JoVE Journal > Medicine
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Türkçe

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Medicine

Hepatik Tümör Hücreleri Bağlamında Doğal Öldürücü Hücre Aracılı Sitotoksisite ve GöçÖlçümü

Published: February 22, 2020
doi:
10.3791/60714
, , ,
1Department of Biochemistry and Molecular Genetics,University of Alabama at Birmingham

Summary

Kanser hücreleri tarafından doğal katil (NK) hücre aracılı eradikasyon kaçırma kanser inisiyasyonu ve ilerlemesi için önemlidir. Burada, hepatik tümör hücrelerine doğru NK hücre aracılı sitotoksisitesini değerlendirmek için radyoaktivite ye dayalı olmayan iki protokol siyoruz. Ayrıca, NK hücre geçişini çözümlemek için üçüncü bir protokol sunulur.

Abstract

Doğal öldürücü (NK) hücreleri doğuştan gelen bağışıklık sisteminin sitotoksik lenfosit popülasyonunun bir alt kümesidir ve patojen enfekte, malign ve stresli hücreleri temizleyerek ilk savunma hattı olarak katılırlar. NK hücrelerinin kanser hücrelerini yok etme yeteneği onları kanserle mücadelede önemli bir araç haline getirir. Birkaç yeni bağışıklık tabanlı tedaviler nk hücre aktivitesini artırmak ya da NK hücre aracılı eradikasyon kanser hücrelerinin duyarlılığını artırmak ya da dayanan kanser tedavisi için soruşturma altındadır. Ancak, bu terapötik yaklaşımları etkili bir şekilde geliştirmek için, NK hücre aracılı sitotoksisite ve göçü izlemek için uygun maliyetli in vitro tahlillere de ihtiyaç vardır. Burada, NK hücreli sitotoksisitenin kanser hücreleri (veya diğer hedef hücreler) üzerindeki etkisini güvenilir ve tekrarlanabilir bir şekilde izleyebilen iki in vitro protokol saklıyız. Bu protokoller radyoaktivite tabanlı değildir, kurulumu kolaydır ve yüksek iş itfalı tarama için ölçeklendirilebilir. Ayrıca, nk hücre göçünü nicel olarak izlemek için akış sitometritabanlı bir protokol sintometri tabanlı bir protokol de siniftometri ye sahip olan ve yüksek iş akışı taraması için ölçeklendirilebilen bir protokol sintometri sitometrisi sitometrisi sitometrisi sitometrisi sitometrisi sitometrisi sitometrisi s Topluca, bu üç protokol, hücrelerin işlevsiz hedef hücreleri ortadan kaldırmak için gerekli olan NK hücre aktivitesinin önemli yönlerini izlemek için kullanılabilir.

Introduction

İnsan vücudunun kendini tanımlama ve yabancı cisimleri yok etme yeteneği patojenlere ve malignitelere karşı insan hayatta kalmasının anahtarıdır1. İnsan bağışıklık yanıtı bu süreçte en önemli rolü oynar2,3,4. Temel özellikleri ve işlevlerine dayanarak, insan bağışıklık sistemi geniş iki ana fonksiyonel gruplar: adaptif bağışıklık sistemi ve doğuştan gelen bağışıklık sistemi sınıflandırılabilir. Adaptif bağışıklık sistemi genellikle belirli bir patojen özgü ve immünolojik hafızaya sahiptir ve, böylece, uzun ömürlü ve aynı patojen tarafından gelecekteki yeniden enfeksiyon a duyarlı5,6,7,8,9. Buna karşılık, doğuştan gelen bağışıklık hedef eradikasyon ve nispeten nonspesifik çok daha geniştir. Bu nedenle, tipik olarak, doğuştan gelen bağışıklık yanıtı immünolojik savunma nın ilk satırı olarak hizmet vermektedir10. Doğal öldürücü (NK) hücreler doğuştan gelen bağışıklık sistemine aittir ve toplam dolaşan lenfositlerin %10−15’ini temsil eder11. NK hücreleri iki ana mekanizma aracılığıyla hedef hücreleri ortadan kaldırmak. İlk olarak, ligandları aktive eden hücreleri ifade eden hedef hücrelere bağlanan NK hücreleri, membran bozucu protein perforini serbest düşürür ve eksozis yoluyla granzymleri serbest bırakabilir, bu da hedef hücrelerde apoptoza neden olur12,13,14,15. Ayrıca, Fasl ve tümör nekroz faktöre bağlı apoptoz indükleyen ligand (TRAIL) ifade NK hücreleri ölüm reseptörlerini ifade hedef hücreleri ile etkileşim (Fas / CD95), kaspasbağımlı apoptoz yol16. En önemlisi, NK hücreleri patojen enfekte veya malign hücreleri ortadan kaldırmak için antijen sunumu gibi ön stimülasyon gerektirmez; böylece, genellikle bir hazır-öldürmek durumunda17,18. Tümör gelişimini ve ilerlemesini engellemek ve kanser hücrelerini ortadan kaldırmak için, NK hücreleri tümör bölgesine göç etmeli ve tümör mikroortamında bir kez hedef hücreleri tanımlamalı ve saldırmalıdır.

