JoVE Journal > Medicine
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
עברית

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Medicine

מדידה של הרוצח הטבעי Cell-בתיווך ציטורעילות והגירה בהקשר של תאים סרטניים בכבד

Published: February 22, 2020
doi:
10.3791/60714
, , ,
1Department of Biochemistry and Molecular Genetics,University of Alabama at Birmingham

Summary

התחמקות של הרוצח הטבעי (NK) תא מתווכת מיגור על ידי תאים סרטניים חשוב לחניכה והתקדמות סרטן. כאן, אנו מציגים שני פרוטוקולים שאינם מבוססי רדיואקטיביות כדי להעריך את הרעילות של התאים NK בתיווך לקראת תאי גידול בכבד. בנוסף, פרוטוקול שלישי מוצג לניתוח העברת תאים של NK.

Abstract

הרוצח הטבעי (NK) תאים הם תת-קבוצה של אוכלוסיית לימפוציטים ציטוטוקסיים של המערכת החיסונית מולדת ולהשתתף כשורה הראשונה של ההגנה על ידי ניקוי הפתוגן-נגוע, ממאיר, והדגיש תאים. היכולת של תאים NK לבער תאים סרטניים הופך אותם כלי חשוב במאבק נגד סרטן. מספר טיפולים חדשים המבוססים על החיסון נמצאים תחת חקירה לטיפול בסרטן אשר להסתמך על שיפור פעילות התא NK או להגדיל את הרגישות של תאים סרטניים כדי NK תא בתיווך מיגור. עם זאת, כדי לפתח ביעילות את הגישות הטיפוליות הללו, חסכוני בתחום מחוץ לתחום, שאומר לנטר את הרעילות וההגירה של התאים הדרושים. כאן, אנו מציגים שניים בפרוטוקולים מחוץ למבחנה שיכולים באופן אמין ולהציג באופן מהימן את ההשפעה של הרעלת תאים של NK-cell על תאים סרטניים (או תאי יעד אחרים). פרוטוקולים אלה הם לא מבוססי-רדיואקטיביות, פשוט להגדיר, וניתן לשנות את הגודל להקרנה בתפוקה גבוהה. כמו כן אנו מציגים פרוטוקול cy, מבוסס-הזרם המבוסס על מוניטור הגירה של התא NK, אשר ניתן גם לשנות את ההקרנה עבור הקרנת תפוקה גבוהה. באופן קולקטיבי, שלושת הפרוטוקולים האלה יכולים לשמש כדי לנטר היבטים מרכזיים של פעילות תא NK הנחוצים ליכולת התאים למגר את תאי היעד הלקוי.

Introduction

היכולת של גוף האדם לזהות לא-עצמית ולמגר חפצים זרים היא המפתח להישרדות האדם מפני פתוגנים וממאירות1. התגובה החיסונית האנושית ממלאת את התפקיד החשוב ביותר בתהליך זה2,3,4. מבוסס על מאפיינים ופונקציות מפתח, מערכת החיסון האנושית ניתן לסווג באופן נרחב לשתי קבוצות פונקציונלי העיקריים: המערכת החיסונית אדפטיבית המערכת החיסונית מולדת. מערכת החיסון האדפטיבית היא בדרך כלל ספציפית לפתוגן נתון ויש לו זיכרון חיסוני, ולכן, הוא לאורך זמן ומגיב לזיהום מחדש בעתיד על ידי הפתוגן אותו5,6,7,8,9. לעומת זאת, החסינות המולדת היא רחבה הרבה יותר בחיסול היעד שלו ובאופן יחסי לא ספציפי. לכן, בדרך כלל, התגובה החיסונית מולדת משמש כשורה הראשונה של ההגנה החיסונית10. הרוצח הטבעי (NK) תאים שייכים למערכת החיסונית מולדת ומייצגים 10 על 15% של לימפוציטים הכולל במחזור11. תאים NK לבער את תאי היעד באמצעות שני מנגנונים עיקריים. ראשון, על הכריכה לתאי היעד ביטוי הפעלת ליגנדס, התאים NK לשחרר את הממברנה משבש החלבון בהפרעה וסרין פרוטאז granzymes באמצעות exסוציטוזה, אשר במשותף לגרום אפופטוזיס בתאי היעד12,13,14,15. בנוסף, התאים NK להביע FasL ו נמק בגידולים גורם הקשורים אפופטוזיס-גרימת (שביל) אינטראקציה עם תאים היעד להביע קולטני מוות (CD95), המוביל caspase תלוי ואפופטוזיס16. החשוב ביותר, התאים NK לא דורשים prestimulation, כגון מצגת אנטיגן, כדי לבער הפתוגן-נגוע או תאים ממאירים; לכן, הם בדרך כלל במצב מוכן להרוג17,18. כדי לעכב את התפתחות הגידול התקדמות ולבער את התאים הסרטניים, התאים NK חייבים לעבור לאתר הגידול, פעם אחת בסביבת מיקרו הגידול, לזהות ולתקוף את תאי היעד.

