قياس السمية الخلوية بوساطة الخلية القاتلة الطبيعية والهجرة في سياق خلايا الورم الكبدي
Summary
التهرب من القاتل الطبيعي (NK) القضاء على الخلايا بوساطة الخلايا السرطانية مهم لبدء السرطان والتقدم. هنا، نقدم بروتوكولين غير قائمين على النشاط الإشعاعي لتقييم السمية الخلوية بوساطة NK تجاه خلايا الورم الكبدي. بالإضافة إلى ذلك، يتم تقديم بروتوكول ثالث لتحليل ترحيل خلية NK.
Abstract
الخلايا القاتلة الطبيعية (NK) هي مجموعة فرعية من مجموعة الخلايا الليمفاوية السامة للخلايا في الجهاز المناعي الفطري وتشارك كخط دفاع أول عن طريق تطهير الخلايا المصابة بالممرضات والخبيثة والمجهدة. قدرة خلايا NK للقضاء على الخلايا السرطانية يجعلها أداة هامة في مكافحة السرطان. العديد من العلاجات الجديدة القائمة على المناعة قيد التحقيق لعلاج السرطان التي تعتمد إما على تعزيز نشاط الخلايا NK أو زيادة حساسية الخلايا السرطانية للقضاء على الخلايا NK بوساطة. ومع ذلك ، من أجل تطوير هذه النهج العلاجية بشكل فعال ، هناك حاجة أيضًا إلى تحليل فعال من حيث التكلفة في المختبر لرصد السمية الخلوية بوساطة الخلايا في NK والهجرة. هنا، نقدم اثنين من بروتوكولات المختبر التي يمكن أن ترصد بشكل موثوق واستنساخي تأثير السمية الخلوية الخلايا NK على الخلايا السرطانية (أو الخلايا المستهدفة الأخرى). هذه البروتوكولات غير قائمة على النشاط الإشعاعي، وبسيطة الإعداد، ويمكن توسيع نطاقها للفحص عالي الإنتاجية. كما نقدم بروتوكولًا قائمًا على قياس الخلايا للتدفق لمراقبة هجرة خلايا NK بشكل كمي ، والتي يمكن أيضًا توسيع نطاقها للفحص عالي الإنتاجية. بشكل جماعي ، يمكن استخدام هذه البروتوكولات الثلاثة لمراقبة الجوانب الرئيسية لنشاط الخلايا NK الضرورية لقدرة الخلايا على القضاء على الخلايا المستهدفة المختلة.
Introduction
قدرة جسم الإنسان على تحديد غير الذات والقضاء على الأجسام الغريبة هو المفتاح لبقاء الإنسان ضد مسببات الأمراض والأورام الخبيثة1. تلعب الاستجابة المناعية البشرية الدور الأهم في هذه العملية2و3و4. استنادا ً إلى الخصائص والوظائف الرئيسية، يمكن تصنيف الجهاز المناعي البشري على نطاق واسع إلى مجموعتين وظيفيتين رئيسيتين: الجهاز المناعي التكيفي والجهاز المناعي الفطري. نظام المناعة التكيفي هو عادة محددة لمسببات الأمراض معينة ولها الذاكرة المناعية، وبالتالي، هو طويل الأمد وتستجيب لإعادة العدوى في المستقبل من قبل نفس العامل الممرض5،6،7،8،9. وعلى النقيض من ذلك، فإن المناعة الفطرية أوسع بكثير في القضاء على أهدافها وغير محددة نسبيا. لذلك ، عادة ، تعمل الاستجابة المناعية الفطرية كخط أول للدفاع المناعي10. تنتمي الخلايا القاتلة الطبيعية (NK) إلى الجهاز المناعي الفطري وتمثل 10-15٪ من إجمالي الخلايا اللمفاوية المتداولة11. خلايا NK القضاء على الخلايا المستهدفة عن طريق آليتين رئيسيتين. أولا، عند ملزمة للخلايا المستهدفة التي تعبر عن تنشيط ligands، خلايا NK الإفراج عن بروتين البروتين تعطيل الغشاء وحبيبات البروتياز سيرين من خلال exocytosis، والتي تحفز معا المبرمج في الخلايا المستهدفة12،13،14،15. بالإضافة إلى ذلك، تتفاعل خلايا NK التي تعبر عن FasL وعامل النخر المرتبط بالورم في الخلايا العضوية المسببة للإصابة بالخلايا (TRAIL) مع الخلايا المستهدفة التي تعبر عن مستقبلات الموت (Fas/CD95)، مما يؤدي إلى موت الخلايا المبرمج المعتمد على الكاسباس16. والأهم من ذلك، لا تتطلب خلايا NK التحفيز المسبق، مثل عرض المستضد، للقضاء على الخلايا المصابة بمسببات الأمراض أو الخلايا الخبيثة. وهكذا ، فإنها عادة ما تكون في حالة جاهزة للقتل17،18. من أجل منع تطور الورم والتقدم والقضاء على الخلايا السرطانية ، يجب أن تهاجر خلايا NK إلى موقع الورم ، ومرة واحدة في البيئة الدقيقة للورم ، وتحديد الخلايا المستهدفة ومهاجمة.