Geçmişte, NK-hücre efektör fonksiyonları esas olarak degranulation ve sitotoksisite tahlilleri tarafından izlendi19,20,21. NK hücre sitotoksisitesi de 51krom salınımı sonucu22,23,24,25ile ölçülebilir. Ancak, bu test, bir gama sayacı ihtiyacı da dahil olmak üzere bazı özel gereksinimleri vardır ve radyoaktif maddelerin kullanımı ve bertaraf eğitim gerektirir ve kullanıcı için risk düzeyi teşkil radyoaktivite tabanlı. Bu nedenle, birkaç yeni radyoaktivite tabanlı olmayan tahliller geliştirilmiş ve NK hücre aktivitesi ni incelemek için istihdam edilmiştir.

Burada, nk hücre aracılı kanser hücresi eradikasyonu ölçmek için bu tür iki protokol, kolorimetrik laktik dehidrogenaz (LDH) ölçüm tabanlı NK hücre aracılı sitotoksisite analizi ve kalcein asetoksimethyl (AM) boyama tabanlı mikroskobik yöntem açıklayınız. Bu tahliller radyoizotopların kullanımını gerektirmez, basit, duyarlıdır ve NK hücre fonksiyonunu modüle eden faktörleri tekrarlanabilir şekilde tanımlar. Ayrıca, NK hücre göçündeki değişiklikleri izlemeden NK hücre işlevi tam olarak değerlendirilemediğinden, NK hücre göçünü izlemek için akış sitometrisine dayalı nicel bir yöntem de sitometri tabanlı bir yöntem sitometri sitülmetri sitülatif bir yöntem salıyoruz.

