Akışkan Cihazların Mikroskopi ve Akış Sitometrisi ile Birleştirilmesi, Mekansal Ölçekler Arasında Gözenekli Ortamda Mikrobiyal Taşımayı İncelemek
Summary
Çığır açan eğriler (BTC’ler), gözenekli ortamda bakterilerin taşınmasını incelemek için etkili araçlardır. Burada, BTC’ler elde etmek için mikroskopik ve akış sitometrik sayma ile birlikte akışkan cihazlara dayalı araçlar sıyoruz.
Abstract
Mikroorganizmaların gözenekli ortamda taşınması, dağılması ve birikintisi anlamak hidrodinamik, ekoloji ve çevre mühendisliği gibi çeşitli konuları içeren karmaşık bir bilimsel görevdir. Farklı mekansal ölçeklerde gözenekli ortamlarda bakteri taşımacılığının modellanması, bakteri taşımacılığının sonuçlarını daha iyi tahmin etmek için önemlidir, ancak mevcut modeller genellikle laboratuvardan saha koşullarına kadar büyük ölçekte başarısız olur. Burada, gözenekli ortamda iki mekansal ölçekte bakteri naklini incelemek için deneysel araçlar sıyoruz. Bu araçların amacı, şeffaf gözenekli matrislere enjekte edilen bakterilerin makroskopik gözlemlenebilirlerini (çığır açan eğriler veya biriktirme profilleri gibi) elde etmektir. Küçük ölçekte (10-1000 μm), mikroakışkan cihazlar optik video-mikroskopi ve görüntü işleme ile buluşarak çığır açan eğriler elde eder ve aynı zamanda gözenek ölçeğinde tek tek bakteri hücrelerini izler. Daha büyük ölçekte, akış sitometri atılım eğrileri elde etmek için kendi kendine yapılmış bir robot dağıtıcı ile birleştirilir. Bakterilerin akarsuların hiporomakkuşağı gibi karmaşık gözenekli ortamda nasıl taşındığını daha iyi anlamak için bu araçların yararını gösteriyoruz. Bu araçlar ölçekler arasında eşzamanlı ölçümler sağladığından, yükseltme için kritik öneme yönelik mekanizma tabanlı modellerin önünü açıyorlar. Bu araçların uygulanması sadece yeni biyoremediasyon uygulamalarının geliştirilmesine katkıda bulunmakla kalmamış, aynı zamanda gözenekli yüzeyleri kolonize eden mikroorganizmaların ekolojik stratejilerine de yeni bir ışık tutabilir.
Introduction
Gözenekli medya yoluyla mikropların taşınmasını anlamayı amaçlayan çalışmalar esas olarak kontaminasyon endişeleri tarafından tahrik edilmiştir1, hastalık iletimi2 ve biyoremediasyon3. Bu bağlamda bakteriler çoğunlukla taşımamodellerinde 4 partikül olarak ele alınmış ve filtrasyon, gerilme, yerçekimsel yerleşme veya biyofilmlerden yeniden mobilizasyon gibi süreçler mikropların elde tutulması veya taşınmasının sürücüleri olarak tanımlanmıştır5. Ancak, gözenekli manzaralar aracılığıyla bakterilerin taşınması incelenmesi de bu karmaşık ortamlarda başarılarını destekleyen ekolojik stratejiler hakkında bizi bilgilendirebilir. Ancak, bu yeni deneyler ve matematiksel modeller tek hücre, nüfus veya mikrobiyal topluluk düzeyinde çalışma gerektirir.
