Clarification et imagerie Candida albicans Biofilms
Summary
Pour visualiser et quantifier les caractéristiques internes des biofilms Candida albicans, nous préparons des spécimens intacts fixes qui sont clarifiés par l’appariement des indices réfractifs. Ensuite, la microscopie de section optique peut être utilisée pour obtenir des données d’image tridimensionnelles bien que toute l’épaisseur du biofilm.
Abstract
Le champignon microbien Candida albicans peut subir un changement de la colonisation proportionnelle à la virulence qui est fortement corrélée avec sa capacité à passer de la croissance de levure-forme à la croissance hyphale. Les cellules initiant ce processus deviennent adhérentes aux surfaces ainsi qu’aux autres, avec le développement résultant d’une colonie de biofilm. Cela se produit généralement non seulement sur les surfaces des tissus muqueux dans les infections à levures, mais aussi sur les implants médicaux tels que les cathéters. Il est bien connu que les cellules biofilm sont résistantes aux médicaments antifongiques, et que les cellules qui se débarrassent du biofilm peuvent conduire à des infections systémiques dangereuses. Les biofilms vont de fortement translucide à opaque en raison de l’hétérogénéité réfractive. Par conséquent, les biofilms fongiques sont difficiles à étudier par microscopie optique. Pour visualiser les caractéristiques structurelles, cellulaires et subcellulaires internes, nous clarifions les biofilms intacts fixes par échange de solvants progressives à un point de correspondance optimale d’index réfractiv. Pour les biofilms C. albicans, des éclaircissements suffisants sont obtenus avec le salicylate méthyle (n – 1.537) pour permettre la microscopie confocienne d’apex à base dans 600 biofilms de m avec peu d’atténuation. Dans ce protocole de visualisation, nous décrivons la réfractomemétrie de contraste de phase, la croissance des biofilms de laboratoire, la fixation, la coloration, l’échange de solvants, la configuration pour la microscopie confocale de fluorescence, et les résultats représentatifs.
Introduction
Candida albicans est un champignon microbien qui est généralement commensal chez l’homme. Il est d’un intérêt fondamental pour les biologistes parce que l’organisme a de multiples morphologies. Par exemple, en réponse à certains indices environnementaux ou facteurs de stress, les cellules en herbe de forme de levure passeront à la croissance filamenteuse en tant que chaînes septating de cellules très allongées connues sous le nom d’hyphae. La transition est importante comme exemple de l’expression phénotypique d’un changement entre un programme unicellulaire et multicellulaire d’expression génique. De même, C. albicans est d’intérêt biomédical parce que l’organisme est un agent pathogène opportuniste bien connu. Il est responsable des infections muqueuses de levure telles que le muguet (candidiasis orale), les infections génito-urinaires, et une cause d’infections invasives ou systémiques dangereuses dans les patients immunologiquement affaiblis.
Le potentiel de virulence de cet organisme est étroitement lié à ses multiples morphotypes et à d’autres aspects de sa polyvalence génétique1,2,3,4. L’extension du tube germinal, première étape visible de la transition vers la croissance hyphale, se produit avec une rapidité suffisante pour permettre aux cellules englouties de C. albicans de sortir des phagocytes et ainsi échapper à une phase précoce de la réponse immunitaire cellulaire de l’hôte5. En outre, la filamentation est précédée et accompagnée d’une forte augmentation de l’adhérence cellulaire à cellule et cellule à la surface qui est due à l’expression réglementée de plusieurs classes de protéines de mur cellulaire connu sous le nom d’adhésins6,7,8,9. Dans une grande variété de conditions, la combinaison de l’adhérence et de la filamentation entraîne un passage spectaculaire de la croissance planctonique et unicellulaire à la croissance coloniale associée à la surface qui forme un biofilm. Les biofilms C. albicans peuvent se développer sur des dispositifs médicaux implantés communs tels que des cathéters veineux. Les infections disséminées peuvent se traduire par le fait que ces biofilms commencent à se débarrasser des cellules de forme de levure et les jettent dans le sang circulant. Plusieurs études ont montré que les cellules biofilm sont plus résistantes aux médicaments antifongiques que les cellules planctoniques10,11, qui peuvent être dues en partie à l’abaissement du métabolisme12. En outre, l’adhésion globale élevée d’un biofilm peut fournir l’ancrage nécessaire pour une croissance invasive efficace de l’hyphe dans le tissu hôte1.