في الماضي ، تم رصد وظائف المؤثرات الخلايا NK بشكل رئيسي عن طريق إزالة الحبيبات ومقايسة السمية الخلوية19،20،21. NK خلية السمية الخلوية يمكن أيضا أن تقاس 51الكروم الإفراج عن اقهة22،23،24،25. غير أن هذا التناول له بعض المتطلبات المحددة، بما في ذلك الحاجة إلى عداد غاما، وهو قائم على النشاط الإشعاعي، الأمر الذي يتطلب التدريب على مناولة المواد المشعة والتخلص منها ويشكل مستوى من الخطر على المستخدم. ولذلك، تم تطوير العديد من المقالات الجديدة غير القائمة على النشاط الإشعاعي وتوظيفها لدراسة نشاط الخلية NK.
هنا ، ونحن نصف اثنين من هذه البروتوكولات ، والألوان lactic dehydrogenase (LDH) قياس على أساس NK بوساطة خلية اختبار السمية الخلوية وcalcein acetoxymethyl (AM) على أساس تلطيخ طريقة مجهرية لقياس NK خلية بوساطة الخلايا الخلايا القضاء على الخلايا. هذه المقايسات لا تتطلب استخدام النظائر المشعة، وهي مباشرة وحساسة، وتحدد بشكل مستنسخ العوامل التي تعدل وظيفة الخلية NK. بالإضافة إلى ذلك، لأنه لا يمكن تقييم وظيفة الخلية NK بشكل كامل دون رصد التغييرات في ترحيل الخلايا NK، نقدم أيضًا طريقة كمية تستند إلى قياس الخلايا لمراقبة ترحيل الخلايا NK.
Protocol
Representative Results
Discussion
يمكن استخدام طرق السمية الخلوية والهجرة الموصوفة هنا لتقييم سمية خلايا NK للخلايا السرطانية وآليات التهرب المناعي بوساطة الخلايا NK في الأورام الخبيثة ، وكذلك لتحديد العوامل العلاجية التي ستعزز نشاط / وظيفة خلايا NK. البروتوكولات هي بسيطة وحساسة، واستنساخها، والبدائل المفضلة لالكلاسيكية على أساس الإشعاع 51الكروم الإفراج عن النشرات. وقد تم تصميم البروتوكولات خصيصا لتكون قابلة للتكيف بسهولة للاستخدام في معظم المختبرات، مع قراءة مباشرة للألوان، مجهرية، أو المستندة إلى FACS التي يسهل تفسيرها، مما يسمح للباحثين للتوصل إلى استنتاجات موثوق بها. وكلها قابلة للتطوير للنهج القائمة على الفرز عالية الإنتاجية. على الرغم من أن البروتوكولات يتم تقديمها في سياق خط واحد لخلايا الورم الكبدي ، إلا أنه يمكن تكييفها بسهولة مع أنواع الخلايا السرطانية الأخرى و / أو الخلايا الأخرى المستهدفة غير السرطانية.
في حين أن جميع الأساليب المعروضة قوية وقابلة للتكرار ، يمكن أن يحدث الاختلاف بين التجارب مع دفعات مختلفة من الخلايا السرطانية وخلايا NK. ولضمان أن تدعم النتائج بدقة استنتاجات التجارب، يُستحسن تكرار التجربة مرتين على الأقل باستخدام ثلاثيات بيولوجية.
