Meting van Natural Killer Cell-Gemedieerde Cytotoxiciteit en Migratie in de context van levertumorcellen

1. Voorbereiding van Cultuur Medium voor NK Cellen en Levertumorcellen Gebruik menselijke natuurlijke killer cellen (bijvoorbeeld NK92MI) en menselijke lever kanker cellijn (bijvoorbeeld SK-HEP-1). Bereid NK celkweekmedium voor op NK92MI menselijke NK-cellen door de volgende componenten toe te voegen aan 500 mL van minimaal essentieel medium Eagle alpha zonder ribonucleosides en deoxyribonucleosides aan de aangegeven eindconcentraties: 0,02 mM foliumzuur (100 μL van 100 mM foliumzuur), 0,2 mM myoinositol (500 μL van 200 mM myoinositol), 0,1 mM β-mercaptoethanol (3,5 μL van 14,3 M β-mercaptoethanol), 2 mM L-glutamine (5 mL van 200 mM L-glutamine), 1% penicilline/streptomycine (5 mL van 100x penicilline/streptomycine), 12,5% foetaal bovine serum (FBS) en 12,5% paardenserum. Meng en filter steriliseren met behulp van een steriele filtratie-eenheid van 0,22 μm en bewaar bij 4 °C. Bereid kweekmedium voor op hepatische tumorcellijn SK-HEP-1 door 10% FBS en 1% penicilline/streptomycine toe te voegen aan het gemodificeerde Eagle medium (DMEM) van Dulbecco (DMEM) met 2 mM L-glutamine. 2. Colorimetrische LDH Measurement-based NK Cell-gemedieerde Cytotoxiciteit Assay Kweek SK-HEP-1 cellen tot 70−80% samenvloeiing in een 100 mm celkweek Petrischaal in 5% CO2 bij 37 °C in een CO2 incubator. Genereer een eencellige suspensie door eerst wascellen te wassen met 5 mL 1x fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS), gevolgd door incubatie met 1 mL van 0,25% trypsin-EDTA in 5% CO2 bij 37 °C in een CO2-incubator totdat een enkele celse suspensie wordt gegenereerd.OPMERKING: NK celactiviteit kan worden veroorzaakt door gestreste kankercellen als gevolg van veranderingen in de expressie van NK celactiverende ligand in kankercellen. Daarom moeten gezonde en sub-confluent kankercellen worden gebruikt voor nauwkeurige resultaten. Het is ook belangrijk op te merken dat NK celreceptoren en liganden gevoelig kunnen zijn voor trypsinisatie26,27. Daarom moet het trypsinisatieprotocol zorgvuldig worden geoptimaliseerd en moet overmatige trypsinisatie worden vermeden. Voeg na trypsinisatie 10 mL SK-HEP-1 kweekmedium toe en centrifugeer bij 160 x g gedurende 3 min in een steriele conische centrifugebuis van 15 mL. Was de celpellet met 5 mL 1x PBS en breg in 5 mL kweekmedium. Centrifugeer tegelijkertijd de NK92MI-cellen met 160 x g gedurende 3 min in een sterielcentrifugebuis van 15 mL. Was de celpellet met 5 mL 1x PBS en breg in 5 mL NK92MI celkweekmedium.OPMERKING: NK92MI cellen worden geteeld in NK celkweek medium en op dezelfde manier verkregen zoals beschreven in stap 2.1. Tel de SK-HEP-1 en NK92MI cellen met behulp van een hemocytometer of een beschikbare geautomatiseerde celteller. Voeg SK-HEP-1-cellen (doelcellen) (1 x 104/100 μL/put) en NK92MI-cellen (effectorcellen) (1 x 105/100 μL/put) toe in de verhouding van 1:10 doel:effector en zaad in drievoudputten in een 96-put. Incubeer de 96 putplaat bij 37 °C in een atmosfeer van 95% lucht en 5% CO2 gedurende 3 uur. Na incubatie, centrifugeplaat op 450 x g voor 5 min bij kamertemperatuur. Zonder de celpellet te verstoren, verzamel je 100 μL supernatant uit elke put en