La clarification optique des biofilms C. albicans par appariement d’index réfractif a eu un impact majeur sur notre capacité à visualiser la structure de cette communauté microbienne et à découvrir des relations entre l’expression génique et le phénotype. Les biofilms cultivés en laboratoire sur des surfaces d’essai sous un milieu de culture liquide de 48 h apparaissent comme un revêtement blanchâtre assez dense et assez épais pour être opaque(figure 1). Par conséquent, de nombreuses caractéristiques phénotypiques intéressantes du biofilm sont cachées de la vue. Les biofilms de type sauvage de 24 h cultivés en YPD, RPMI-1640, ou Spider moyen à 37 oC gamme jusqu’à 300 m d’épaisseur, avec 48 h biofilms atteignant souvent 500 m. L’opacité est due à la diffusion de la lumière, qui résulte de l’hétérogénéité réfractive: la paroi fongique cellulaire est plus réfractive que le milieu environnant, et le cytoplasme légèrement plus réfractive que la paroi cellulaire. La forte densité optique résultante d’un biofilm indigène obscurcit toutes les structures de plus de 30 m de profondeur lorsqu’elle est vue avec un microscope conventionnel ou même un scanner confocal(figure 2). Cependant, un grand degré de clarification peut être réalisé en infiltrant les biofilms fixes avec un liquide d’index réfractif élevé qui correspond approximativement à la réfractivité des principaux constituants cellulaires. Après clarification, l’imagerie à la résolution submicron peut être effectuée par microscopie confocienne à travers toute l’épaisseur de presque n’importe quel biofilm C. albicans 13. Dans les spécimens de type sauvage, il est facile de voir que les biofilms se composent de hyphes enchevêtrés longs, des grappes de cellules burées de levure-forme ou des cellules pseudohyphales, des espaces vides, et une certaine quantité de matrice extracellulaire. En outre, les biofilms sont généralement stratifiés, montrant des différences morphologiques spatialement variantes dans le type de cellule, la densité cellulaire, et la présence de cellules en herbe ou de ramification. De nombreuses variations dans une ou plusieurs de ces caractéristiques ont été observées dans les biofilms développés par les souches mutantes14,15. En outre, les souches de journaliste montrent des différences spatiales in situ dans l’expression des gènes16,9,13. Le degré surprenant de clarification obtenu avec cette approche relativement simple et peu coûteuse permet également de voir que de nombreux biofilms comprennent l’hyphae apique et les hyphes invasifs basiques s’étendant sur des distances millimétriques.
Dans ce protocole de visualisation, nous démontrons la fixation, l’étiquetage, la clarification et l’imagerie d’un biofilm C. albicans à l’aide d’un simple marqueur de mur cellulaire comme une tache. L’origine de la version actuelle du protocole est l’amélioration de la clarté que nous avons observée lorsque les biofilms fixés au formaldéhyde ont été infiltrés avec 97% de mthacrylate glycol (GMA), qui a ensuite été polymérisé pour intégrer le biofilm dans un plastique dur ayant un indice de réfraction modérément élevé (n – 1,49). Nous avons ensuite utilisé la microscopie conventionnelle de contraste de phase et une série de liquides de référence d’index réfractifs pour déterminer plus précisément le point d’inversion de contraste (transparence maximale) du biofilm(figure 3). Pour les biofilms de C. albicans, cela s’est produit près de 1,530 n, ce qui était étonnamment élevé étant donné qu’une structure dense de protéines comme la kératine capillaire n’est qu’un peu plus réfractive (1,54-1,55). Bien qu’il soit sur l’extrémité supérieure de la gamme optimale de la figure 3, nous avons adopté le salicylate méthyle (huile de wintergreen, n – 1.537) dans le protocole actuel parce qu’il a longtemps été utilisé comme agent de clarification pour la microscopie dans l’embryologie et l’histologie, il a une faible toxicité et une basse pression de vapeur, et il a donné d’excellents résultats dans nos essais utilisant des optiques d’immersion d’huile modérée-NA.