أحد قيود هذا الأسلوب هو أن معدل نمو خلايا NK92MI يمكن أن يكون بطيئاً. ولذلك، بالنسبة للتجارب التي أجريت على 50 عينة أو أكثر، ينبغي زراعة أعداد كافية من NK92MI مسبقاً لمنع التأخير. أيضاً، يجب تنفيذ كافة عناصر التحكم الموضحة في البروتوكولات لتجنب النتائج الزائفة وغير القابلة للتكرار. وثمة قيد آخر لفحص السمية الخلوية NK هو أن نسبة NK إلى الخلايا السرطانية، فضلا عن وقت الحضانة، يجب أن يكون الأمثل لكل خلية الهدف. على سبيل المثال، قمنا باختبار نسب مختلفة من الخلايا السرطانية إلى خلايا NK (1:5 و 1:10 و 1:20 و 1:40 و 1:80) لخطوط الخلايا السرطانية الكبدية، بالإضافة إلى أوقات حضانة متعددة (2 و3 و4 و5 و6 ساعة). بناء على نتائجنا لاحظنا النتائج الأكثر اتساقا مع 1:10 و 1:20 نسب الخلايا السرطانية إلى خلايا NK والحضانة لمدة 3 ساعة.
بالإضافة إلى ذلك ، سوف الخلايا السرطانية المستمدة من الأورام الصلبة نعلق وتنمو على سطح لوحة الثقافة ، في حين أن خلايا NK تنمو في تعليق. إذا كان وقت الحضانة أطول من 3 ساعات ، فمن المستحسن استخدام لوحات المرفقات عالية الكثافة 96 ، مما سيحسن الاتساق والاستنساخ بين التجارب واليكررات البيولوجية. ومن المهم أيضاً ملاحظة أن اختبارات السمية الخلوية الناجمة عن خلايا NK يمكن إجراؤها أيضاً باستخدام خلايا NK الأولية المعزولة عن الخلايا الأحادية النووية في الدم المحيطي (PBMCs). ومع ذلك، هناك العديد من القيود مع مثل هذه التجارب. أولاً، لا يمكن تحجيم هذه التجارب بسهولة كما هو الحال مع خلايا NK92MI. ثانياً، يمكن أن يكون الاختلاف من دفعة إلى دفعة من النشاط السام للخلايا السمية للخلايا NK المعزولة عن الشركات العسكرية والأمنية الخاصة مشكلة من حيث قابلية التكاثر وتفسير النتائج. وبالمثل، يتم وصف خطوط الخلايا NK الإنسان الأخرى في الأدب ويمكن استخدامها في هذه الأنواع من التجارب، بما في ذلك خلايا NKL29; ومع ذلك، على عكس خلايا NK-92MI، خلايا NKL هي IL-2 تعتمد وغير متوفرة تجارياً.
عند النظر في التجارب CALCEIN AM الموصوفة، من المهم أن نلاحظ أن calcein AM لا يزال في الهيئات المبرمج بعد وفاة الخلية30. ولذلك ، ينبغي أن يتم تنفيذ كمية من التلطيخ CALCEIN AM بعناية ، لأنها قد تؤدي إلى التقليل من تقدير سمية CYTotoxic.
على غرار سمية الخلية NK بوساطة، تعديل هجرة الخلايا NK بواسطة السيتوكينات وغيرها من الجيوفيافيانتس يلعب دورا هاما في تنظيم وظيفة الخلية NK. يوفر تحليل هجرة الخلايا NK الموصوفة هنا منصة بسيطة لتقييم هجرة الخلايا NK في سياق التحفيز مثل chemokine أو chemoattractant. ويمكن استخدام هذا الفحص لتقييم العوامل التي يمكن أن تعزز أو تتداخل مع الهجرة الخلايا NK – وبالتالي، تحديد القدرة والكبت من الهجرة الخلايا NK. ويمكن أن تكون هذه الطريقة مفيدة أيضاً في دراسة القدرة التنظيمية لهجرة الخلايا في ناغورني كاراباخ نتيجة للتغيرات الجينية/اللاجينية (الزيادة في التنظيم أو الخفض التنظيمي) أو الناشئة بسبب العلاج من المخدرات.