בעבר, הפונקציות של NK-cell מנוטרים בעיקר על ידי הדיגרטולציות והרעלת ציטוזה19,20,21. בנוסף, ניתן למדוד את תא הרעילות של התא NK על-ידי 51שחרור כרום בשנת22,23,24,25. עם זאת, לטיפול זה יש כמה דרישות ספציפיות, כולל הצורך בקונטרה גמא, והיא מבוססת על רדיואקטיביות, הדורשת הכשרה בטיפול ובסילוק חומרים רדיואקטיביים ומהווה רמת סיכון למשתמש. לכן, מספר חדש שאינם רדיואקטיביות מבוסס בחני שפותחו והמועסקים ללמוד פעילות תא NK.

כאן, אנו מתארים שני פרוטוקולים כאלה, צביעת מטרי לקטית דהידרוגנאז (ldh) מבוססת מדידה מבוסס תא מתווכת מתווך והוא calcein acetoxymethyl מבוססי כתמים המבוסס על שיטה מיקרוסקופית למדוד את התאים NK מתווך תאים סרטניים. מספר זה אינו דורש שימוש ברדיואיזוטופים, הם ברורים, רגישים ומזהים גורמים המשתנים בתפקוד התא של NK. בנוסף, מכיוון שפונקציית תא NK אינה יכולה להיות מוערכת במלואה מבלי לנטר שינויים בהעברת תאי NK, אנו מציגים גם את השיטה הכמותית המבוססת על cy, כדי לנטר את העברת התאים של NK.