Quatre points devraient être faits ici:
(1) À quelques exceptions près, la situation idéale en microscopie est que l’indice réfractiv du spécimen doit être égal à l’indice réfractiv du fluide d’immersion de la lentille objective17,18,13. Pour les études d’imagerie tridimensionnelles (3D) où une mise au point profonde est nécessaire, c’est toujours important.
(2) Notre résultat expérimental pour une compensation optimale (n – 1.525-1.535) est légèrement supérieur aux huiles d’immersion standard (n – 1.515, 1.518) et viole donc le point (1), et introduit ainsi une source d’aberration sphérique lors de l’utilisation d’optiques standard d’immersion d’huile. Une solution à ce problème est l’utilisation d’un objectif conçu pour un indice d’immersion dans la gamme supérieure. En raison d’un regain d’intérêt pour l’imagerie des spécimens effacés, les objectifs spécialisés avec la correction nécessaire sont de plus en plus disponibles. L’autre solution consiste à ajuster l’indice du milieu de clarification à 1,515 ou 1,518 par l’ajout d’une petite quantité de butanol (n – 1,399) pour une performance optimale d’immersion d’huile, et d’accepter la clarté légèrement dégradée.
(3) La microscopie des biofilms intacts (et d’autres spécimens de cette échelle) nécessite une distance de travail importante pour tenir compte de l’épaisseur du spécimen. Il s’agit d’une considération pratique majeure. Une longue distance de travail limite l’optique à une ouverture numérique modérée (NA de 0,6 à 1,25), ce qui limite la résolution mais limite également la sévérité de l’aberration sphérique.
(4) L’indice réfractiv optimal pour la clarification peut être différent pour d’autres types de spécimens fixes. Les échantillons doivent être testés en conséquence à l’aide d’un contraste de phase et d’une série de liquides de référence réfractifs, comme le montre la figure 3.
Protocol
Representative Results
Discussion
Les progrès de la microscopie de fluorescence dans la section optique, la résolution, la vitesse, l’évitement ou la compensation de l’aberration, l’acquisition de multicanaux et dans la puissance de calcul ont provoqué une résurgence des spécimens intacts d’imagerie. Pour les spécimens fixes, les méthodes classiques et nouvelles de clarification et d’expansion ont eu un impact majeur19,20,21,22,23,24. Dans ce cas, nous avons appliqué une approche rapide et simple de jumelage d’index basée sur le solvant pour étudier la structure des biofilms fongiques qui sont fortement translucides à opaques.
Les protocoles précédents ont été testés avec une gamme de spécimens. Dans notre laboratoire Candida albicans biofilms sont le plus souvent cultivés sur des carrés de 14 mm coupés à partir d’une feuille de caoutchouc en silicone de qualité médicale (voir Tableau des matériaux). Ce substrat est utilisé parce que la croissance sur PDMS (poly-dimylsiloxane) immergé dans le milieu de la culture liquide a été établie comme un modèle in vitro important pour les infections associées aux implants médicaux, en particulier les cathéters d’englomement. Les cellules stressées qui initie la filamentation adhèrent rapidement aux surfaces nonpolaires telles que le PDMS. Dans la pratique, les carrés usagés qui ont été nettoyés et restilés dans un autoclave (cycle sec) donnent les biofilms les plus cohérents pour une souche particulière. Les biofilms sont également couramment cultivés sur des verres de couverture, dans des plats de culture de fond de verre de couverture, dans des plats bactériologiques standard de polystyrène de catégorie, et sur l’agar. Étant donné que les cellules C. albicans n’adhèrent pas bien au verre, les verres de couverture doivent être traités avec une lectine qui liera les polysaccharides de mur cellulaire. Nous appliquons 40 L de ConA ou WGA de 1 mg/mL ou de WGA dans de l’eau stérile sur chaque surface de coverlip. Après le séchage, les verres de couverture sont traités avec 40 L de glutaraldéhyde de 1% pendant 3 min pour traverser la protéine dans un film insoluble. Ils sont ensuite lavés avec de l’eau distillée stérile pour enlever la lectine fixative et soluble et séché à l’air. Si nécessaire, les verres ou plats traités sont restés dans une lampe UV germicide pendant 10 min.