لقياس ترحيل الخلايا NK بدقة، هناك عدد قليل من الخطوات الهامة التي يجب اتباعها. بالنسبة لجميع التجارب باستخدام متوسطة مكيفة ، من المهم أن تستخدم متوسطة مكيفة مكافئة من كل من ظروف التحكم والعلاج للحصول على قياسات دقيقة. سيتم تنوع وقت الحضانة مع المنقاة الكيميائية النقية والمتوسطة المكيفة. وأخيراً، فإن تحليلات الهجرة العابرة راسخة وتعتبر طريقة ممتازة لتقييم هجرة الخلايا في ناغورني كاراباخ؛ ومع ذلك ، فإن الثقافات الأحادية المتجانسة المستخدمة في المقالات تفتقر إلى علم وظائف الأعضاء المعقد للأنسجة أو حتى الثقافات ثلاثية الأبعاد التي قد تحاكي البيئة الدقيقة للورم بدقة أكبر.
وهكذا ، على الرغم من وجود بعض القيود على الخلايا NK اختبارات السمية الخلويومق الهجرة NK المقدمة في هذه المقالة ، وهذه الاختبارات تنطبق على مجموعة واسعة من الدراسات المناعية ، وبالتالي توفير أساليب هامة وموثوق بها لتقييم الخلية NK وظيفة والعلاجات المناعية التحوير الخلية NK.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نحن نقدر بامتنان المنح المقدمة من المعاهد الوطنية للصحة: R01CA195077-01A1 (NW)، R01CA200919-01 (NW)، و 1R01 CA218008-01A1 (NW). كما نعترف بتمويل وزارة الدفاع W81XWH1910480 وW81XWH-18-1-0069 إلى NW.
Materials
| Absolute counting beads | Thermo Fisher Scientific | C36950 | |
| Alpha-MEM | Sigma-Aldrich | M4256 | |
| Amicon ultra Centrifugal filters | Millipore | UFC900324 | |
| Calcein AM dye | Sigma-Aldrich | 17783 | |
| DMEM | Gibco | 11965-092 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 26140079 | |
| Folic Acid | Sigma-Aldrich | F8758 | |
| Horse Serum | Gibco | 16050114 | |
| L-Glutamine (200 mM) | Gibco | 2530081 | |
| LDH cytotoxic assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 88953 | |
| myo-Inositol | Sigma-Aldrich | I5125 | |
| NK92MI cells | ATCC | CRL-2408 | |
| Opti-MEM | Gibco | 31985070 | |
| Phosphate Buffer Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | P4417 | |
| SKHEP-1 Cells | ATCC | HTB-52 | |
| Transwell permeable chambers | Costar | 3241 | |
| Trypsin EDTA solution | Gibco | 25200056 |
References
- Chiossone, L., Dumas, P. Y., Vienne, M., Vivier, E. Natural killer cells and other innate lymphoid cells in cancer. Nature Reviews Immunology. 18 (11), 671-688 (2018).
- Borghaei, H., Smith, M. R., Campbell, K. S. Immunotherapy of cancer. European Journal of Pharmacology. 625 (1-3), 41-54 (2009).
- Kalbasi, A., Ribas, A. Tumour-intrinsic resistance to immune checkpoint blockade. Nature Reviews Immunology. , (2019).
- Zhang, Q., Cao, X. Epigenetic regulation of the innate immune response to infection. Nature Reviews Immunology. 19 (7), 417-432 (2019).
- Janeway, C. A. The immune system evolved to discriminate infectious nonself from noninfectious self. Immunol Today. 13 (1), 11-16 (1992).
- Natoli, G., Ostuni, R. Adaptation and memory in immune responses. Nature Immunology. 20 (7), 783-792 (2019).
- Cooper, M. D., Alder, M. N. The evolution of adaptive immune systems. Cell. 124 (4), 815-822 (2006).
- Riera Romo, M., Perez-Martinez, D., Castillo Ferrer, C. Innate immunity in vertebrates: an overview. Immunology. 148 (2), 125-139 (2016).
- Sonnenberg, G. F., Hepworth, M. R. Functional interactions between innate lymphoid cells and adaptive immunity. Nature Reviews Immunology. 19 (10), 599-613 (2019).