breng je over naar een put in een nieuwe 96 putplaat. Voeg 50 μL LDH-substraat toe, meng goed en incubeer de plaat gedurende 20 min bij kamertemperatuur in het donker. Stop de reactie door 50 μL stopoplossing (50% dimethylformamide en 20% natriumdodecylsulfaat bij pH 4.7) toe te voegen. Meet meteen de absorptie van de plaat op 490 nm en 680 nm met behulp van een plaatlezer. Trek de absorptie bij 680 nm af van de absorptie bij 490 nm. Bereken het percentage (%) NK celcytotoxiciteit met behulp van de onderstaande formule.waar LDH-experimentele (effector + doelcellen) de absorptie is van NK92MI-cellen en SK-HEP-1-cellen, is LDH-effectorcellen alleen al de absorptie van NK92MI-cellen, ldh-spontane is alleen de absorptie van SK-HEP-1-cellen en LDH-maximale is de absorptie van SK-HEP-1 cellen met lysisbuffer.OPMERKING: Gebruik altijd de volgende besturingselementen: doelcellen alleen (SK-HEP-1), effectorcellen alleen (NK92MI), doelcellen met lysisbuffer als volledige lysiscontrole, doelcelmedium, NK92MI-medium, evenals doelcelmedium en NK92MI medium in een 1:1 verhouding. 3. Calcein AM Staining-gebaseerde microscopische methode voor het meten van NK Cell-gemedieerde Cytotoxiciteit Cultuur SK-HEP-1 cellen tot 70−80% samenvloeiing. Genereer een eencellige suspensie door eerst wascellen te wassen met 5 mL 1x PBS, gevolgd door incubatie met 1 mL van 0,25% trypsin-EDTA. Centrifugeer SK-HEP-1 cellen in een 1 mL steriele centrifugebuis op 160 x g gedurende 3 min. Resuspend de pellet in 3 mL serumvrije DMEM. Voeg 1,5 μL calcein AM-oplossing (10 mM) toe aan SK-HEP-1 cellen en broed gedurende 30 min bij kamertemperatuur. Centrifuge calcein AM-gelabelde SK-HEP-1 cellen op 160 x g gedurende 3 min in een 15 mL steriele centrifugebuis. Was cellen twee keer met 5 mL van 1x PBS om overtollige calcein AM kleurstof te verwijderen. Centrifugeer tegelijkertijd NK92MI-cellen bij 160 x g gedurende 3 min in een sterielcentrifugebuis van 15 mL. Was de celpellet eenmaal met 5 mL 1x PBS en breg in 5 mL NK92MI celmedium. Tel calcein AM-gelabelde SK-HEP-1 cellen en NK92MI cellen met behulp van een hemocytometer of een geautomatiseerde celteller. Resuspend SK-HEP-1 cellen in kweekmedium op 1 x 105 cellen/mL en NK92MI cellen bij 1 x 106 cellen/mL in NK celmedium. Plaat calcein AM-gelabelde SK-HEP-1 cellen (doelcellen) (1 x 104/100 μL/put) met NK92MI cellen (effectorcellen) (1 x 105/100 μL/well) (1:10 target:effector ratio) per put in drievoudputten in een 96 plaat put goed. Incubeer de 96 putplaat bij 37 °C in een atmosfeer van 95% lucht en 5% CO2 gedurende 4 uur. Leg na incubatie fluorescentiebeelden vast van de met calcein AM gelabelde cellen met behulp van een fluorescentiemicroscoop bij 10x vergroting. Leg ten minste 10 verschillende velden van elke repliceren voor elke behandelingsaandoening. Selecteer willekeurig 10 afbeeldingen voor elke replicerende en telling calcein AM-positieve gelabelde doelcellen geïncubeerd met of zonder NK92MI-cellen. Bereken % cytotoxiciteit met behulp van de onderstaande formule.OPMERKING: Gebruik als besturingselementen doelcellen zonder NK92MI-cellen en volledig lysed doelcellen als volledige lysiscontrole. Voor volledige lyse, incubeer de cellen in 0,5% Triton X-100 voor 1 h (20 μL van 5% Triton X-100 in 200 μL van cultuurmedia). 