei Wild-Exemplaren ist leicht zu erkennen, dass Biofilme aus lang verschränkten Hyphen, Clustern von budded Hefe-Form-Zellen oder Pseudohyphalzellen, Leerräumen und einer gewissen Menge extrazellulärer Matrix bestehen. Darüber hinaus werden Biofilme im Allgemeinen geschichtet, die räumlich variantenweise morphologische Unterschiede in Zelltyp, Zelldichte und das Vorhandensein von angehenden oder verzweigten Zellen zeigen. Viele Variationen in einem oder mehreren dieser Merkmale wurden in Biofilmen beobachtet, die von mutierten Stämmen14,15entwickelt wurden. Zusätzlich zeigen Reporterstämme in situ räumliche Unterschiede in der Genexpression16,9,13. Der überraschende Klärungsgrad, der mit diesem relativ einfachen und kostengünstigen Ansatz erzielt werden kann, lässt auch erkennen, dass viele Biofilme apikale Hyphen und basalinvasive Hyphen enthalten, die sich bis in Millimeterentfernungen ausdehnten.
In diesem Visualisierungsprotokoll zeigen wir die Fixierung, Etikettierung, Klärung und Abbildung eines C. albicans Biofilms mit einem einfachen Zellwandmarker als Fleck. Der Ursprung der vorliegenden Version des Protokolls ist die verbesserte Klarheit, die wir beobachteten, als Formaldehyd-fixierte Biofilme mit 97% Glykolmethacrylat (GMA) infiltriert wurden, das dann polymerisiert wurde, um den Biofilm in einen harten Kunststoff mit einem mäßig hohen Brechungsindex einzubetten (n = 1,49). Wir verwendeten dann die konventionelle Phasenkontrastmikroskopie und eine Reihe von refraktiven Indexreferenzflüssigkeiten, um den Kontrastpunktumkehrpunkt (maximale Transparenz) des Biofilms genauer zu bestimmen (Abbildung 3). Bei C. albicans Biofilmen trat dies nahe n = 1,530 auf, was überraschend hoch war, da eine dichte Proteinstruktur wie Haarkeratin nur geringfügig refraktiver ist (1,54–1,55). Obwohl es sich am oberen Ende des optimalen Bereichs in Abbildung 3befindet, haben wir Methylsalicylat (Öl von Wintergrün, n = 1.537) im aktuellen Protokoll verwendet, weil es seit langem als Klärungsmittel für die Mikroskopie in der Embryologie und Histologie verwendet wird, es hat eine geringe Toxizität und einen niedrigen Dampfdruck, und es hat hervorragende Ergebnisse in unseren Studien mit moderaten NA-Ölimmer-Optiken.
Vier Punkte sind hier zu beachten:
(1) Mit wenigen Ausnahmen ist die ideale Situation in der Mikroskopie, dass der Brechungsindex der Probe dem Brechungsindex der Objektivlinsen-Tauchflüssigkeit17,18,13gleich sein sollte. Für dreidimensionale (3D) Bildgebungsstudien, bei denen eine tiefen Fokussierung notwendig ist, ist dies immer wichtig.
(2) Unser Versuchsergebnis für eine optimale Clearingung (n = 1.525–1.535) ist etwas höher als Standard-Tauchöle (n = 1.515, 1.518) und verstößt somit gegen Punkt (1) und führt somit eine Quelle sphärischer Aberration bei Verwendung von Standard-Öl-Immersionsoptiken ein. Eine Lösung für dieses Problem ist die Verwendung eines Ziels, das für einen Tauchindex im höheren Bereich entwickelt wurde. Aufgrund des wieder auflebenden Interesses an bildgeclearten Proben werden Spezialziele mit der erforderlichen Korrektur verfügbar. Die andere Lösung besteht darin, den Index des klärenden Mediums auf 1,515 oder 1,518 um eine geringe Menge Butanol (n = 1,399) für eine optimale Öltauchleistung anzupassen und die leicht abgebaute Klarheit zu akzeptieren.