Protocol

1. NK Hücreleri ve Hepatik Tümör Hücreleri Için Kültür Ortamının Hazırlanması İnsan doğal öldürücü hücreleri (örneğin, NK92MI) ve insan karaciğer kanseri hücre hattı (örneğin, SK-HEP-1) kullanın. NK92MI insan NK hücreleri için aşağıdaki bileşenleri ribonükleozitler olmadan 500 mL minimum esansiyel orta Kartal alfa ve belirtilen son konsantrasyonlara deoksiribonükleozitler ekleyerek NK hücre kültür ortamı hazırlayın: 0.02 mM folik asit (100 mM folik asit 100 μL), 0.2 mM miyoinositol (200 mm myom myommyinmyin myom) 0,1 mM β-mercaptoetanol (3,5 μL 14,3 M β-mer-mercaptoetanol), 2 mM L-glutamin (5 mL 200 mM L-glutamin), %1 penisilin/streptomisin (5 mL 100x penisilin/streptomisin), 12,5% büyükbaş serum (FBS) ve .5 at serumu. 0,22 m steril filtrasyon ünitesi kullanarak sterilize edin ve 4 °C’de saklayın. Hepatik tümör hücre hattı SK-HEP-1 için% 10 FBS ve yüksek glukoz Dulbecco modifiye Eagle orta (DMEM) 2 mM L-glutamin içeren% 1penisilin / streptomisin ekleyerek kültür ortamı hazırlayın. 2. Kolorimetrik LDH Ölçüm tabanlı NK Hücre aracılı Sitotoksisite Analizi SK-HEP-1 hücrelerini 100 mm’lik hücre kültüründe Petri kabında %5 CO2’de 37 °C’de CO2 kuluçka makinesinde −80’e çıkarın. Tek hücreli bir süspansiyon oluşturulana kadar co2 inkübatörde %5 CO 2’de %5 CO2’de %0,25 tripsin-EDTA ile 1 mL 1 mL 1 x fosfat tamponlu salin (PBS) ile ilk yıkama hücreleri ile tek hücreli süspansiyon oluşturun.NOT: NK hücre aktivitesi, kanser hücrelerinde NK hücre aktive ligand ekspresyonundaki değişiklikler nedeniyle stresli kanser hücreleri tarafından indüklenebilir. Bu nedenle, sağlıklı ve alt-confluent kanser hücreleri doğru sonuçlar için kullanılmalıdır. NK hücre reseptörlerinin ve ligandlarının tripsinizasyona karşı hassas olabileceğini de belirtmek önemlidir26,27. Bu nedenle, tripsinizasyon protokolü dikkatle optimize edilmeli ve aşırı tripsinizasyonkaçınılmalıdır. Tripsinizasyondan sonra 15 mL steril konik santrifüj tüpe 160 x g’de 10 mL SK-HEP-1 kültür ortamı ve santrifüj ekleyin. Hücre peletini 5 mL 1x PBS ile yıkayın ve 5 mL kültür ortamında yeniden askıya alın. Buna paralel olarak, 15 mL steril santrifüj tüp içinde 3 dk için 160 x g NK92MI hücreleri santrifüj. Hücre peletini 5 mL 1x PBS ile yıkayın ve 5 mL NK92MI hücre kültürü ortamında yeniden askıya alın.NOT: NK92MI hücreleri NK hücre kültürü ortasında yetiştirilir ve 2.1 adımda açıklandığı gibi benzer şekilde elde edilir. SK-HEP-1 ve NK92MI hücrelerini hemositometre veya mevcut herhangi bir otomatik hücre sayacı kullanarak sayın. SK-HEP-1 hücreleri (hedef hücreler) (1 x 104/100 μL/well) ve NK92MI hücreleri (efektör hücreleri) (1 x 105/100 μL/well) oranını 1:10 hedef:efektör ve 96 kuyu plakasındaki üç aylık kuyularda tohum ekleyin. 96 kuyu plakasını 37 °C’de hava ve %5 CO2 atmosferinde 3 saat kuluçkaya yatırın. Kuluçkadan sonra, oda sıcaklığında 5 dk için 450 x g santrifüj plaka. Hücre peletini bozmadan, her kuyudan 100 μL supernatant toplayın ve yeni bir 96 kuyu plakası içinde bir kuyuya aktarın. LDH substrat 50 μL ekleyin, iyice karıştırın ve karanlıkta oda sıcaklığında 20 dakika boyunca plaka kuluçka. 50 μL stop çözeltisi ( dimetilformamid ve sodyum dodecyl sülfat pH 4.7) ekleyerek reaksiyonu durdurun. Plakanın emnesini hemen 490 nm ve 680 nm’de bir plaka okuyucu kullanarak ölçün. Emiciliği 490 nm’de emiciden 680 nm çıkarın. Yüzdeyi hesaplama (%) Aşağıdaki formülü kullanarak NK hücre sitotoksisitesi.LDH deneysel (efektör + hedef hücreleri) NK92MI hücreleri ve SK-HEP-1 hücrelerinin absorbe, LDH efektör hücreleri tek başına NK92MI hücrelerinin absorbe olduğunu, LDH spontan SK-HEP-1 hücrelerinin emici olduğunu ve LDH maksimal SK-HEP-1 emici olduğunu lysis tamponlu hücreler.NOT: Serum girişimlerini azaltmak için, her zaman aşağıdaki kontrolleri kullanın: tek başına hedef hücreler (SK-HEP-1), tek başına efektör hücreler (NK92MI), tam bir lysis kontrolü olarak lysis tamponlu hedef hücreler, hedef hücre ortamı, NK92MI orta, ayrıca hedef hücre orta ve 1:1 oranında NK92MI orta. 3. NK Hücre aracılı Sitotoksisiteyi Ölçmek için Calcein Boyama Tabanlı Mikroskobik Yöntem Kültür SK-HEP-1 hücreleri −80’e kadar biraraya geldi. 5 mL 1x PBS ile ilk yıkama hücreleri ve %0,25 tripsin-EDTA 1 mL ile kuluçka ile tek hücreli süspansiyon oluşturun. Santrifüj SK-HEP-1 hücreleri 1 mL steril santrifüj tüpünde 160 x g 3 dk. 3 mL serumsuz DMEM peletini yeniden askıya alın. SK-HEP-1 hücrelerine 1,5 μL calcein çözeltisi (10 mM) ekleyin ve oda sıcaklığında 30 dakika kuluçkaya yatırın. 