- Vivier, E., et al. Innate or adaptive immunity? The example of natural killer cells. Science. 331 (6013), 44-49 (2011).
- Shi, F. D., Ljunggren, H. G., La Cava, A., Van Kaer, L. Organ-specific features of natural killer cells. Nature Reviews Immunology. 11 (10), 658-671 (2011).
- Trapani, J. A., Davis, J., Sutton, V. R., Smyth, M. J. Proapoptotic functions of cytotoxic lymphocyte granule constituents in vitro and in vivo. Current Opinion in Immunology. 12 (3), 323-329 (2000).
- Krzewski, K., Strominger, J. L. The killer’s kiss: the many functions of NK cell immunological synapses. Current Opinion in Cell Biology. 20 (5), 597-605 (2008).
- Berke, G. The binding and lysis of target cells by cytotoxic lymphocytes: molecular and cellular aspects. Annual Review of Immunology. 12, 735-773 (1994).
- Abel, A. M., Yang, C., Thakar, M. S., Malarkannan, S. Natural Killer Cells: Development, Maturation, and Clinical Utilization. Frontiers in Immunology. 9, 1869 (2018).
- Zamai, L., et al. Natural killer (NK) cell-mediated cytotoxicity: differential use of TRAIL and Fas ligand by immature and mature primary human NK cells. Journal of Experimental Medicine. 188 (12), 2375-2380 (1998).
- Marcus, A., et al. Recognition of tumors by the innate immune system and natural killer cells. Advances in Immunology. 122, 91-128 (2014).
- Vesely, M. D., Kershaw, M. H., Schreiber, R. D., Smyth, M. J. Natural innate and adaptive immunity to cancer. Annual Review of Immunology. 29, 235-271 (2011).
- Alter, G., Malenfant, J. M., Altfeld, M. CD107a as a functional marker for the identification of natural killer cell activity. Journal of Immunological Methods. 294 (1-2), 15-22 (2004).
- Bryceson, Y. T., et al. A prospective evaluation of degranulation assays in the rapid diagnosis of familial hemophagocytic syndromes. Blood. 119 (12), 2754-2763 (2012).
- Shabrish, S., Gupta, M., Madkaikar, M. A Modified NK Cell Degranulation Assay Applicable for Routine Evaluation of NK Cell Function. Journal of Immunology Research. 2016, 3769590 (2016).
- Pietra, G., et al. Melanoma cells inhibit natural killer cell function by modulating the expression of activating receptors and cytolytic activity. Cancer Research. 72 (6), 1407-1415 (2012).
- Fehniger, T. A., et al. Potential mechanisms of human natural killer cell expansion in vivo during low-dose IL-2 therapy. Journal of Clinical Investigation. 106 (1), 117-124 (2000).
- Brunner, K. T., Mauel, J., Cerottini, J. C., Chapuis, B. Quantitative assay of the lytic action of immune lymphoid cells on 51-Cr-labelled allogeneic target cells in vitro; inhibition by isoantibody and by drugs. Immunology. 14 (2), 181-196 (1968).
- Roder, J. C., et al. A new immunodeficiency disorder in humans involving NK cells. Nature. 284 (5756), 553-555 (1980).
- Byrd, A., Hoffmann, S. C., Jarahian, M., Momburg, F., Watzl, C. Expression analysis of the ligands for the Natural Killer cell receptors NKp30 and NKp44. PLoS One. 2 (12), e1339 (2007).
- Nitahara, A., et al. NKG2D ligation without T cell receptor engagement triggers both cytotoxicity and cytokine production in dendritic epidermal T cells. Journal of Investigative Dermatology. 126 (5), 1052-1058 (2006).
- Gowen, B. G., et al. A forward genetic screen reveals novel independent regulators of ULBP1, an activating ligand for natural killer cells. Elife. 4, e08474 (2015).
- Robertson, M. J., et al. Characterization of a cell line, NKL, derived from an aggressive human natural killer cell leukemia. Experimental Hematology. 24 (3), 406-415 (1996).
- Somanchi, S. S., McCulley, K. J., Somanchi, A., Chan, L. L., Lee, D. A. A Novel Method for Assessment of Natural Killer Cell Cytotoxicity Using Image Cytometry. PLoS One. 10 (10), e0141074 (2015).