(3) Die Mikroskopie intakter Biofilme (und anderer Proben in diesem Maßstab) erfordert einen erheblichen Arbeitsabstand, um die Probendicke aufzunehmen. Dies ist eine wichtige praktische Überlegung. Ein langer Arbeitsabstand begrenzt die Optik auf eine moderate numerische Blende (NA = 0,6–1,25), was die Auflösung, aber auch die Schwere der sphärischen Aberration begrenzt.
(4) Der optimale Brechungsindex zur Klärung kann bei anderen Arten fester Proben unterschiedlich sein. Die Proben sollten entsprechend anhand des Phasenkontrasts und einer Reihe von refraktiven Indexreferenzflüssigkeiten getestet werden, wie in Abbildung 3dargestellt.
Protocol
Representative Results
Discussion
Fortschritte in der Fluoreszenzmikroskopie in der optischen Schnittung, Auflösung, Geschwindigkeit, Vermeidung oder Kompensation von Aberration, Mehrkanalerfassung und Rechenleistung haben zu einem Wiederaufleben der Bildgebung intakter Proben geführt. Bei festen Proben haben sowohl klassische als auch neuartige Klärungs- und Expansionsmethoden eine große Wirkung gehabt19,20,21,22,23,24. In diesem Fall haben wir einen schnellen und einfachen lösemittelbasierten Index-Matching-Ansatz angewendet, um die Struktur von Pilzbiofilmen zu untersuchen, die stark transluzent auf undurchsichtig sind.
Die vorhergehenden Protokolle wurden mit einer Reihe von Proben getestet. In unserem Labor Candida albicans Biofilme werden am häufigsten auf 14 mm Quadraten aus einem Blatt medizinischer Silikonkautschuk geschnitten (siehe Tabelle der Materialien). Dieses Substrat um wird verwendet, weil das Wachstum auf PDMS (Poly-Dimethylsiloxan) in flüssigem Kulturmedium als wichtiges In-vitro-Modell für Infektionen im Zusammenhang mit medizinischen Implantaten, insbesondere Indwelling Katheter, etabliert wurde. Gestresste Zellen, die eine Filamentierung einführen, haften schnell an unpolaren Oberflächen wie PDMS. In der Praxis geben gebrauchte Quadrate, die in einem Autoklaven (Trockenzyklus) gereinigt und resterilisiert wurden, die konsistentesten Biofilme für eine bestimmte Sorte. Biofilme werden auch häufig auf Deckgläsern, in Coverglasbodenkulturgerichten, in Standard-Bakteriologischen Polystyrolgerichten und auf Agar angebaut. Da C. albicans Zellen nicht gut an Glas haften, sollten Deckgläser mit einem Lektin behandelt werden, das Zellwandpolysaccharide bindet. Wir tragen 40 l von 1 mg/ml ConA oder WGA in sterilem Wasser auf jede deckfeste Oberfläche auf. Nach dem Trocknen werden die Deckgläser mit 40 l Glutaraldehyd für 3 min behandelt, um das Protein mit einem unlöslichen Film zu vernetzen. Sie werden dann mit sterilem destilliertem Wasser gewaschen, um das fixative und lösliche Lektin zu entfernen und luftgetrocknet. Bei Bedarf werden die behandelten Deckgläser oder Geschirr 10 min unter einer keimtötenden UV-Lampe resterilisiert.
Die Probendicke wirkt sich auf die erforderlichen Inkubationszeiträume in den Protokollen aus. Die fixative Diffusion in einen 300-m-Biofilm erfordert mehrere Minuten, um sich auszuausgleichen. Dieser Zeitraum nimmt mit dem Quadrat der Probendicke zu und sollte bei sehr dicken Biofilmen oder Agarblockproben, die 2–3 mm dick sein können, auf eine Stunde oder mehr verlängert werden. Die Ausgleichszeit für die Färbung hängt auch von der Probendicke ab, wie sie für die Fixierung und das Auswaschen beschrieben wird. Da die Lektine jedoch langsamer diffundieren als die Low-MW-Fixative, insbesondere innerhalb eines Agargels, sollte die Färbung über Nacht verlängert werden. Das gleiche sollte für das Auswaschen von überschüssigen Flecken getan werden.