Akarsu ve nehirlerin hiporomakkuşağında bulunanlar gibi doğal gözenekli ortamlar, biyofilm oluşturan mikropların çeşitli toplulukları tarafından yoğun bir şekilde kolonize edilmektedir6. Biyofilmler sıvı faz7,8bakteri akışı ve böylece taşıma ve dağılım değiştirmek yapılar oluşturur. Gözenek ölçeğinde bakterilerin taşınması gözenekli matris ve hareketlilik ile ilgili dağılım kısıtlı alan durumu bağlıdır daha az yoğun nüfuslu alanlarda kaynaklar için azaltılmış rekabet yoluyla bireysel fitness artırmak için etkili bir yol olabilir. Öte yandan, hareketli bakteriler de gözenekli matris daha izole bölgelere ulaşabilir ve bu alanların genişletilmiş keşif hareketli popülasyonlar için ekolojik fırsatlar sağlayabilir10. Daha büyük mekansal ölçeklerde, biyofilm büyümesi de gözeneklerin (kısmi) tıkanmasına ve böylece, daha kanalize ve heterojen akış koşullarının kurulmasına yol açan akış yollarını yönlendirir11. Bu besin temini ve dağılım kapasitesi, frekans ve mesafe için sonuçları vardır. Tercihli akış, örneğin, sözde “hızlı parça” üretebilir ve hareketli bakteriler bu parça12boyunca yerel akış daha yüksek hızlara ulaşabilirsiniz. Bu, yeni habitatların keşfini artırmanın etkili bir yoludur.
Çeşitli araçlar gözenekli ortamda hareketli ve hareketli olmayan bakterilerin (ve parçacıkların) taşınması çalışmaları için kendilerini boşuna. Sayısal modeller uygulamalar için önemli büyük tahmin kapasiteleri var, ancak genellikle doğal varsayımlar ile sınırlıdır4. Laboratuvar ölçekli deneyler13,14 atılım eğrisi ile birlikte (BTC) modelleme verim15yapışma için bakteri hücre yüzey özelliklerinin önemi önemli anlayışlar sağlamıştır. Tipik olarak, BTC’ler (yani, sabit bir yerde parçacık konsantrasyonu kez serisi) sabit oranlı salınımlar ve deneysel cihazın çıkışında hücre numaralarının ölçümü yoluyla elde edilir. Bu bağlamda, BTC’ler gözenekli matristeki bakterilerin advection-dispersiyon dinamiklerini yansıtır lar ve ek için bir lavabo terimi ile genişletilebilirler. Ancak, BTC’lerin tek başına modelilmesi, taşıma işlemleri için gözenekli substrat veya biyofilmin mekansal organizasyonunun rolünü çözmez. Dağılım veya biriktirme profilleri gibi diğer makroskopik gözlemlenebilirlerin mekansal dağılım veya korunan parçacıklar veya büyüyen topluluklar hakkında önemli bilgiler sağladığı kanıtlanmıştır. Mikroakışkanmikroskop araştırma9,,12,16tarafından gözenekli ortamda taşıma eğitimi sağlayan bir teknolojidir , ve son bir çalışma dışında10, deneysel sistemler genellikle çözünürlük tek bir uzunluk ölçeğine kısıtlanır, yani, gözenek ölçeği veya tüm akışkan cihaz ölçeği.
Burada, farklı ölçeklerde gözenekli manzaralarda hareketli ve hareketli olmayan bakterilerin taşınması nı incelemek için bir dizi kombine yöntem sıyoruz. Gözenek ölçeğinde bakteriyel taşıma gözlemlerini BTC analizi ile daha büyük ölçekte ki bilgilerle birleştiriyoruz. Polidimethylsiloxane (PDMS) kullanılarak yumuşak litografiden üretilen mikroakışkan cihazlar biyo-uyumludur, çeşitli kimyasallara karşı dayanıklıdır, düşük maliyetlerle çoğaltılabilirliğe izin verir ve mikroskobik gözlem için kritik olan düşük otofloresans ın yanı sıra mükemmel optik saydamlık sağlar. PDMS’ye dayalı mikroakışkanlar daha önce basit kanallarda mikropların taşınması nı incelemek için kullanılmıştır17 veya daha karmaşık geometriler12. Ancak, tipik olarak mikroakışkan deneyler kısa vadeli ufuklara odaklanır ve canlı hücrelerin epi-floresan mikroskobik gözlemi genellikle genetiği değiştirilmiş suşlarla sınırlıdır (örn. GFP etiketli suşlar). Burada, pdms tabanlı mikroakışkan cihazları kullanarak, akış sitometrisi ile birlikte poli (metil metakrilat) (PMMA, pleksiglas olarak da