Protocol

1. הכנת התרבות בינונית עבור תאים NK ותאים סרטניים בכבד השימוש האנושי הרוצח תאים האדם (g., NK92MI) וסרטן הכבד האדם קו התא (למשל, SK-הפטיטיס -1). הכנת NK התרבות התא בינונית עבור NK92MI האדם בתאי NK על-ידי הוספת הרכיבים הבאים כדי 500 mL של מינימלי חיוני הנשר הבינוני אלפא ללא ribonucleosides ו deאוקסיribonucleoקלייאוצדדים לריכוזים הסופי המצוין: 0.02 מ”מ חומצה פולית (100 μL של 100 מ”מ חומצה פולית), 0.2 מיואינוזיטול (500 μL של 200 מ”מ מיונוזיטול), 0.1 mM β-mercaptoethanol (3.5 μL של 14.3 M β-mercaptoethanol), 2 מ”מ L-גלוטמין (5 מ מ של 200 מ”מ L-גלוטמין), 1% פניצילין/סטרפטומיצין (5 מ ל של הפניצילין 100x/סטרפטומיצין), 12.5% שור עוברי סרום (FBS) ו-12.5% סרום לסוסים. לערבב ולסנן לחטא באמצעות יחידת סינון מסנן 0.22 יקרומטר, ולאחסן ב 4 ° c. הכנת מדיום התרבות עבור קו הגידול של הכבד סק-הפטיטיס-1 על-ידי הוספת 10% FBS ו 1% פניצילין/סטרפטומיצין כדי גלוקוז גבוה בינונית משתנה הנשר של מדיום (DMEM) המכיל 2 מ”מ L-גלוטמין. 2. מדידת מדידות LDH מבוססי תא NK-מתווכת הרעלת הרעלה לגדול SK-הפטיטיס-1 תאים ל 70-80% השטף בתרבות תא 100 מ”מ צלחת פטרי בתוך 5% CO2 ב 37 ° c ב חממה2 שיתוף. יצירת תא בודד השעיה על ידי הראשון כביסה תאים עם 5 מ ל של 1x פוספט מאגור מלוחים (PBS) ואחריו הדגירה עם 1 מ ל 0.25% טריפסין-EDTA ב 5% CO2 ב 37 ° צ’ בחממה2 עד ההשעיה תא יחיד נוצר.הערה: הפעילות התאית של NK יכולה להיגרם על ידי תאי סרטן לחוצים עקב שינויים בביטוי של הפעלת תאים מבוססי-NK ובתאי סרטן. לכן, תאים בריאים ומשניים של סרטן שוטפת יש להשתמש עבור תוצאות מדויקות. חשוב גם לציין כי הקולטנים הסלולריים NK וליגנדס יכול להיות רגיש לטריסיזציה26,27. לכן יש להימנע מלאפשר את הליך הטריסינוניזציה ולמנוע טריסינזציה מוגזמת. לאחר טריסיוניזציה, להוסיף 10 מ ל של SK-הפטיטיס-1 בינוני התרבות ו צנטריפוגה ב 160 x g עבור 3 דקות ב 15 מ”ל צינור צנטריפוגה מעוקר. לשטוף את הגלולה תא עם 5 מ ל של PBS 1x ו להשעות מחדש 5 מ ל של התרבות הבינונית. במקביל, צנטריפוגה את התאים NK92MI ב 160 x g עבור 3 דקות בשפופרת צנטריפוגה סטרילית 15 מ”ל. לשטוף את הגלולה תא עם 5 מ ל של PBS 1x ו השעיה מחדש ב 5 מ ל של NK92MI התרבות התאית בינונית.הערה: התאים הNK92MI גדלים בתווך של תרבות התא NK ומתקבלים באופן דומה כמתואר בשלב 2.1. לספור את התאים SK-הפטיטיס-1 ו-NK92MI באמצעות הומוציטוטומטר או כל מונה תא אוטומטי זמין. הוספת SK-הפטיטיס-1 תאים (היעד תאים) (1 x 104/100 μl/ובכן) ו NK92MI תאים (התאים האחרים) (1 x 105/100 μl/טוב) ביחס של 1:10 היעד: אפקטור וזרע בבארות טרילקאט בצלחת הבאר 96. מודטה 96 צלחת הבאר ב 37 ° צ’ באווירה של 95% האוויר 5% CO2 עבור 3 h. לאחר דגירה, צלחת צנטריפוגה ב 450 x g עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר. מבלי להפריע את הגלולה תא, לאסוף 100 μL של supernatant מכל טוב ולהעביר באר ב-96 היטב הצלחת. הוסף 50 μL של המצע LDH, מערבבים היטב, ו מודקת את הצלחת 20 דקות בטמפרטורת החדר בחושך. להפסיק את התגובה על ידי הוספת 50 μL של פתרון הפסקה (50% diמתילאומיד ו 20% נתרן dodecyl סולפט ב-pH 4.7). מיד למדוד את ספיגת הצלחת ב 490 ננומטר ו 680 nm באמצעות קורא צלחת. הפחת את ספיגת ה680 ננומטר מתוך הספיגה של 490 ננומטר. חישוב האחוז (%) הרעילות של תא NK באמצעות הנוסחה שלהלן.כאשר ה-LDH ניסיוני (אפקטור + תאי יעד) הוא ספיגה של תאים NK92MI ו-SK-1 תאים, LDH אפקטור תאים הוא ספיגת תאים NK92MI בלבד, LDH ספונטנית היא ספיגת התאים SK-הפטיטיס-1 לבד, ו-LDH המקסימלי הוא ספיגה של SK-הפטיטיס-1 תאים עם מאגר לליזה.הערה: כדי להפחית הפרעות בסרום, השתמש תמיד בפקדים הבאים: תאי היעד בלבד (SK-הפטיטיס-1), תאים אפקטור בלבד (NK92MI), היעד תאים עם מאגר הליזה כפקד פירוק מוחלט, תא היעד בינונית, NK92MI medium, כמו גם תא היעד בינונית ו NK92MI בינונית ביחס 1:1. 