Flecken verschiedener Art können in die Protokolle aufgenommen werden. Wir verwenden einen Zellwandfleck für die strukturelle Bildgebung, am häufigsten Calcofluor White M2R (Fluor. Aufheller #28) oder ein mit Farbstoffen versehenes Lektin wie ConA-Alexafluor 594 oder WGA-Alexafluor 594. Es sollte auf die Valenz des Proteins geachtet werden. Das ConA-Tetramer kann eine Vernetzung hochflexibler Hyphen im apikalen Bereich eines Biofilms verursachen. Dies ist beim WGA-Dimer weniger offensichtlich. Die kanonischen Besonderheiten dieser Marker sind Calcofluor für Chitin, ConA für Mannoserückstände und WGA für N-Acetyl-D-Glucosamin- und Sialinsäurerückstände.
Da das Lösungsmittelaustauschprotokoll von PBS oder Wasser durch Methanol zu Methylsalicylat abgestuft ist, müssen Probenbehälter lösungsmittelbeständig sein. Methylsalicylat (MS) wird Polystyrol-Kunststoff schnell erweichen und andere Kunststoffe langsam erweichen. Das Protokoll schritte bis zur Verwendung des ordentlichen Methanols kann in Kunststoffen durchgeführt werden, aber an diesem Punkt im Protokoll wechseln wir in der Regel auf Standard 20 ml Glasszintillationsfläschchen mit lösungsmittelbeständigen Schraubverschlüssen. Die Fläschchen eignen sich für Biofilme auf Silikonquadrat-Substrata, da die Quadrate mit einer feinen Pinzette aufgenommen und übertragen werden können. Außerdem kann eine Durchstechflasche entleert und mit dem flachen Quadrat auf der inneren gekrümmten Oberfläche aufgefüllt werden, so dass der Biofilm das Glas nicht in Berührung bringt. Das Substrat sollte Biofilm-up sein, wenn es in die aufrechte Durchstechflasche eingetaucht wird. Die Durchstechflaschen eignen sich hervorragend für die Langzeitlagerung von Proben.
Im Klärungsprotokoll minimieren abgestufte Lösungsmittelaustauschschritte das Risiko einer Probenverformung durch Lösungsmittelmischeffekte. Für Geschwindigkeit und Komfort im Basisprotokoll gibt es vier Schritte: 1) Schritt 3.3, PBS bis 50:50 PBS:methanol; 2) Schritte 3.4 und 3.5, PBS:Methanol zu sauberem Methanol, 3) Schritt 3.6, ordentlichm Methanol bis 50:50 Methanol:MS; und 4) Schritte 3.7 und 3.8, Methanol:MS bis ordentlich MS. Methanol sorgt für die Übergangsmiszerbarkeit. Da Wasser und MS jedoch nahezu unmischbar sind, ist es wichtig, dass das gesamte Wasser vor der Einführung einer MS durch Methanol verdrängt wird. Da Methanol sehr flüchtig ist, ist es wichtig, alle Methanole durch MS zu verdrängen. Die Verdunstung von Restmethanol führt zu Refraktiven Indexschwankungen innerhalb der Probe. Innerhalb der vierstufigen Sequenz ist es ratsam, den zweiten und vierten Schritt zu wiederholen, indem eine weitere Änderung des ordentlichen Lösungsmittels oder sogar eine dritte Änderung hinzugefügt wird. Bei besonders empfindlichen Proben könnten Lösungsmittelveränderungen in kleineren Prozentschritten formuliert werden.