15 mL steril santrifüj tüpte 3 dk için 160 x g’da santrifüj calcein etiketli SK-HEP-1 hücreleri. Fazla calcein boyasını gidermek için hücreleri 5 mL 1x PBS ile iki kez yıkayın. Buna paralel olarak, 15 mL steril santrifüj tüp 3 dakika için 160 x g centrifuge NK92MI hücreleri. Hücre peletini 5 mL 1x PBS ile bir kez yıkayın ve 5 mL NK92MI hücre li ortasında yeniden askıya alın. Hemositometre veya otomatik hücre sayacı kullanarak calcein etiketli SK-HEP-1 hücreleri ve NK92MI hücrelerini sayın. SK-HEP-1 hücrelerini kültür ortamında 1 x 105 hücre/mL ve NK92MI hücrelerini NK hücreli ortamda 1 x 106 hücre/mL’de yeniden askıya alın. Plaka kalcein etiketli SK-HEP-1 hücreleri (hedef hücreler) (1 x 104/100 μL/well) NK92MI hücreleri (efektör hücreleri) (1 x 105/100 μL/well) (1:10 hedef:efektör oranı) 96 kuyu plakasındaki çetliskuyularda. 96 kuyu plakasını 37 °C’de hava ve %5 CO2 atmosferinde 4 saat kuluçkaya yatırın. Kuluçkadan sonra, 10x büyütmede floresan mikroskobu kullanarak calcein etiketli hücrelerin floresan görüntülerini yakalayın. Her tedavi koşulu için her çoğaltma en az 10 farklı alanları yakalayın. NK92MI hücreleri ile veya olmadan kuluçkaya yatan calcein pozitif etiketli hedef hücreleri her çoğaltmak ve saymak için rastgele 10 görüntü seçin. Aşağıdaki formülü kullanarak % sitotoksisiteyi hesaplayın.NOT: Kontroller olarak, NK92MI hücreleri ve tamamen lysis kontrolü olarak hedef hücreleri tamamen lysed olmadan hedef hücreleri kullanın. Tam bir lisiçin hücreleri %0,5 Triton X-100 ile 1 saat (20 μL%5 Triton X-100’ün 0 μL’si kültür medyasında) inkübedin. 4. NK Hücre Göçü Tsası 15 mL steril santrifüj tüp içinde 3 dakika için 160 x g NK92MI hücreleri ve santrifüj hücreleri büyümek. Hücre peletini 5 mL 1x PBS ile iki kez yıkayın ve serumsuz NK92MI hücre ortamının 3 mL’inde hücreleri yeniden askıya alın. Hemositometre veya otomatik hücre sayacı kullanarak NK92MI hücrelerini sayın. Plaka NK92MI hücreleri (2.5 x 105 hücre/100 μL/iyi) transwell geçirgen haznesinin üst bölmesinde (6,5 mm çapında kesici uç ve 5 m gözenek boyutu). Alt odada NK hücre kemoattractant özellikleri (örneğin, şartlı orta, kemokinler, sitokinler) için test edilecek serum içermeyen orta içeren 0,6 mL ekleyin.NOT: Şartlı ortam hazırlanırken, göç tahmınındaki serum proteinlerinin girişimini ortadan kaldırmak için serum eklenmeden azaltılmış serum lu ortam kullanın. 24 iyi geçirilebilir odacıkları 37 °C’de 4 saat kuluçkaya yatırın. 4 saat sonra, non-yapışık ve alt odasından nk92MI hücreleri göç ve daha fazla analiz için floresan aktive hücre sıralama (FACS) tüpleri aktarın.NOT: Kültür süresi hedef hücrelerin türüne ve hedef hücreler tarafından üretilen kemokinlerin miktarına ve kinetik durumuna bağlı olarak değişebilir. Bu nedenle, bu süre ampirik her hücre tipi, kemokin ve deney için belirlenmelidir. Göç eden NK hücreleri içeren her tüpe 50°L hacimdeki akış sitometrisi için önceden belirlenmiş sayıda sayma boncukekleyin. Otomatik FACS tabanlı hücre sayma yeteneğine sahip herhangi bir akış sitometre kullanarak 300 μL / iyi hücre süspansiyon hacmini değerlendirin.NOT: Deneysel değişkenliği en aza indirmek için sürekli sayıda boncuk kullanıldığından emin olmak için, her kullanımdan önce akış sitometrisi için sayma boncuklarını iyice karıştırın veya karıştırın. Ters pipetleme, doğruluğu korumak için sayım boncukları ile önerilir. FACS çözümleme kontrolleri olarak akış sitometrisi için yalnızca NK hücreleri ve sayma boncukları kullanın. Yazarlar en az 10.000 boncuk + NK hücreleri kombine, iyi çalıştı bir miktar okumanızı öneririz. Ancak, bu sayı deneysel koşullara bağlı olarak değişebilir. Bu nedenle, boncuk + NK hücrelerinin birleştirilmiş sayısı deneysel her tür için ampirik olarak belirlenmelidir. Ayrıca, istatistiksel olarak anlamlı sonuçlar elde etmek ve farklı hücre sayıları arasındaki değişkenliği hesaba katmak için biyolojik triplicates kullanarak deneyler yapmak önemlidir. Bu formülü kullanarak geçirilen NK92MI hücrelerinin mutlak sayısını hesaplayın:nerede A = hücre sayısı, B = boncuk sayısı, C = lot un boncuk sayısı (akış sitometrisi/50 μL için sayma boncuk sayısı; bu örnekte 49.500) ve D = örnek hacmi (μL).NOT: Facs analizinde 300 μL numune hacmi (taşınan hücreler) akış sitometrisi için 50 μL sayma boncukları kullanılırsa, göç eden hücrelerin mutlak sayısı = 1.700 hücre /3.300 boncuk olayı x 49.500 boncuk/300 μL = 84.975 hücre/μL. Örnek seyreltilmişse veya farklı bir FACS sayma boncuk hacmi kullanılıyorsa hesaplama düzeltilmelidir.