L’épaisseur du spécimen affectera les périodes d’incubation requises dans les protocoles. La diffusion fixative dans un biofilm de 300 m nécessite plusieurs minutes pour équilibrer. Cette période augmente au fur et à mesure que le carré de l’épaisseur du spécimen est prolongée jusqu’à une heure ou plus pour des biofilms très épais ou des spécimens de blocs d’agar qui peuvent être d’une épaisseur de 2 à 3 mm. La période d’équilibre pour la coloration dépend également de l’épaisseur du spécimen tel que décrit pour la fixation et le lavage. Cependant, parce que les lectines diffusent plus lentement que les fixatifs à faible MW, en particulier dans un gel d’agar, la coloration devrait être prolongée pendant la nuit. La même chose devrait être faite pour le lavage de l’excès de tache.
Les taches de différents types peuvent être incorporées dans les protocoles. Nous utilisons une tache de mur cellulaire pour l’imagerie structurelle, le plus souvent Calcofluor White M2R (Fluor. Brightener #28) ou une lectine étiquetée teinture comme ConA-Alexafluor 594 ou WGA-Alexafluor 594. Une attention particulière doit être accordée à la vaillance de la protéine. Le tétramer ConA peut causer des liens croisés d’hyphes très flexibles dans la région apicale d’un biofilm. C’est moins évident avec le dimer WGA. Les spécificités canoniques de ces marqueurs sont Calcofluor pour la chitine, ConA pour les résidus de mannose, et WGA pour N-acétyl-D-glucosamine et résidus d’acide sialique.
Étant donné que le protocole d’échange de solvants est classé à partir de PBS ou d’eau bien que le méthanol en salicylate méthyle, les contenants de spécimens doivent être résistants au solvant. Le salicylate méthyle (MS) adoucira rapidement la plastique en polystyrène et adoucira lentement d’autres plastiques. Le protocole s’intensifie à l’utilisation du méthanol soigné peut être effectué dans la plastique, mais à ce moment-là dans le protocole, nous passons généralement à la norme de 20 mL flacons scintillation en verre avec des bouchons à vis résistants aux solvants. Les flacons sont pratiques pour les biofilms sur substrat carré de silicone, parce que les carrés peuvent être ramassés et transférés à l’aide de pincettes fines. En outre, une fiole peut être drainée et remplie avec le carré plat reposant sur la surface courbe intérieure de sorte que le biofilm ne contacte pas le verre. Le substrat doit être biofilm-up quand il est immergé dans la fiole verticale. Les flacons sont excellents pour le stockage à long terme des spécimens.
Dans le protocole de clarification, des étapes d’échange de solvants plus notées minimisent le risque de déformation des spécimens en raison d’effets de mélange de solvants. Pour plus de vitesse et de commodité dans le protocole de base, il y a quatre étapes : 1) étape 3.3, PBS à 50:50 PBS:methanol; 2) étapes 3.4 et 3.5, PBS:methanol au méthanol soigné, 3) étape 3.6, méthanol soigné à 50:50 méthanol:MS; et 4) les étapes 3.7 et 3.8, méthanol:MS à la SP soignée. Methanol fournit la miscibilité transitoire. Cependant, étant donné que l’eau et la SP sont presque immiscibles, il est essentiel que toute l’eau soit déplacée par le méthanol avant l’introduction de toute SP. De même, parce que le méthanol est très volatil, il est important de déplacer tout le méthanol par LA SP. l’évaporation du méthanol résiduel entraînera des variations d’index réfractives au sein du spécimen. Dans la séquence en quatre étapes, répéter les deuxième et quatrième étapes en ajoutant un autre changement de solvant soigné, ou même un troisième changement, est conseillé. Pour les spécimens particulièrement fragiles, des changements de solvants pourraient être formulés en plus petits pas.