Bei Agarblockproben können die Schritte 3.4 und 3.5 (neat methanol) das Auftreten von Salzkristallen innerhalb des Agars aufgrund der Unlöslichkeit von REST-PBS-Salzen im Methanol verursachen. Dies kann vermieden werden, indem destilliertes Wasser (DW) im ersten gemischten Lösungsmittelschritt anstelle von PBS verwendet wird, um Salze während des Wasser-Methanol-Austauschs zu verdünnen. Die alternative Lösungsmittelaustauschsequenz für feste Biofilme besteht dann aus folgenden Schritten: 1) Schritt 3.3, übertragen Sie die Probe von PBS in 50:50 DW:methanol (erlauben Sie zusätzliche Zeit für die Diffusion durch Agar); 2) Schritt 3.4, die Probe von 50:50 DW:Methanol in sauberes Methanol übertragen (2x mit Methanol wie in Schritt 3.5 wiederholen); 3) Schritt 3.6, die Probe von Methanol auf 50:50 Methanol übertragen:Methylsalicylat; und 4) Schritt 3.7, übertragen Sie die Probe von 50:50 methanol:MS auf ordentlichMS (wiederholen Sie 2x mit MS wie in Schritt 3.8).
Da Methylsalicylat Polystyrol-Kunststoffschnellundungen schnell erweicht, verwenden wir eine eloxierte Aluminiumschale mit einem Abdeckglasboden, um den geklärten Biofilm auf der Bühne eines invertierten Mikroskops zu halten. Das Deckglas wird mit UV-härtendem optischem Zement (Norland Optical Adhesive #61, siehe Materialtabelle) an Ort und Stelle gehalten. Sofern die MS am Ende des Tages durch Waschen der Schale mit Isopropanol gefolgt von Seifenwasser und Spülen entfernt wird, wird das zementierte Deckglas für viele Monate dienen.
Die objektive Linsenauswahl ist bei der großflächigen Abbildung geklärter Proben von entscheidender Bedeutung, da die Sphärische Aberration minimiert werden muss und ein ausreichender Arbeitsabstand erforderlich ist. Wir haben Erfahrung mit drei Zielen in diesen Studien. Im invertierten Mikroskop-Setup verwenden wir ein langes Arbeitsweg,moderate numerische Blende (NA) Objektivöl unter dem Deckglas mit dem Biofilm in Methylsalicylat in der Schale über dem Deckglas eingetaucht. Der größte Teil unserer Arbeit wurde mit einem achromatischen Objektiv der Zeiss Universal-Serie, Typ 461708, 40x 0.85NA Oel 160/1.5, durchgeführt, der mit einem negativen 160 mm Brennweitenadapter für die nominale Endloskonjugatkompatibilität (IC) verwendet wird. Dieses Ziel wurde ursprünglich für die Öl-Betrachtung durch 1,5-mm-Mikroskopschlitten mit 0,35 mm Arbeitsabstand25entwickelt. Bei Verwendung mit einem Standard-Abdeckungsglas (0,17 mm) ist der Arbeitsabstand viel größer: 1,5 + 0,35–0,17 = 1,68 mm = 1.680 m. Wir verwenden auch ein neues Zeiss Multi-Immersion-Objektiv, Typ 420852, 25x 0.8NA LD LCI Plan-Apochromat mit einem Arbeitsabstand von mehr als 540 m, wobei die Tauchkorrektur auf die hohe Seite des Öls eingestellt ist. Dieses Ziel ist stark korrigiert und erzeugt ein hervorragendes Bild. Auf einem aufrechten Mikroskopständer haben wir ein neues Nikon Multi-Immersion-Objektiv, Typ MRD71120, 10x 0.5NA CFI Plan-Apochromat mit einem Arbeitsabstand von mehr als 5.000 m (5 mm), auch mit der Tauchkorrektur auf der hohen Seite von ‘Öl’ (n = 1.518) verwendet. Obwohl dieses Ziel eine niedrigere NA als die anderen hat, hat es den Vorteil, direkt in Methylsalicylat eingetaucht zu sein.