bilinir) imal edilen daha büyük cihazlar la birlikte bakteriyel taşımayı incelemek için araçlar salıyoruz. PDMS ve PMMA gaz geçirgenliği ve yüzey özellikleri açısından farklılık gösterir, böylece bakteriyel taşıma yı incelemek için tamamlayıcı fırsatlar sunar. Mikroakışkan cihaz daha kontrollü bir ortam sağlarken, daha büyük cihaz uzun süre ler boyunca deneylere veya doğal bakteri topluluklarına izin verir. PDMS tabanlı mikroakışkan cihazda BTC elde etmek için özel bir alanda yüksek zamansal çözünürlükte mikroskobik sayma kullanılır. PMMA tabanlı cihazdan BTC modellemeiçin hücre sayımları elde etmek için, akış sitometrisi ile birlikte kendi kendine inşa edilmiş otomatik sıvı dağıtıcısı salıyoruz. Bu kurulumda, hücreler akışkan cihazı geçer ve ardışık olarak 96 kuyu plakasına dağıtılır. Zamansal çözünürlük doğru dağıtılabilir minimum hacim ve böylece akışkan cihaz aracılığıyla orta akış hızı ile sınırlıdır. Kuyularda fiksatif büyümeyi önler ve aşağı akış akışı-sitometrik numaralandırma için DNA boyama kolaylaştırır. Taşıma deneyleri sırasında bakteri üremesini önlemek için minimal bir ortam (motilite tamponu olarak adlandırılır) kullanırız.
Farklı ölçeklerde akışkan cihazların hazırlanmasına yönelik protokoller hazır olduğundan, bu tür cihazları üretme tekniklerini kısaca tanıtıyoruz ve btc’leri kaydetmek için deneysel prosedürlere odaklanıyoruz. Benzer şekilde, mikropların akış sitometrik numaralandırması için çeşitli rutinler mevcuttur ve kullanıcılar akış sitometrisi tarafından elde edilen sonuçları yorumlamak için uzman bilgiye ihtiyaç duyarlar. Floresan etiketli hücrelerin BTC’lerini kaydetmek için mikroskobik görüntüleme ile birlikte mikroakışkan cihazların yeni kullanımını rapor ediyoruz. Gözenek ölçeğinde, yerel hızlar ve yörüngeler görüntü işleme yoluyla elde edilir. Ayrıca, bir pmma tabanlı akışkan cihaz akışı-sitometrik sayma ile birlikte gözenekli ortamlarda hareketli ve non-motile hücrelerin bakteriyel taşıma gözlemlemek için bir yerli akım biyofilm tarafından kolonize olduğunu göstermektedir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada mikropların tek hücreli ve popülasyon düzeyinde gözenekli sistemler le taşınmasını incelemek için iki araç öneriyoruz. BTC modelleme sat›nal›n›zla›ş fenomenlerinin incelenmesi, ekosistem ölçeklerinde patojenlerin veya kirleticilerin yay›nt›s›na dair de›f bilgiler sa›rken, laboratuvar deneylerinden saha koşla›ma kadar ölçeklendirme de zorluklar› hala mevcutolmuştur. Burada açıklanan araçlar, araştırmacıların gözenekli ortamlarda taşınması için ilgili mikropların…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Biz robotik dağıtıcı ve dispenser.py komut kurulumu ile Antoine Wiedmer yardım kabul ediyoruz.
Materials
| EDTA | Sigma | ||
| Elastomer Sylgard 184 | Dowsil | 101697 | |
| Flow cytometer NovoCyte | Acea | ||
| Glucose | Sigma | https://www.makeblock.com/project/xy-plotter-robot-kit | |
| LB broth | BD | ||
| Liquid dispenser, XY Plotter Robot Kit | makeblock | ||
| Microscope Axio Imager | Zeiss | ||
| Microscope AxioZoom v16 | Zeiss | ||
| Microscope slides, 75 mm × 25 mm | Corning | ||
| Minipuls 3 peristaltic pump | Gilson | ||
| Plasma bonder Corona SB | BlackHole Lab | ||
| Potassium phosphate | Sigma | ||
| Syringe pump New Era NE 4000 | New Era | ||
| Syto 13 Green Fluorescent Nucleic Acid Stain | Molecular Probes, Invitrogen | ||
| Tygon tubing | Ismatec | ||
| WF31SA universal milling machine | Mikron |
References
- Stevik, K., Aa, K., Ausland, G., Fredrik Hanssen, J. Retention and removal of pathogenic bacteria in wastewater percolating through porous media: a review. Water Research. 38 (6), 1355-1367 (2004).