Avec les spécimens de blocs d’agar, les étapes 3.4 et 3.5 (méthanol soigné) peuvent causer l’apparition de cristaux de sel dans l’agar en raison de l’insolubilité des sels résiduels de PBS dans le méthanol. Ceci peut être évité en utilisant de l’eau distillée (DW) dans la première étape mixte de solvant à la place de PBS pour diluer les sels pendant l’échange d’eau : méthanol. La séquence alternative d’échange de solvants pour les biofilms fixes se compose alors de ces étapes : 1) étape 3.3, transférer le spécimen de PBS en 50:50 DW:methanol (laisser plus de temps pour la diffusion par l’agar); 2) étape 3.4, transférer le spécimen de 50:50 DW:methanol dans le méthanol soigné (répéter 2x avec le méthanol comme dans l’étape 3.5); 3) étape 3.6, transférer le spécimen du méthanol à 50:50 méthanol:methyl salicylate; et 4) étape 3.7, transférer le spécimen de 50:50 méthanol:MS à la SEP soignée (répéter 2x avec la SP comme dans l’étape 3.8).
Parce que le salicylate méthyle adoucit rapidement la plastique en polystyrène, nous utilisons un plat anodisé en aluminium avec un fond en verre de couverture pour tenir le biofilm clarifié sur la scène d’un microscope inversé. Le verre de couverture est maintenu en place à l’aide de ciment optique de traitement UV (Norland Optical Adhesive #61, voir Tableau des matériaux). Pourvu que la SP soit enlevée à la fin de la journée en lavant le plat avec de l’isopropanol suivi de l’eau savonneuse et du rinçage, le verre de couverture cimenté servira pendant de nombreux mois.
La sélection objective des lentilles est d’une importance cruciale dans l’imagerie à grande échelle des spécimens clarifiés en raison de l’importance de minimiser l’aberration sphérique et la nécessité d’une distance de travail suffisante. Nous avons de l’expérience avec trois objectifs dans ces études. Dans la configuration inversée du microscope, nous utilisons une longue distance de travail, modérée huile objective d’ouverture numérique (NA) immergée sous le verre de couverture avec le biofilm immergé dans le salicylate de méthyle dans le plat au-dessus du verre de couverture. La plupart de nos travaux ont été effectués avec un objectif achromatique de la série Zeiss Universal, type 461708, 40x 0,85NA Oel 160/1.5, utilisé avec un adaptateur négatif de longueur focale de 160 mm pour la compatibilité nominale infini-conjuguée (IC). Cet objectif a été conçu à l’origine pour l’huile immergée visualisation à travers des diapositives de microscope de 1,5 mm avec 0,35 mm de distance de travail25. Lorsqu’il est utilisé avec un verre de couverture standard (0,17 mm), la distance de travail est beaucoup plus grande: 1,5 à 0,35-0,17 à 1,68 mm à 1 680 m. Nous utilisons également un nouvel objectif de multi-immersion Zeiss, type 420852, 25x 0.8NA LD LCI Plan-apochromat avec une distance de travail supérieure à 540 m, avec la correction d’immersion fixée sur le côté élevé de «l’huile». Cet objectif est très corrigé et produit une superbe image. Sur un stand de microscope droit, nous avons utilisé un nouvel objectif multi-immersion Nikon, type MRD71120, 10x 0.5NA CFI Plan-apochromat avec une distance de travail supérieure à 5.000 m (5 mm), également avec la correction d’immersion réglée sur le côté élevé de l’huile (n – 1.518). Bien que cet objectif ait un NA inférieur à celui des autres, il a l’avantage d’être directement immersible dans le salicylate méthyle.