Representative Results

NK hücre sitotoksisite tahlilleri ve NK hücre göçü tahlilleri model sistem olarak SK-HEP-1 hepatik tümör hücre hattı kullanılarak yapıldı. LDH analizini kullanarak NK hücre sitotoksisitesini ölçmek için, nonspesifik (NS) shRNA veya aktive transkripsiyon faktör 4(ATF4)hedefleyen shRNA’yı ifade eden SK-HEP-1 hücreleri, 96 iyi plakalı NK92MI hücreleri ile 3 saat(Şekil 1A)kuluçkaya yatırıldı. ATF4 daha önce ligand ULBP128aktive yükselterek NK hücre sitotoksisitesi düzenlemek için gösterilmiştir. NK hücre aracılı hedef hücre öldürme ile ilişkili LDH aktivitesi kolimetrik olarak ölçüldü ve yüzde sitotoksisite protokol 1’de açıklanan formül kullanılarak hesaplandı. ATF4 knockdown önemli ölçüde NK hücre aracılı sitotoksisite NK hücreleri NS shRNA ifade ile karşılaştırıldığında azaltılmış(Şekil 1B-D). Ayrıca kalcein boyama tabanlı bir test kullanarak NK hücre sitotoksisitesi ölçüldü. Bu amaçla, NS shRNA veya ATF4hedefleyen shRNA’ları ifade eden SK-HEP-1 hücreleri calcein ile etiketlenmiş ve Şekil 2A’dagösterildiği gibi 4 saat boyunca 96 kuyu plakasında NK92MI hücreleri ile kuluçkaya yatırılmıştır. Kuluçkadan sonra, kalsein AM-pozitif hücrelerin görüntüleri FITC/GFP filtresi kullanılarak floresan mikroskopisi ile yakalandı. NK hücreleri tarafından öldürülen hücreler artık kalsein boyasını tutmadıkları için bu yaklaşımla algılanmaz. Şekil 2B,C’degösterildiği gibi, NK92MI hücreleri ile birlikte nk92MI hücreleri ile nk92MI hücreleri olmadan yetiştirilen kalsin AM-pozitif SK-HEP-1 hücrelerinin sayısı azalır. Ancak, beklendiği gibi, SHRNA ile ATF4 nakavt SK-HEP-1 hücrelerinin NK hücre aracılı öldürme azaltılmış, kalcein AM-pozitif hücrelerin daha fazla sayıda gözlenen(Şekil 2B,C). Bu nedenle, hem LDH tabanlı ve calcein tahlilleri tutarlı sonuçlar gösterdi ve ATF4 knockdown NK aracılı kanser hücresi sitotoksisite azaltır doğruladı. Bu tahlillerden biri NK hücre aracılı sitotoksisiteyi değerlendirmek için yeterlidir; ancak, sonuçlara olan güveni ve katılığı artırmak için her iki yöntemi de kullanmanızı öneririz. Ayrıca 24 iyi NK hücre göç test sonuçlarını salıyoruz. Üst haznede serumsuz NK92MI ortamda NK92MI hücreleri yeniden askıya alındı ve alt geçirgen haznesine kemoin, CC motifi, ligand 2 (CCL2) eklendi. NK hücre geçişi bölüm 3’te açıklandığı gibi tüst edilmiştir (Şekil 3A). Göç eden NK92MI hücrelerinin sayısı akış sitometrisi için sayma boncukları eklenerek ölçüldü ve ardından FACS analizi yapıldı. Şekil 3B-C’degösterildiği gibi, kontrol ortamına göre CCL2 içeren ortama doğru göç eden NK92MI hücrelerinin sayısında önemli bir artış vardı. Şekil 1: Kolorimetrik LDH aktivite tabanlı NK hücre aracılı sitotoksisite analizi. (A) Kolorimetrik LDH aktivite tabanlı NK hücre sitotoksisite testinin anahtar adımlarını gösteren şema. (B,C) ATF4 ekspresyonu SK-HEP-1 hücrelerinde nonspesifik (NS) shRNA veya ATF4’ü hedefleyen shRNA’ları kantitatif RT-PCR ve batı lekeleme ile ifade eden analiz edildi. (B) NS shRNA veya ATF4 shRNA’ları ifade eden SK-HEP-1 hücrelerinde normale döndükten sonra göreli ATF4 mRNA düzeyi ACTINB düzeyine göre gösterilir. (C) NS shRNA veya ATF4 shRNA’ları ifade eden SK-HEP-1 hücrelerinde ATF4 ve ACTINB protein düzeyleri. (D) NK hücre aracılı sitotoksisite LDH yöntemi ile NS shRNA veya ATF4 shRNA’ları ifade eden SK-HEP-1 hücrelerinde analiz edildi. Yüzde (%) NK hücre aracılı sitotoksisite gösterilir. Veriler ortalama ± SEM olarak sunulur; ns, önemli değil; **p < 0.01, ***p < 0.001. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 2: NK hücre aracılı sitotoksisiteyi ölçmek için Calcein boyama tabanlı mikroskobik yöntem. (A) NK hücre aracılı sitotoksisiteyi ölçmek için kalsein boyama tabanlı mikroskobik yöntemin temel adımlarını gösteren şema. (B) NK hücre aracılı sitotoksisite Calcein yöntemi kullanılarak NS shRNA veya ATF4 shRNA’ları ifade eden SK-HEP-1 hücrelerinde analiz edildi. Temsili görüntüler gösterilir. Ölçek çubuğu = 200 μm. (C) B. **p < 0.01 panelinde sunulan deney için calcein pozitif hücrelerin yüzdesi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 3: FACS tabanlı nicel NK hücre geçiş teşhebi. (A) FACS tabanlı NK hücre geçiş testinin anahtar adımlarını gösteren şema. (B,C) NK hücre göç titreti, 24 kuyu plakasının alt haznesine 50 ng CCL2 ekledikten sonra yapılmıştır. (B) Kontrol için temsili NK hücre geçişi nokta çizimleri veya CCL2-işlenmiş kültür ortamı gösterilir. (C) NK hücre geçiş verileri (ortalama ± SEM) B. ***p < 0.001 panelinde gösterilen deney için sunulur. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Discussion