3. calcein AM צביעת מבוססי שיטה מיקרוסקופית למדידת תא NK-רעילות בתיווך התרבות SK-הפטיטיס-1 תאים ל 70-80% השטף. צור תא יחיד השעיה על ידי הראשון כביסה תאים עם 5 מ ל של 1x PBS ואחריו דגירה עם 1 מ ל 0.25% טריפסין-EDTA. צנטריפוגה SK-הפטיטיס-1 תאים בצינור 1 מ ל צנטריפוגה סטרילית ב 160 x g עבור 3 דקות. להשעות את הגלולה ב 3 מ ל של סרום ללא הבחנה. הוסף 1.5 μL של calcein AM פתרון (10 מ”מ) כדי SK-הפטיטיס-1 תאים ו דגירה עבור 30 דקות בטמפרטורת החדר. צנטריפוגה calcein AM-התווית SK-הפטיטיס-1 תאים ב 160 x g עבור 3 דקות בשפופרת צנטריפוגה סטרילית 15 מ”ל. לשטוף את התאים פעמיים עם 5 מ ל של 1x PBS להסיר calcein העודפים צבע AM. במקביל, צנטריפוגה NK92MI תאים ב 160 x g עבור 3 דקות בשפופרת צנטריפוגה סטרילית 15 מ”ל. לשטוף את הגלולה תא פעם עם 5 מ ל של ה-PBS 1x ו-השעיה מחדש ב 5 מ ל של NK92MI cell בינונית. הרוזן calcein AM-תווית SK-הפטיטיס-1 תאים ו NK92MI תאים באמצעות הומוציטוטומטר או מונה תא אוטומטי. להשעות SK-הפטיטיס-1 תאים בתווך התרבות ב 1 x 105 תאים/ML ו NK92MI תאים ב 1 x 106 תאים/ML במדיום התא NK. הלוח calcein AM-התווית SK-הפטיטיס-1 תאים (היעד תאים) (1 x 104/100 μl/ובכן) עם NK92MI תאים (בתאי אפקטור) (1 x 105/100 μl/ובכן) (1:10 היעד: היחס של אפקטור) לבאר שלישיה בבארות בצלחת 96. מודטה 96 צלחת הבאר ב 37 ° צ’ באווירה של 95% האוויר 5% CO2 עבור 4 h. לאחר דגירה, לכידת תמונות של הזריחה של calcein AM-התווית תאים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטית בהגדלה 10x. לכידת לפחות 10 שדות שונים של כל שכפול עבור כל תנאי טיפול. באופן אקראי לבחור 10 תמונות עבור כל שכפול וספירת calcein AM-חיוביים המסומנים בתאי היעד מודבטים עם או בלי תאים NK92MI. חישוב% ציטורעילות באמצעות הנוסחה שלהלן.הערה: כפקדים, השתמש בתאי יעד ללא NK92MI תאים ולגמרי תאי יעד מסוימים כבקרת מימוש מלאה. עבור הפירוק המלא, מארג התאים ב 0.5% טריטון X-100 עבור 1 h (20 μL של 5% טריטון X-100 ב 200 μL של מדיית תרבות). 4. שיטת העברת תאים של NK לגדל תאים NK92MI ותאי צנטריפוגה ב 160 x g עבור 3 דקות בשפופרת צנטריפוגה סטרילית 15 מ”ל. לשטוף את הגלולה הסלולרית פעמיים עם 5 מ ל של 1x PBS ו להשעות את התאים 3 מ ל של סרום ללא NK92MI cell בינונית. ספירה NK92MI תאים באמצעות הומוציטוטומטר או מונה תאים אוטומטי. צלחת NK92MI תאים (2.5x 10 תאים /100 μl/ובכן) בחלק העליון של תא החלל החדיר (6.5 מ”מ בקוטר להוסיף 5 יקרומטר גודל הנקבוביות). בחדר התחתון להוסיף 0.6 mL של סרום ללא מדיום המכיל חומר להיבדק עבור כימומי תא NK נכסים (g., בינוני ממוזג, נוגדנים, ציטוקינים).הערה: בעת הכנת המדיום הממוזג, השתמש באמצעי סרום מופחת ללא סרום מוסף כדי למנוע הפרעות מחלבונים בסרום בתוך שיטת ההעברה. המלון מפעיל את 24 החדרים הניתנים לחדירות ב-37 ° c עבור 4 שעות. לאחר 4 שעות, לאסוף את התאים הלא מחסיד ולהעביר NK92MI מהתא התחתון ולהעביר אותם מיון תאים המופעל על ידי קרינה פלואורסצנטית (FACS) צינורות לניתוח נוסף.הערה: זמן התרבות עשוי להשתנות בהתאם לסוג תאי היעד, כמו גם לכמות ולקינטיקה של נוגדנים המיוצרים על-ידי תאי היעד. לכן, הפעם יש לקבוע מדעית עבור כל סוג תא, כימוקין, וניסוי. הוסף מספר קבוע מראש של חרוזי ספירה עבור cy, לזרום בנפח של 50 μL לכל צינור המכיל תאים NK הועברו. להעריך את עוצמת הקול של 300 μL/ובכן תא השעיה באמצעות cytometer כל זרימה מסוגל אוטומטי מבוסס FACS תא ספירת תאים.הערה: מערבבים או מערבולת-מערבבים את חרוזי הספירה לצילנסים הזורמים ביסודיות בכל פעם לפני השימוש כדי להבטיח שמספר קבוע של חרוזים משמש כדי למזער את השונות הניסיונית. ליטוף הפוך מומלץ עם חרוזי ספירה כדי לשמור על דיוק. השתמש רק בתאי NK ולספור חרוזים על הזרימה cy, לנסות כמו שולטת ניתוח FACS. המחברים ממליצים לקרוא לפחות 10,000 חרוזים + תאי NK בשילוב, סכום שעבד היטב. עם זאת, מספר זה עשוי להשתנות בהתאם לתנאים הניסיוניים. לכן, המספר המשולב של חרוזים + תאי NK צריך להיות מתוך התנסות מדעית עבור כל סוג של ניסוי. בנוסף, חשוב לבצע ניסויים באמצעות טרילקטים ביולוגיים כדי להשיג תוצאות משמעותיות מבחינה סטטיסטית ולחשבון לשונות בין ספירות תאים שונות. חשב מספר מוחלט של תאים NK92MI שהועברו באמצעות נוסחה זו:כאשר = מספר התאים, B = מספר חרוזים, C = לספור חרוז מוקצה של הרבה (מספר חרוזים ספירת עבור הזרמת cy, 50 μL; בדוגמה זו 49,500), ו-D = נפח של מדגם (μL).הערה: אם 300 μL של אמצעי אחסון לדוגמה (תאים שהועברו) משמש לניתוח של FACS עם 50 μL של חרוזים לספירה עבור cy, המספר המוחלט של תאים שהועברו = 1,700 תאים/3,300 האירועים x 49,500 חרוזים/300 μL = 84.975 תאים/μL. יש לתקן את החישוב אם המדגם מדולל או אם משתמשים בכמות שונה של חרוזי ספירת FACS.