Afin d’optimiser l’acquisition de données en termes de rapidité et de résolution, idéalement, les paramètres de microscope confocal devraient répondre à la densité d’échantillonnage transversal et axial Nyquist18. En utilisant des critères conventionnels, définissez le diamètre du sténopé confocal nominalement à 1 unité aérée. Dans les coordonnées agrandies,
dP (m) à 1,22 x grossissement x (longueur d’onde d’émission en m) / NA
L’échantillonnage transversal (espacement de pixels) ne doit pas dépasser (1/2) x limite de résolution de l’abbé. Dans les coordonnées de l’espace objet,
X, y (longueur d’onde d’émission en nm) / (4 NA)
L’échantillonnage axial (augmentation de la mise au point) ne doit pas dépasser la bande passante axial inverse,
Z (indice d’immersion) x (longueur d’onde d’émission en nm) / (NA2)
Le système optique confocal élargit la bande passante du microscope et aiguise à la fois la résolution transversale et axiale d’au moins 1/2.
Pour l’objectif 40x 0.85 NA que nous utilisons le plus souvent, voir le tableau 1 pour les résultats de ces formules pour une longueur d’onde d’émission de 600 nm (Alexa Fluor 594).
| Formule | x 1/2 | ensemble (typique) | |
| dP (m) | 34,5 m | – | 25 ou 50 m |
| x, y | 176 nm | 125 nm | 161 nm |
| z z | 1200 nm | 848 nm | 900 nm |
Tableau 1 : Diamètre du sténopé confocal, échantillonnage transversal et valeurs d’échantillonnage axial pour une longueur d’onde d’émission de 600 nm.
À l’aide d’un scanner confocal à disque tournant avec ces paramètres et d’un champ de balayage de 1 392 x 1 040 pixels, les données provenant de spécimens de biofilms peuvent être acquises avec une vitesse et une résolution raisonnables. Les piles d’images 3D monocolores typiques s’exécutent 0,35 à 1,55 Go.
Les médias de clarification largement utilisés couvrent une gamme d’indices réfractaires significative. Par l’éclairage de darkfield et l’inspection visuelle, nous avons constaté que les biofilms C. albicans fixes étaient les plus transparents au-dessus de n 1,5. Ceci a été affiné par microscopie de contraste de phase à n 1.530-1.535. Pour un certain nombre de raisons pratiques, nous utilisons le salicylate méthyle (n – 1.537) comme solvant final correspondant à l’index. Bien que l’échange de solvants apporte le risque de déformation de spécimen ou d’autres artefacts, les cellules dans les spécimens fixes et clarifiés ont des dimensions semblables de corps cellulaire, diamètre d’hypha, et dimensions de longueur interseptale comme spécimens vivants.
De nombreuses variantes du processus d’échange de solvants sont possibles (p. ex., à l’aide d’un solvant transitoire différent ou d’un solvant final différent). Le méthanol a été choisi pour sa grande polarité et sa diffusion rapide, mais il a été démontré que l’éthanol préservait mieux le rendement quantique des protéines fluorescentes rouges (DP)26 comme solvant transitoire. Le salicylate méthyle a été choisi pour son index, sa polarité modérée, sa faible pression de vapeur et sa compatibilité avec de nombreuses taches, colorants et protéines fluorescentes. Cependant, un solvant final avec un indice légèrement inférieur, ou un mélange de salicylate méthyle et un solvant d’index inférieur, tel que le butanol, peut mieux servir.
De façon inattendue, la capacité de voir à travers un biofilm révèle non seulement ses caractéristiques internes stratifiées, mais aide également à voir l’origine de structures étendues telles que de longues hyphes apiques non emmêlées et hyphes basiques envahissants sur certains substrats. La virulence opportuniste chez C. albicans dépend de sa polyvalence génétique (c.-à-d. le passage à la croissance hyphale, l’amélioration du substrat cellulaire et de l’adhérence cellulaire, la génération d’osmolytes pour le bourgeonnement cellulaire et l’allongement, et l’utilisation de nutriments alternatifs). L’extension hyphale permet l’évasion des cellules individuelles de C. albicans des cellules immunitaires phagocytiques mais est également essentielle pour l’invasion. L’adhérence biofilm et l’enchevêtrement hyphal semblent fournir l’ancrage de surface nécessaire pour que l’hyphae envahisse efficacement un substrat. Lorsque ce substrat est tissu hôte, une virulence accrue peut en résulter.