Burada açıklanan sitotoksisite ve göç yöntemleri, malign tümörlerde nk hücre sitotoksisitesini ve NK hücre aracılı immün kaçırma mekanizmalarını değerlendirmek ve NK hücre aktivitesini/işlevini artıracak terapötik ajanları belirlemek için kullanılabilir. Protokoller basit, hassas, tekrarlanabilir ve klasik radyoaktivite tabanlı 51krom salınımı testine tercih edilen alternatiflerdir. Protokoller, araştırmacıların güvenilir sonuçlara ulaşmasını sağlayarak kolayca yorumlanması kolay basit kolorimetrik, mikroskobik veya FACS tabanlı okumalarla çoğu laboratuvarda kullanıma kolayca uyarlanabilecek şekilde tasarlanmıştır. Tüm yüksek iş yapımı tarama tabanlı yaklaşımlar için ölçeklenebilir. Protokoller tek bir hepatik tümör hücre hattı bağlamında sunulsa da, diğer kanser hücresi tiplerine ve/veya diğer kanser dışı hedef hücrelere kolayca adapte edilebilir.

Sunulan tüm yöntemler sağlam ve tekrarlanabilir ken, deneysel ler arası varyasyon kanser hücreleri ve NK hücrelerinin farklı gruplar ile oluşabilir. Sonuçların deneylerin sonuçlarını doğru bir şekilde desteklemesini sağlamak için, biyolojik triplicates kullanarak deneyi en az iki kez tekrarlamaları tavsiye edilir.

Bu yöntemin bir sınırlama NK92MI hücrelerinin büyüme hızı yavaş olabilir. Bu nedenle, 50 veya daha fazla örnekiçeren deneylerde, gecikmeleri önlemek için önceden yeterli sayıda NK92MI yetiştirilmelidir. Ayrıca, sahte ve tekraredilemez sonuçlardan kaçınmak için protokollerde açıklanan tüm denetimlerin uygulanması gerekir. NK sitotoksisite tsay başka bir sınırlama kanser hücresi oranı NK yanı sıra kuluçka süresi, her hedef hücre için optimize edilmelidir. Örneğin, kanser hücrelerinin nk hücrelerine (1:5, 1:10, 1:20, 1:40 ve 1:80) çeşitli oranlarda hepatik kanser hücre hatları yanı sıra birden fazla kuluçka süreleri (2, 3, 4, 5 ve 6 saat) için test ettik. Sonuçlarımıza dayanarak kanser hücrelerinin 1:10 ve 1:20 oranlarıyla NK hücrelerine ve kuluçka ya da 3 saat boyunca inkübasyon ile en tutarlı sonuçları gözlemledik.

Buna ek olarak, katı tümörlerden elde edilen kanser hücreleri kültür plakasının yüzeyine bağlanır ve büyürken, NK hücreleri süspansiyon içinde büyür. Kuluçka süresi 3 saatten uzunsa, deneyler ve biyolojik kopyalar arasında tutarlılığı ve tekrarlanabilirliği artıracak ultralow eki 96 kuyu plakası kullanılması tavsiye edilir. NK hücre kaynaklı sitotoksisite tahlillerinin periferik kan mononükleer hücrelerinden (PBMC) izole edilen primer NK hücreleri kullanılarak da yapılabildiği unutulmamalıdır. Ancak, bu tür deneyler ile çeşitli sınırlamalar vardır. İlk olarak, bu deneyler NK92MI hücrelerinde olduğu kadar kolay ölçeklendirilemez. İkinci olarak, PMBC’lerden izole edilen NK hücrelerinin toplu-toplu aktivitesi, sonuçların tekrarlanabilirliği ve yorumlanması açısından sorunlu olabilir. Benzer şekilde, literatürde diğer insan NK hücre çizgileri açıklanmıştır ve NKL hücreleri29dahil olmak üzere bu tür deneylerde kullanılabilir; Ancak, NK-92MI hücrelerinin aksine, NKL hücreleri IL-2’ye bağlıdır ve ticari olarak kullanılamaz.

Açıklanan kalcein deneyleri göz önüne alındığında, bu calcein hücre ölümünden sonra apoptotik organları kalır dikkat etmek önemlidir30. Bu nedenle, kalsein boyama kantitasyonu dikkatle yapılmalıdır, NK sitotoksisite bir küçümsme yol açabilir gibi.