Representative Results

תא NK הרעילות של התא והוא אומר והעברת הגירה התא NK בוצעו באמצעות קו הגידול SK-1 הכבד של הסרטן כמערכת מודל. כדי למדוד את הרעילות של התא NK באמצעות שיטת LDH, SK-הפטיטיס-1 תאים המבטא או מפרט לא ספציפי (NS) או שרין מיקוד הפעלת שעתוק גורם 4 (ATF4) היו מודבטים עם תאים NK92MI בצלחת 96 היטב עבור 3 h (איור 1א). ATF4 הוצגה בעבר כדי להסדיר את הרעילות של התא NK על ידי upregulating הפעלת ליגנד ULBP128. פעילות LDH המשויכת להריגה של תא מתווכת של תא היעד נמדדה באופן מטריקלי, ואחוז הרעילות באחוזים מחושב באמצעות הנוסחה המתוארת בפרוטוקול 1. ATF4 מופחתת באופן משמעותי מופחת תא nk בתיווך לעומת התאים nk ביטוי מרין NS (איור 1ב-D). אנו גם מדדו את הרעילות של תא NK באמצעות שימוש בשיטת calcein AM המבוססת על כתמים. לשם כך, SK-הפטיטיס-1 תאים המבטא NS מרין או ATF4nas מיקוד היו מתויג עם calcein AM ו דגירה עם NK92MI תאים ב 96 לוחות היטב עבור 4 h כפי שמודגם באיור 2א. לאחר דגירה, תמונות של calcein AM-חיוביים תאים נתפסו על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטית באמצעות מסנן FITC/GFP. תאים שנהרגו על ידי תאים NK אינם מזוהים על ידי גישה זו, כי הם כבר לא לשמור על הצבע של calcein AM. כפי שמוצג באיור 2B, C, מספר calcein AM-חיובי SK-הפטיטיס-1 תאים הצטמצמה לאחר שיתוף התרבות עם NK92MI תאים לעומת SK-הפטיטיס-1 תאים גדל ללא תאים NK92MI. עם זאת, כצפוי, ATF4 למטה דרך שרין מופחתת מופחת תא מתווך NK הריגת SK-הפטיטיס-1 תאים, נצפתה על ידי מספר רב יותר של CALCEIN AM-חיוביים תאים (איור 2B, C). לכן, הן ldh מבוסס ו calcein AM בחני הראו תוצאות עקביות ואישר כי ATF4 מפחית את NK-תיווך הסרטן תא הרעילות. כל אחד מאלה מספק מספיק כדי להעריך את הרעילות של התא NK בתיווך; עם זאת, אנו ממליצים להשתמש בשתי השיטות כדי להגביר את החשאיות והביטחון בתוצאות. אנו מציגים גם את התוצאות של 24 גם הגירה תא NK. תאים NK92MI הושעו מחדש סרום-NK92MI בינוני בחדר העליון, וכימוקין, מוטיב CC, ליגנד 2 (CCL2) נוספה לתא החדיר התחתון. העברת התא NK הייתה כמתואר בסעיף 3 (איור 3א). מספר התאים המועברים NK92MI היה כולל על ידי הוספת חרוזי ספירה עבור cy, לזרום ולאחר מכן ניתוח FACS. כפי שמוצג באיור 3ב-C, חלה עלייה משמעותית במספר התאים הNK92MI שהועברו לכיוון הבינוני CCL2 המכיל בהשוואה לאמצעי הבקרה. איור 1: שיטת הרעילות המבוססת על הפעילות של LDH בתיווך תאים. (א) סכמטי המתאר את השלבים המרכזיים של הפעילות המבוססת על מסמך ldh של תאי הרעילות מבוססת-תא NK. (ב, ג) ATF4 ביטוי נותחו ב-SK-הפטיטיס-1 תאים המבטאים את המרין (NS), או מטרה מיקוד ATF4 על-ידי RT-PCR כמותי ומערבי. (ב) ברמת ATF4 mrna היחסי מוצגת לאחר נורמליזציה לרמת אקב ק-הפטיטיס-1 תאים המבטא NS מרין או ATF4 מרין. (C) ATF4 ו-אקב ‘ רמות חלבון ב SK-הפטיטיס 1 תאים המבטא NS מרין או ATF4 מרין. (ד) NK תא-מתווך הרעילות נותחו ב SK-הפטיטיס-1 תאים ביטוי או NS מרין או ATF4 מרין על ידי שיטת ldh. אחוז (%) בתיווך התאים של NK. נתונים מוצגים כממוצע ± SEM; ns, לא משמעותי; * * p < 0.01, * * * p < 0.001. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה. איור 2: Calcein AM כתמים מבוססי שיטה מיקרוסקופית למדידת הרעילות של התא NK בתיווך. (A) סכמטי המתאר את השלבים המרכזיים של calcein AM כתמים מבוססי שיטה מיקרוסקופית למדידת הרעילות NK תא בתיווך. (ב) בתאי-הפטיטיס (ב) הביעו הרעלת תאים מתווך ב-SK-כדוריות הבטא או ה-NS מרין או ATF4 רין באמצעות השיטה calcein AM. תמונות מייצגות מוצגות. סרגל קנה מידה = 200 μm. (ג) אחוזים מתאי calcein AM-חיוביים עבור הניסוי המוצג בלוח B. * * * < 0.01. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה. איור 3: הגירה מבוססת FACS מבוסס תא כמותי שיטת ההגירה. (A) סכמטי המתאר את השלבים המרכזיים של העברת תאים מבוססי facs מבוסס תא. (ב, ג) שיטת ההעברה של התא NK בוצעה לאחר הוספת 50 ng של CCL2 לחדר התחתון של הצלחת 24. (ב) נציג מגרשים של תאי NK לצורך בקרה או בינוני תרבותי שטופלו בCCL2 מוצגים. (ג) מוצג לצורך הניסוי המוצג בלוח B. * * * p < 0.001. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Discussion