4. NK Celmigratie-test Kweek NK92MI-cellen en centrifugecellen met 160 x g gedurende 3 min in een sterielcentrifugebuis van 15 mL. Was de celpellet twee maal met 5 mL 1x PBS en breg de cellen opnieuw op in 3 mL serumvrij NK92MI celmedium. Tel NK92MI-cellen met behulp van een hemocytometer of een geautomatiseerde celteller. Plaat NK92MI-cellen (2,5 x 105 cellen/100 μL/put) in het bovenste compartiment van transputdoorlaatbare kamer (6,5 mm diameter insert en 5 μm porie grootte). Voeg in de onderste kamer 0,6 mL serumvrij medium toe dat materiaal bevat dat moet worden getest op NK-celchemoattractante eigenschappen (bijvoorbeeld geconditioneerd medium, chemokines, cytokinen).OPMERKING: Gebruik bij de bereiding van geconditioneerd medium een medium met verminderd serum zonder toegevoegd serum om interferentie van serumeiwitten in de migratietest te elimineren. Incubeer de 24 goed doorlatende kamers bij 37 °C gedurende 4 uur. Verzamel na 4 uur de niet-aanhangende en gemigreerde NK92MI-cellen uit de onderste kamer en breng ze over naar fluorescentiegeactiveerde celsorteerbuizen (FACS) voor verdere analyse.OPMERKING: De tijd van de cultuur kan variëren afhankelijk van het type doelcellen, evenals de hoeveelheid en kinetiek van chemokines geproduceerd door de doelcellen. Daarom moet deze tijd empirisch worden bepaald voor elk celtype, chemokine en experiment. Voeg vooraf bepaald aantal tellende kralen voor flow cytometrie in een volume van 50 μL toe aan elke buis met gemigreerde NK-cellen. Evalueer het volume van 300 μL/well celvering met behulp van een stroomcytometer die geautomatiseerd facs-gebaseerde celtelling kan automatiseren.OPMERKING: Meng of vortex-meng de tellende kralen voor flow cytometrie grondig elke keer voor gebruik om ervoor te zorgen dat een constant aantal kralen wordt gebruikt om experimentele variabiliteit te minimaliseren. Reverse pipetteren wordt aanbevolen met graafkralen om de nauwkeurigheid te behouden. Gebruik alleen NK-cellen en het tellen van kralen voor flow cytometrie als FACS-analysecontroles. De auteurs raden het lezen van ten minste 10.000 kralen + NK cellen gecombineerd, een bedrag dat goed heeft gewerkt. Dit aantal kan echter variëren afhankelijk van de experimentele omstandigheden. Daarom moet het gecombineerde aantal kralen + NK-cellen empirisch worden bepaald voor elk type experiment. Daarnaast is het belangrijk om experimenten uit te voeren met biologische drievouden om statistisch significante resultaten te bereiken en rekening te houden met variabiliteit tussen verschillende celtellingen. Bereken het absolute aantal gemigreerde NK92MI-cellen met behulp van deze formule:waar A = aantal cellen, B = aantal kralen, C = toegewezen kraaltelling van de partij (aantal tellende kralen voor stroomcytometrie/50 μL; in dit voorbeeld 49.500) en D = volume van monster (μL).OPMERKING: Als 300 μL monstervolume (gemigreerde cellen) wordt gebruikt voor FACS-analyse met 50 μL tellende kralen voor stroomcytometrie, het absolute aantal gemigreerde cellen = 1.700 cellen /3.300 kraalgebeurtenissen x 49.500 kralen/300 μL = 84.975 cellen/μL. De berekening moet worden gecorrigeerd als het monster wordt verdund of als een ander volume facs-tellende kralen wordt gebruikt.