NK hücre aracılı sitotoksisiteye benzer şekilde, NK hücre göçünün sitokinler ve diğer kemotoliler tarafından modülasyonu NK hücre fonksiyonunun düzenlenmesinde önemli bir rol oynar. Burada açıklanan NK hücre göçü, kemoin veya kemoattractant gibi bir uyarıcı bağlamında NK hücre göçünü değerlendirmek için basit bir platform sağlar. Bu tetkik, NK hücre geçişini teşvik eden veya bunlara müdahale eden aracıları değerlendirmek için kullanılabilir – böylece NK hücre geçişinin arttırıcılarını ve baskılayıcılarını tanımlar. Bu yöntem aynı zamanda nk hücre göç düzenleyici kapasitesini genetik/epigenetik değişiklikler (upregulation or downregulation) veya ilaç tedavisi nedeniyle ortaya çıkan bir sonucu olarak incelemek için yararlı olabilir.

NK hücre geçişini doğru bir şekilde ölçmek için izlenmesi gereken birkaç kritik adım vardır. Koşullu ortam kullanılarak yapılan tüm deneylerde, doğru ölçümler elde etmek için eşdeğer koşullu ortamın hem kontrol hem de tedavi koşullarından kullanılması önemlidir. Kuluçka süresi saf kemoattractants ve klimalı orta ile değişir. Son olarak, transwell göç tahlilleri iyi kurulmuş ve NK hücre göç değerlendirmek için mükemmel bir yöntem olarak kabul edilir; ancak, tahlillerde kullanılan homojen monokültürler, tümör mikroçevresini daha doğru bir şekilde taklit edebilecek dokuların ve hatta 3D kültürlerin karmaşık fizyolojilerinden yoksundur.

Bu nedenle, bu makalede sunulan NK hücre sitotoksisite tahlilleri ve NK göç tahlillerinde bazı sınırlamalar olmasına rağmen, bu tahliller çok çeşitli immünolojik çalışmalar için geçerlidir ve böylece NK hücresini değerlendirmek için önemli ve güvenilir yöntemler sağlar fonksiyonu ve NK hücre modülatör immün terapötik.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

R01CA195077-01A1 (NW), R01CA200919-01 (NW) ve 1R01 CA218008-01A1 (NW) Ulusal Sağlık Enstitüleri’nden gelen bağışları minnetle kabul ediyoruz. Ayrıca Savunma Bakanlığı finansman W81XWH1910480 ve W81XWH-18-1-0069 NW için kabul ediyoruz.