Um die Datenerfassung in Bezug auf Geschwindigkeit und Auflösung zu optimieren, sollten konfokale Mikroskopeinstellungen idealerweise sowohl die transveren als auch die axiale Nyquist-Probenahmedichte18erfüllen. Legen Sie den konfokalen Lochdurchmesser nach herkömmlichen Kriterien nominell auf 1 Luftiger Einheit fest. In vergrößerten Koordinaten
dP (m) = 1,22 x Vergrößerung x (Emissionswellenlänge in m) / NA
Querabtasten (Pixelabstand) sollte die Auflösungsgrenze von Abbe nicht überschreiten (1/2) x abbe. In Objektraumkoordinaten
x, y = (Emissionswellenlänge in nm) / (4 NA)
Axiale Probenahme (Fokusinkrement) sollte die inverse axiale Bandbreite nicht überschreiten,
z = (Tauchindex) x (Emissionswellenlänge in nm) / (NA2)
Das konfokale optische System erweitert die Bandbreite des Mikroskops und schärft sowohl die Transveren- als auch die Axialauflösung um mindestens 1/2.
Für das 40x 0.85 NA-Objektiv, das wir am häufigsten verwenden, siehe Tabelle 1 für die Ergebnisse dieser Formeln für eine 600 nm Emissionswellenlänge (Alexa Fluor 594).
| Formel | x 1 /2 | eingestellt (typisch) | |
| dP (m) | 34,5 m | – | 25 oder 50 m |
| X, Y | 176 nm | 125 nm | 161 nm |
| z | 1200 nm | 848 nm | 900 nm |
Tabelle 1: Konfokaler Lochdurchmesser, Querentnahme und axiale Probenahmewerte für eine Emissionswellenlänge von 600 nm.
Mit einem Konfokusscanner mit diesen Einstellungen und einem 1.392 x 1.040 Pixel Scanfeld können Daten von Biofilmproben mit angemessener Geschwindigkeit und Auflösung erfasst werden. Typische einfarbige 3D-Bildstapel haben 0,35–1,55 GB.
Klärungsmedien im breiten Einsatz bereichen einen signifikanten Brechungsindexbereich. Durch Dunkelfeldbeleuchtung und Sichtprüfung stellten wir fest, dass feste C. albicans Biofilme oberhalb von n = 1,5 am transparentesten waren. Dies wurde durch Phasenkontrastmikroskopie auf n = 1.530–1.535 verfeinert. Aus einer Reihe praktischer Gründe verwenden wir Methylsalicylat (n = 1.537) als endgültiges Index-Matching-Lösungsmittel. Obwohl der Lösungsmittelaustausch das Risiko einer Probenverformung oder anderer Artefakte mit sich bringt, weisen Zellen in festen, geklärten Proben ähnliche Zellkörperabmessungen, einen Hyphendurchmesser und interseptale Längenmaße wie lebende Proben auf.
Viele Variationen im Lösungsmittelaustauschprozess sind möglich (z.B. mit einem anderen Übergangslösungsmittel oder einem anderen Endlösungsmittel). Methanol wurde aufgrund seiner hohen Polarität und schnellen Diffusion gewählt, aber Ethanol wurde gezeigt, dass es die Quantenausbeute26 des roten fluoreszierenden Proteins (RFP) als Übergangslösungsmittel besser konservieren würde. Methylsalicylat wurde aufgrund seines Index, der moderaten Polarität, des niedrigen Dampfdrucks und der Kompatibilität mit vielen Flecken, Farbstoffen und fluoreszierenden Proteinen ausgewählt. Ein endgültiges Lösungsmittel mit etwas niedrigerem Index oder eine Mischung aus Methylsalicylat und einem niedrigeren Indexlösungsmittel, wie Butanol, kann jedoch besser dienen.
Unerwartet zeigt die Fähigkeit, einen Biofilm durchzusehen, nicht nur seine geschichteten inneren Merkmale, sondern hilft auch, den Ursprung erweiterter Strukturen wie lange, unverworrene apische Hyphen und invasive basalen Hyphen auf bestimmten Substraten zu betrachten. Opportunistische Virulenz bei C. albicans hängt von seiner genetischen Vielseitigkeit ab (d.h. Umstellung auf Hyphalwachstum, Upregulation von Zellsubstrat und Zellzellhaftung, Erzeugung von Osmolyten für Zellkeimen und Dehnung enrdung, und Verwendung alternativer Nährstoffe). Die Hyphal-Erweiterung ermöglicht den Ausbruch einzelner C. Albicans-Zellen aus phagozytischen Immunzellen, ist aber auch für die Invasion unerlässlich. Biofilmhaftung und Hyphenverflechtung scheinen die Oberflächenverankerung zu bieten, die für Hyphen erforderlich ist, um effizient in ein Substrat einzudringen. Wenn dieses Substrat um Wirtsgewebe ist, kann eine erhöhte Virulenz auftreten.