הרעילות ציטורעלים ושיטות הגירה המתוארים כאן ניתן להשתמש כדי להעריך את הרעילות של התא NK לתאים סרטניים ו NK תא בתיווך מנגנוני התחמקות החיסונית בגידולים ממאירים, כמו גם כדי לזהות סוכנים טיפוליים שישפרו פעילות תא NK/פונקציה. הפרוטוקולים הם פשוטים, רגישים, שאינם מבוססים, וחלופות העדיפות הקלאסית המבוססת על רדיואקטיביות-מבוססי 51כרום שחרור שחרורו. הפרוטוקולים תוכננו במיוחד כדי להיות הסתגלות בקלות לשימוש ברוב המעבדות, עם מטרי צביעה ישירה, מיקרוסקופיים, או FACS מבוססי הקריאות, כי הם קלים לפענוח, המאפשר לחוקרים להגיע למסקנות אמין. הכל מדרגי עבור גישות המבוססות על הקרנה בתפוקה גבוהה. למרות הפרוטוקולים מוצגים בהקשר של קו אחד של הגידול בכבד, הם יכולים להיות מותאם בקלות לסוגים אחרים של תאים סרטניים ו/או תאים אחרים שאינם סרטניים היעד.

בעוד שכל השיטות המוצגות הן חזקות ומתחלות, וריאציה בין-ניסויית עלולה להתרחש עם אצוות שונות של תאים סרטניים ותאי NK. כדי להבטיח שהתוצאות יתמכו במדויק במסקנות הניסויים, מומלץ לחזור על הניסוי לפחות פעמיים באמצעות טרילקטים ביולוגיים.

מגבלה של שיטה זו היא שקצב הצמיחה של תאים NK92MI יכול להיות איטי. לכן, עבור ניסויים עם 50 או יותר דגימות, מספר מספיק של NK92MI יש לגדול מראש כדי למנוע עיכובים. כמו כן, יש ליישם את כל הפקדים המתוארים בפרוטוקולים כדי להימנע מתוצאות מזויפות ומאי. מגבלה נוספת של שיטת הרעילות NK ציטוזה היא כי NK יחס תאים סרטניים, כמו גם את זמן הדגירה, חייב להיות ממוטב עבור כל תא מטרה. לדוגמה, יש לנו בדקנו את היחסים השונים של תאים סרטניים לתאים NK (1:5, 1:10, 1:20, 1:40, ו-1:80) עבור שורות התאים של סרטן הכבד, כמו גם פעמים מרובות דגירה (2, 3, 4, 5, ו 6 h). בהתבסס על התוצאות שלנו הבחנו תוצאות עקבית ביותר עם 1:10 ו 1:20 יחס של תאים סרטניים לתאי NK ו דגירה עבור 3 h.

בנוסף, תאים סרטניים נגזר גידולים מוצקים יהיה לצרף ולגדול על פני השטח של לוחית התרבות, בעוד תאים NK לגדול בהשעיה. אם זמן הדגירה הוא יותר מ 3 שעות, מומלץ להשתמש וזמן קובץ מצורף 96 לוחות היטב, אשר ישפר את העקביות ואת התוכסות בין ניסויים ומשכפל ביולוגי. חשוב גם לציין כי NK המושרה cell הנגרמת הרעלת ציטוזה יכול להתבצע גם באמצעות תאי NK העיקרי מבודדים דם היקפי מונפינקה תאים (PBMCs). עם זאת, ישנן מספר מגבלות עם ניסויים כאלה. ראשית, ניסויים אלה לא יכולים להיות בקלות קנה מידה כמו עם NK92MI תאים. שנית, אצווה-to-אצווה וריאציה של פעילות ציטוטוקסיים של תאים NK מבודדים PMBCs יכול להיות בעייתי במונחים של השגות ופרשנות של התוצאות. באופן דומה, קווים אחרים התא NK אחרים מתוארים בספרות וניתן להשתמש בסוגים אלה של ניסויים, כולל NKL תאים29; עם זאת, בניגוד לתאי NK-92MI, תאים NKL הם תלויים ב-IL-2 ולא זמין מסחרית.