Materials

Absolute counting beads Thermo Fisher Scientific C36950
Alpha-MEM Sigma-Aldrich M4256
Amicon ultra Centrifugal filters Millipore UFC900324
Calcein AM dye Sigma-Aldrich 17783
DMEM Gibco 11965-092
Fetal Bovine Serum Gibco 26140079
Folic Acid Sigma-Aldrich F8758
Horse Serum Gibco 16050114
L-Glutamine (200 mM) Gibco 2530081
LDH cytotoxic assay Kit Thermo Fisher Scientific 88953
myo-Inositol Sigma-Aldrich I5125
NK92MI cells ATCC CRL-2408
Opti-MEM Gibco 31985070
Phosphate Buffer Saline (PBS) Sigma-Aldrich P4417
SKHEP-1 Cells ATCC HTB-52
Transwell permeable chambers Costar 3241
Trypsin EDTA solution Gibco 25200056
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Chiossone, L., Dumas, P. Y., Vienne, M., Vivier, E. Natural killer cells and other innate lymphoid cells in cancer. Nature Reviews Immunology. 18 (11), 671-688 (2018).
  2. Borghaei, H., Smith, M. R., Campbell, K. S. Immunotherapy of cancer. European Journal of Pharmacology. 625 (1-3), 41-54 (2009).
  3. Kalbasi, A., Ribas, A. Tumour-intrinsic resistance to immune checkpoint blockade. Nature Reviews Immunology. , (2019).
  4. Zhang, Q., Cao, X. Epigenetic regulation of the innate immune response to infection. Nature Reviews Immunology. 19 (7), 417-432 (2019).
  5. Janeway, C. A. The immune system evolved to discriminate infectious nonself from noninfectious self. Immunol Today. 13 (1), 11-16 (1992).
  6. Natoli, G., Ostuni, R. Adaptation and memory in immune responses. Nature Immunology. 20 (7), 783-792 (2019).
  7. Cooper, M. D., Alder, M. N. The evolution of adaptive immune systems. Cell. 124 (4), 815-822 (2006).
  8. Riera Romo, M., Perez-Martinez, D., Castillo Ferrer, C. Innate immunity in vertebrates: an overview. Immunology. 148 (2), 125-139 (2016).
  9. Sonnenberg, G. F., Hepworth, M. R. Functional interactions between innate lymphoid cells and adaptive immunity. Nature Reviews Immunology. 19 (10), 599-613 (2019).
  10. Vivier, E., et al. Innate or adaptive immunity? The example of natural killer cells. Science. 331 (6013), 44-49 (2011).
  11. Shi, F. D., Ljunggren, H. G., La Cava, A., Van Kaer, L. Organ-specific features of natural killer cells. Nature Reviews Immunology. 11 (10), 658-671 (2011).
  12. Trapani, J. A., Davis, J., Sutton, V. R., Smyth, M. J. Proapoptotic functions of cytotoxic lymphocyte granule constituents in vitro and in vivo. Current Opinion in Immunology. 12 (3), 323-329 (2000).
  13. Krzewski, K., Strominger, J. L. The killer’s kiss: the many functions of NK cell immunological synapses. Current Opinion in Cell Biology. 20 (5), 597-605 (2008).
  14. Berke, G. The binding and lysis of target cells by cytotoxic lymphocytes: molecular and cellular aspects. Annual Review of Immunology. 12, 735-773 (1994).
  15. Abel, A. M., Yang, C., Thakar, M. S., Malarkannan, S. Natural Killer Cells: Development, Maturation, and Clinical Utilization. Frontiers in Immunology. 9, 1869 (2018).
  16. Zamai, L., et al. Natural killer (NK) cell-mediated cytotoxicity: differential use of TRAIL and Fas ligand by immature and mature primary human NK cells. Journal of Experimental Medicine. 188 (12), 2375-2380 (1998).
  17. Marcus, A., et al. Recognition of tumors by the innate immune system and natural killer cells. Advances in Immunology. 122, 91-128 (2014).
  18. Vesely, M. D., Kershaw, M. H., Schreiber, R. D., Smyth, M. J. Natural innate and adaptive immunity to cancer. Annual Review of Immunology. 29, 235-271 (2011).
  19. Alter, G., Malenfant, J. M., Altfeld, M. CD107a as a functional marker for the identification of natural killer cell activity. Journal of Immunological Methods. 294 (1-2), 15-22 (2004).
  20. Bryceson, Y. T., et al. A prospective evaluation of degranulation assays in the rapid diagnosis of familial hemophagocytic syndromes. Blood. 119 (12), 2754-2763 (2012).
  21. Shabrish, S., Gupta, M., Madkaikar, M. A Modified NK Cell Degranulation Assay Applicable for Routine Evaluation of NK Cell Function. Journal of Immunology Research. 2016, 3769590 (2016).
  22. Pietra, G., et al. Melanoma cells inhibit natural killer cell function by modulating the expression of activating receptors and cytolytic activity. Cancer Research. 72 (6), 1407-1415 (2012).
  23. Fehniger, T. A., et al. Potential mechanisms of human natural killer cell expansion in vivo during low-dose IL-2 therapy. Journal of Clinical Investigation. 106 (1), 117-124 (2000).
  24. Brunner, K. T., Mauel, J., Cerottini, J. C., Chapuis, B. Quantitative assay of the lytic action of immune lymphoid cells on 51-Cr-labelled allogeneic target cells in vitro; inhibition by isoantibody and by drugs. Immunology. 14 (2), 181-196 (1968).
  25. Roder, J. C., et al. A new immunodeficiency disorder in humans involving NK cells. Nature. 284 (5756), 553-555 (1980).
  26. Byrd, A., Hoffmann, S. C., Jarahian, M., Momburg, F., Watzl, C. Expression analysis of the ligands for the Natural Killer cell receptors NKp30 and NKp44. PLoS One. 2 (12), e1339 (2007).
  27. Nitahara, A., et al. NKG2D ligation without T cell receptor engagement triggers both cytotoxicity and cytokine production in dendritic epidermal T cells. Journal of Investigative Dermatology. 126 (5), 1052-1058 (2006).
  28. Gowen, B. G., et al. A forward genetic screen reveals novel independent regulators of ULBP1, an activating ligand for natural killer cells. Elife. 4, e08474 (2015).
  29. Robertson, M. J., et al. Characterization of a cell line, NKL, derived from an aggressive human natural killer cell leukemia. Experimental Hematology. 24 (3), 406-415 (1996).
  30. Somanchi, S. S., McCulley, K. J., Somanchi, A., Chan, L. L., Lee, D. A. A Novel Method for Assessment of Natural Killer Cell Cytotoxicity Using Image Cytometry. PLoS One. 10 (10), e0141074 (2015).

Tags

NK Cell FunctionNK Cell-mediated CytotoxicityNK Cell MigrationTumor MicroenvironmentLDH AssayCalcein AM AssayHuman Liver Cancer CellsCell CultureCentrifugation96-well PlateAbsorbance MeasurementCytotoxicity Calculation

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Chava, S., Bugide, S., Gupta, R., Wajapeyee, N. Measurement of Natural Killer Cell-Mediated Cytotoxicity and Migration in the Context of Hepatic Tumor Cells. J. Vis. Exp. (156), e60714, doi:10.3791/60714 (2020).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image