L’imagerie des biofilms intacts permet un grand nombre d’expériences informatives utilisant des souches de reporter pour l’expression des gènes, le substrat tissulaire modèle, et l’inclusion d’autres organismes tels que les bactéries trouvées dans les biofilms naturels. Même dans le cas le plus simple de l’imagerie purement structurelle avec une tache de mur cellulaire, phénotypes in situ sont révélés qui peuvent alors être quantifiés et génétiquement analysés.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Cette recherche a été soutenue en partie par les subventions des NIH R01 AI067703, R21 AI100270 et R21 AI135178 à A.P. Mitchell. Les auteurs sont reconnaissants à Greenfield ‘Kip’ Sluder d’avoir fourni l’objectif d’immersion d’huile longue distance utilisé dans ce travail, et à Daniel Shiwarski pour la microscopie confocienne avec immersion directe de salicylate méthyle.
Materials
| Biohazardous waste receptacle | |||
| Biosafety cabinet with germicidal UV lamp | |||
| Calcofluor White M2R (2.5 mg/mL in methanol) | |||
| Concanavalin A – Alexafluor-594 or other conjugate | |||
| Distilled water | DW | ||
| Distilled water, sterile | |||
| Ethanol, absolute | EtOH | ||
| Fetal bovine serum (FBS), sterile | |||
| Fixative waste bottle in secondary containment | |||
| Formaldehyde 20% in water, ampules | Electron Microscopy Sciences | ||
| Formaldehyde alternatives: paraformaldehyde powder, formalin 37% | Electron Microscopy Sciences | ||
| Fume hood | |||
| Glutaraldehyde 25% in water, ampules | Electron Microscopy Sciences | ||
| Incubator – 30 deg C, with rotary mixer (60 rpm) for culture tubes | |||
| Incubator – 37 deg C, with orbital mixer for culture plates | |||
| Isopropanol 70% | iPrOH 70% | ||
| Longwave (365 nm) UV lamp, 5Watt | Cole-Parmer Scientific | for curing NOA-61 cement | |
| Medical grade silicone sheet, 0.060" (1.52 mm) thick | Bentec Medical, Inc., http://bentecmed.com/ | Non-reinforced medical grade silicone sheeting | |
| Methanol 99.9% | MeOH | ||
| Methyl salicylate 99% | MS | ||
| Millipore Swinnex 13mm white silicone ring gaskets | Millipore Corp. | SX0001301 | |
| Norland UV-curing optical adhesive – type NOA-61 | Edmund Optics, Inc., https://www.edmundoptics.com | NOA-61 | |
| Orbital mixer, benchtop | |||
| Phosphate-buffered saline (PBS), sterile | |||
| Refractive index standard liquids, n=1.500 to 1.640 (29 liquids, 0.005 increment) | Cargille Laboratories, https://cargille.com | Series E | Cedar Grove, NJ 07009, USA |
| RPMI-1640 base medium, HEPES buffered, sterile | |||
| Scintillation vials, 20 mL – Wheaton, Urea cap PE cone cap liner | Fisher Scientific Co. | 03-341-25H | for specimen processing and storage |
| Solvent waste bottle in secondary containment | |||
| Spider medium with mannitol, sterile (1% Difco nutrient broth, 0.2% K2HPO4, 1% D-Mannitol) | |||
| Wheat germ agglutinin – Alexafluor-594 or other conjugate | |||
| Yeast-peptone-dextrose (YPD) agar plates, sterile (1% yeast extract, 2% Bacto peptone, 2% dextrose, 2% Bacto agar) | |||
| YPD medium, liquid, sterile (1% yeast extract, 2% Bacto peptone, 2% dextrose) |
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