כאשר בוחנים את הניסויים של calcein AM מתוארים, חשוב לציין כי calcein AM נשאר בגופים אפוטוטיים לאחר מוות התאים30. לכן, כימות הצביעת של calcein AM צריך להתבצע בקפידה, כפי שהוא עלול להוביל להערכת החסר של הרעילות NK.

בדומה מתווכת תא בתיווך, אפנון של הגירה תא NK על ידי ציטוקינים וכימורים אחרים ממלא תפקיד חשוב בוויסות של פונקציית תא NK. שיטת ההעברה של התא NK המתוארת כאן מספקת פלטפורמה פשוטה להערכת הגירה של תא NK בהקשר של גירוי כימוקין או כימוסטנט. ניתן להשתמש באפשרות זו כדי להעריך סוכנים שיכולים לקדם או להפריע להעברת תאי NK-ובכך לזהות משפרי וrepressors של העברת תאים של NK. שיטה זו יכולה גם להיות שימושית כדי ללמוד את היכולת הרגולציה של הגירה של תא NK כתוצאה של שינויים גנטיים/אפיגנטיים (upregulation או downregulation) או הנובעים עקב טיפול בסמים.

כדי למדוד במדויק את העברת התאים של NK, קיימים מספר שלבים קריטיים שיש לעקוב אחריהם. עבור כל הניסויים באמצעות המדיום הממוזג, חשוב שניתן יהיה להשתמש במדיום הממוזג המקביל מתנאי השליטה והטיפול להשגת מדידות מדויקות. הזמן של הדגירה יהיה מגוון עם כימומי מטוהר ומדיום ממוזג. בסופו של דבר, הגירה transwell מבוססת היטב נחשב שיטה מצוינת להערכת הגירה תא NK; עם זאת, מונותרבויות הומוגנית המועסקים בחני חוסר הפיזיולוגיה המורכבת של רקמות או אפילו 3d תרבויות שאולי יותר במדויק לחקות את מיקרוסביבה הגידול.

לפיכך, למרות שיש כמה מגבלות על מספר מוגבל של התא NK הרעילות לספר ושיטת ההגירה של NK הציג במאמר זה, אלה מספר חלים על מגוון רחב של מחקרים אימונולוגיים ובכך לספק שיטות חשובות ואמינות כדי להעריך את התא NK הפונקציה ואת התא NK מאופקקים therapeutics החיסונית.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

אנו מודים בהכרת תודה מענקי המכון הלאומי לבריאות: R01CA195077-01A1 (NW), R01CA200919-01 (NW), ו-1R01 CA218008-01A1 (NW). אנו מכירים גם את מחלקת ההגנה מימון W81XWH1910480 ו W81XWH-18-1-0069 כדי NW.