Die Abbildung intakter Biofilme ermöglicht eine Vielzahl von informativen Experimenten, bei denen Reporterstämme für die Genexpression, Modellgewebesubstrate und die Einbeziehung anderer Organismen wie Bakterien in natürlichen Biofilmen verwendet werden. Selbst im einfachsten Fall der rein strukturellen Bildgebung mit einem Zellwandfleck werden In-situ-Phänotypen aufgedeckt, die dann quantifiziert und genetisch analysiert werden können.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Forschung wurde teilweise durch NIH-Stipendien R01 AI067703, R21 AI100270 und R21 AI135178 an A.P. Mitchell unterstützt. Die Autoren sind Greenfield ‘Kip’ Sluder dankbar für die Bereitstellung des in dieser Arbeit verwendeten Ziels für das Eintauchen von Fernöl und Daniel Shiwarski für die konfokale Mikroskopie mit direkter Methylsalicylat-Immersion.
Materials
| Biohazardous waste receptacle | |||
| Biosafety cabinet with germicidal UV lamp | |||
| Calcofluor White M2R (2.5 mg/mL in methanol) | |||
| Concanavalin A – Alexafluor-594 or other conjugate | |||
| Distilled water | DW | ||
| Distilled water, sterile | |||
| Ethanol, absolute | EtOH | ||
| Fetal bovine serum (FBS), sterile | |||
| Fixative waste bottle in secondary containment | |||
| Formaldehyde 20% in water, ampules | Electron Microscopy Sciences | ||
| Formaldehyde alternatives: paraformaldehyde powder, formalin 37% | Electron Microscopy Sciences | ||
| Fume hood | |||
| Glutaraldehyde 25% in water, ampules | Electron Microscopy Sciences | ||
| Incubator – 30 deg C, with rotary mixer (60 rpm) for culture tubes | |||
| Incubator – 37 deg C, with orbital mixer for culture plates | |||
| Isopropanol 70% | iPrOH 70% | ||
| Longwave (365 nm) UV lamp, 5Watt | Cole-Parmer Scientific | for curing NOA-61 cement | |
| Medical grade silicone sheet, 0.060" (1.52 mm) thick | Bentec Medical, Inc., http://bentecmed.com/ | Non-reinforced medical grade silicone sheeting | |
| Methanol 99.9% | MeOH | ||
| Methyl salicylate 99% | MS | ||
| Millipore Swinnex 13mm white silicone ring gaskets | Millipore Corp. | SX0001301 | |
| Norland UV-curing optical adhesive – type NOA-61 | Edmund Optics, Inc., https://www.edmundoptics.com | NOA-61 | |
| Orbital mixer, benchtop | |||
| Phosphate-buffered saline (PBS), sterile | |||
| Refractive index standard liquids, n=1.500 to 1.640 (29 liquids, 0.005 increment) | Cargille Laboratories, https://cargille.com | Series E | Cedar Grove, NJ 07009, USA |
| RPMI-1640 base medium, HEPES buffered, sterile | |||
| Scintillation vials, 20 mL – Wheaton, Urea cap PE cone cap liner | Fisher Scientific Co. | 03-341-25H | for specimen processing and storage |
| Solvent waste bottle in secondary containment | |||
| Spider medium with mannitol, sterile (1% Difco nutrient broth, 0.2% K2HPO4, 1% D-Mannitol) | |||
| Wheat germ agglutinin – Alexafluor-594 or other conjugate | |||
| Yeast-peptone-dextrose (YPD) agar plates, sterile (1% yeast extract, 2% Bacto peptone, 2% dextrose, 2% Bacto agar) | |||
| YPD medium, liquid, sterile (1% yeast extract, 2% Bacto peptone, 2% dextrose) |
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