- Ribet, D., Cossart, P. How bacterial pathogens colonize their hosts and invade deeper tissues. Microbes and Infection. 17 (3), 173-183 (2015).
- Ginn, T. R., Wood, B. D., Nelson, K. E., Scheibe, T. D., Murphy, E. M., Clement, T. P. Processes in microbial transport in the natural subsurface. Advances in Water Resources. 25 (8), 1017-1042 (2002).
- Tufenkji, N. Modeling microbial transport in porous media: Traditional approaches and recent developments. Advances in Water Resources. 30 (6-7), 1455-1469 (2007).
- Foppen, J. W., Van, M. H., Schijven, J. Measuring and modelling straining of Escherichia coli in saturated porous media. Journal of contaminant hydrology. 93 (1-4), 236-254 (2007).
- Battin, T. J., Besemer, K., Bengtsson, M. M., Romani, A. M., Packmann, A. I. The ecology and biogeochemistry of stream biofilms. Nature Reviews Microbiology. 14 (4), 251-263 (2016).
- Scheidweiler, D., Peter, H., Pramateftaki, P., Anna, P., de Battin, T. J. Unraveling the biophysical underpinnings to the success of multispecies biofilms in porous environments. The ISME Journal. 1, (2019).
- Carrel, M., et al. Biofilms in 3D porous media: Delineating the influence of the pore network geometry, flow and mass transfer on biofilm development. Water Research. 134, 280-291 (2018).
- Bhattacharjee, T., Datta, S. S. Bacterial hopping and trapping in porous media. Nature Communications. 10 (1), 2075 (2019).
- Scheidweiler, D., Miele, F., Peter, H., Battin, T. J., de Anna, P. Trait-specific dispersal of bacteria in heterogeneous porous environments: from pore to porous medium scale. Journal of The Royal Society Interface. 17 (164), 20200046 (2020).
- Morales, V. L., Parlange, J. Y., Steenhuis, T. S. Are preferential flow paths perpetuated by microbial activity in the soil matrix? A review. Journal of Hydrology. 393 (1), 29-36 (2010).
- Creppy, A., Clément, E., Douarche, C., D’Angelo, M. V., Auradou, H. Effect of motility on the transport of bacteria populations through a porous medium. Physical Review Fluids. 4 (1), 013102 (2019).
- Camesano, T. A., Logan, B. E. Influence of Fluid Velocity and Cell Concentration on the Transport of Motile and Nonmotile Bacteria in Porous Media. Environmental Science & Technology. 32 (11), 1699-1708 (1998).
- Lutterodt, G., Basnet, M., Foppen, J. W. A., Uhlenbrook, S. The effect of surface characteristics on the transport of multiple Escherichia coli isolates in large scale columns of quartz sand. Water Research. 43 (3), 595-604 (2009).
- Bozorg, A., Gates, I. D., Sen, A. Impact of biofilm on bacterial transport and deposition in porous media. Journal of Contaminant Hydrology. 183 (Supplement C), 109-120 (2015).
- Long, T., Ford, R. M. Enhanced Transverse Migration of Bacteria by Chemotaxis in a Porous T-Sensor. Environmental Science & Technology. 43 (5), 1546-1552 (2009).
- Rusconi, R., Garren, M., Stocker, R. Microfluidics Expanding the Frontiers of Microbial Ecology. Annual Review of Biophysics. 43 (1), 65-91 (2014).
- Xia, Y., Whitesides, G. M. Soft Lithography. Annual Review of Materials Science. 28 (1), 153-184 (1998).
- Crocker, J. C., Grier, D. G. Methods of Digital Video Microscopy for Colloidal Studies. Journal of Colloid and Interface Science. 179 (1), 298-310 (1996).
- del Giorgio, P. A., Bird, D. F., Prairie, Y. T., Planas, D. Flow cytometric determination of bacterial abundance in lake plankton with the green nucleic acid stain SYTO 13. Limnology and Oceanography. 41 (4), 783-789 (1996).