Materials

Absolute counting beads Thermo Fisher Scientific C36950
Alpha-MEM Sigma-Aldrich M4256
Amicon ultra Centrifugal filters Millipore UFC900324
Calcein AM dye Sigma-Aldrich 17783
DMEM Gibco 11965-092
Fetal Bovine Serum Gibco 26140079
Folic Acid Sigma-Aldrich F8758
Horse Serum Gibco 16050114
L-Glutamine (200 mM) Gibco 2530081
LDH cytotoxic assay Kit Thermo Fisher Scientific 88953
myo-Inositol Sigma-Aldrich I5125
NK92MI cells ATCC CRL-2408
Opti-MEM Gibco 31985070
Phosphate Buffer Saline (PBS) Sigma-Aldrich P4417
SKHEP-1 Cells ATCC HTB-52
Transwell permeable chambers Costar 3241
Trypsin EDTA solution Gibco 25200056
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Chiossone, L., Dumas, P. Y., Vienne, M., Vivier, E. Natural killer cells and other innate lymphoid cells in cancer. Nature Reviews Immunology. 18 (11), 671-688 (2018).
  2. Borghaei, H., Smith, M. R., Campbell, K. S. Immunotherapy of cancer. European Journal of Pharmacology. 625 (1-3), 41-54 (2009).
  3. Kalbasi, A., Ribas, A. Tumour-intrinsic resistance to immune checkpoint blockade. Nature Reviews Immunology. , (2019).
  4. Zhang, Q., Cao, X. Epigenetic regulation of the innate immune response to infection. Nature Reviews Immunology. 19 (7), 417-432 (2019).
  5. Janeway, C. A. The immune system evolved to discriminate infectious nonself from noninfectious self. Immunol Today. 13 (1), 11-16 (1992).
  6. Natoli, G., Ostuni, R. Adaptation and memory in immune responses. Nature Immunology. 20 (7), 783-792 (2019).
  7. Cooper, M. D., Alder, M. N. The evolution of adaptive immune systems. Cell. 124 (4), 815-822 (2006).
  8. Riera Romo, M., Perez-Martinez, D., Castillo Ferrer, C. Innate immunity in vertebrates: an overview. Immunology. 148 (2), 125-139 (2016).
  9. Sonnenberg, G. F., Hepworth, M. R. Functional interactions between innate lymphoid cells and adaptive immunity. Nature Reviews Immunology. 19 (10), 599-613 (2019).
  10. Vivier, E., et al. Innate or adaptive immunity? The example of natural killer cells. Science. 331 (6013), 44-49 (2011).
  11. Shi, F. D., Ljunggren, H. G., La Cava, A., Van Kaer, L. Organ-specific features of natural killer cells. Nature Reviews Immunology. 11 (10), 658-671 (2011).
  12. Trapani, J. A., Davis, J., Sutton, V. R., Smyth, M. J. Proapoptotic functions of cytotoxic lymphocyte granule constituents in vitro and in vivo. Current Opinion in Immunology. 12 (3), 323-329 (2000).
  13. Krzewski, K., Strominger, J. L. The killer’s kiss: the many functions of NK cell immunological synapses. Current Opinion in Cell Biology. 20 (5), 597-605 (2008).
  14. Berke, G. The binding and lysis of target cells by cytotoxic lymphocytes: molecular and cellular aspects. Annual Review of Immunology. 12, 735-773 (1994).
  15. Abel, A. M., Yang, C., Thakar, M. S., Malarkannan, S. Natural Killer Cells: Development, Maturation, and Clinical Utilization. Frontiers in Immunology. 9, 1869 (2018).
  16. Zamai, L., et al. Natural killer (NK) cell-mediated cytotoxicity: differential use of TRAIL and Fas ligand by immature and mature primary human NK cells. Journal of Experimental Medicine. 188 (12), 2375-2380 (1998).
  17. Marcus, A., et al. Recognition of tumors by the innate immune system and natural killer cells. Advances in Immunology. 122, 91-128 (2014).
  18. Vesely, M. D., Kershaw, M. H., Schreiber, R. D., Smyth, M. J. Natural innate and adaptive immunity to cancer. Annual Review of Immunology. 29, 235-271 (2011).
  19. Alter, G., Malenfant, J. M., Altfeld, M. CD107a as a functional marker for the identification of natural killer cell activity. Journal of Immunological Methods. 294 (1-2), 15-22 (2004).
  20. Bryceson, Y. T., et al. A prospective evaluation of degranulation assays in the rapid diagnosis of familial hemophagocytic syndromes. Blood. 119 (12), 2754-2763 (2012).
  21. Shabrish, S., Gupta, M., Madkaikar, M. A Modified NK Cell Degranulation Assay Applicable for Routine Evaluation of NK Cell Function. Journal of Immunology Research. 2016, 3769590 (2016).
  22. Pietra, G., et al. Melanoma cells inhibit natural killer cell function by modulating the expression of activating receptors and cytolytic activity. Cancer Research. 72 (6), 1407-1415 (2012).
  23. Fehniger, T. A., et al. Potential mechanisms of human natural killer cell expansion in vivo during low-dose IL-2 therapy. Journal of Clinical Investigation. 106 (1), 117-124 (2000).
  24. Brunner, K. T., Mauel, J., Cerottini, J. C., Chapuis, B. Quantitative assay of the lytic action of immune lymphoid cells on 51-Cr-labelled allogeneic target cells in vitro; inhibition by isoantibody and by drugs. Immunology. 14 (2), 181-196 (1968).
  25. Roder, J. C., et al. A new immunodeficiency disorder in humans involving NK cells. Nature. 284 (5756), 553-555 (1980).
  26. Byrd, A., Hoffmann, S. C., Jarahian, M., Momburg, F., Watzl, C. Expression analysis of the ligands for the Natural Killer cell receptors NKp30 and NKp44. PLoS One. 2 (12), e1339 (2007).
  27. Nitahara, A., et al. NKG2D ligation without T cell receptor engagement triggers both cytotoxicity and cytokine production in dendritic epidermal T cells. Journal of Investigative Dermatology. 126 (5), 1052-1058 (2006).
  28. Gowen, B. G., et al. A forward genetic screen reveals novel independent regulators of ULBP1, an activating ligand for natural killer cells. Elife. 4, e08474 (2015).
  29. Robertson, M. J., et al. Characterization of a cell line, NKL, derived from an aggressive human natural killer cell leukemia. Experimental Hematology. 24 (3), 406-415 (1996).
  30. Somanchi, S. S., McCulley, K. J., Somanchi, A., Chan, L. L., Lee, D. A. A Novel Method for Assessment of Natural Killer Cell Cytotoxicity Using Image Cytometry. PLoS One. 10 (10), e0141074 (2015).

Tags

NK Cell FunctionNK Cell-mediated CytotoxicityNK Cell MigrationTumor MicroenvironmentLDH AssayCalcein AM AssayHuman Liver Cancer CellsCell CultureCentrifugation96-well PlateAbsorbance MeasurementCytotoxicity Calculation

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Chava, S., Bugide, S., Gupta, R., Wajapeyee, N. Measurement of Natural Killer Cell-Mediated Cytotoxicity and Migration in the Context of Hepatic Tumor Cells. J. Vis. Exp. (156), e60714, doi:10.3791/60714 (2020).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image