Объединение жидкостных устройств с микроскопией и цитометрией потока для изучения микробного транспорта в пористых средствах массовой информации через пространственные весы

Исследования, направленные на понимание транспортировки микробов через пористые средства массовой информации в основном были^{обусловлены опасениями загрязнения 1},^{передачи болезни 2} и биовосстановления³. В этой связи бактерии в основном рассматриваются как частицы в^{транспортных моделях 4} и такие процессы, как фильтрация, напряжение, гравитационное оседают или ремобилизации из биопленки были определены в качестве драйверов удержания или транспортировки^{микробов 5}. Тем не менее, изучение транспортировки бактерий через пористые ландшафты может также информировать нас об экологических стратегиях, лежащих в основе их успеха в этих сложных средах. Тем не менее, это требует новых экспериментов и математических моделей, работающих на уровне одной клетки, популяции или микробного сообщества.

Природные пористые среды, такие как те, которые находятся в гипорхейской зоне ручьев и рек, плотно колонизированы различными сообществами биопленообразующих^{микробов 6.} Биопленки образуют структуры, которые изменяют поток и, таким образом, транспортировку и рассеивание бактерий в жидкой^{фазе 7,,8.} Транспортировка бактерий в поровом масштабе зависит от ограниченной доступности пространства в пористой матрице, и рассеивание, связанное с подвижностью, может быть эффективным способом повышения физической подготовки отдельных людей за счет снижения конкуренции за ресурсы в менее густонаселенных районах. С другой стороны, подвижные бактерии могут также достигать более изолированных областей пористой матрицы и расширенное исследование таких районов может обеспечить экологические возможности для подвижной^{популяции 10}. В больших пространственных масштабах рост биопленки отвлекает пути потока, также ведущие к (частичному) засорему пор и, таким образом, к созданию еще более ченнелингов и неоднородных^{условий потока 11.} Это имеет последствия для способности к поставкам и рассеиванию питательных веществ, частоте и расстоянию. Преференциальный поток, например, может генерировать так называемые “быстрые треки” и пестрые бактерии могут достигать еще более высоких скоростей, чем локальный поток вдоль этих^{треков 12}. Это эффективный способ увеличить разведку новых мест обитания.

Различные инструменты используются для изучения транспортировки пестрых и недвижимых бактерий (и частиц) в пористых средствах массовой информации. Численные модели имеют большие прогностический потенциал, важный для приложений, однако часто ограничены присущими^{предположениям 4.} Лабораторные эксперименты¹³,^{14 в}сочетании с прорывом кривой (BTC) моделирования предоставили важные идеи в важности бактериальных свойств поверхности клеток для прилипания^{эффективности 15}. Как правило, БТК (т.е. серия времени концентрации частиц в фиксированном месте) получаются с помощью постоянных выбросов скорости и измерения числа клеток при оттоке экспериментального устройства. В этом контексте БТК отражают динамику дисперсии бактерий в пористой матрице и могут быть расширены термином раковины, учитывая привязанность. Однако моделирование БТР само по себе не решает роли пространственной организации пористого субстрата или биопленки для транспортных процессов. Было доказано, что другие макроскопические наблюдаемые факторы, такие как дисперсия или профили осаждения, предоставляют важную информацию о пространственном распределении или сохраненных частицах или растущих сообществах. Микрофлюиды это технология, которая позволяет изучать транспорт в пористых средствах^{массовой информации с помощью микроскопии исследования 9,12,16}, и за^{исключением недавней работы 10}, экспериментальные системы, как правило, ограничены одной шкале длины разрешения, то есть, поры масштаба или всей жидкости масштаба устройства.

Здесь мы представляем набор комбинированных методов для изучения транспортировки подвижных и немостоялых бактерий в пористых ландшафтах в различных масштабах. Мы сочетаем наблюдения за бактериальным транспортом в поровом масштабе с информацией в более широком масштабе с помощью анализа BTC. Микрофлюидные устройства, построенные из мягкой литографии с использованием полидиметилсилоксана (PDMS), биосовместимы, устойчивы к ряду химических веществ, позволяют воспроизводиться при низких затратах и обеспечивают отличную оптическую прозрачность, а также низкую аутофторесценцию, критически важную для микроскопических наблюдений. Микрофлюиды на основе PDMS ранее использовались для изучения транспортировки микробов в простых^{каналах 17} или в более сложных геометриях^12. Тем не менее, как правило, эксперименты микрофлюиды сосредоточиться на краткосрочных горизонтов и эпи-флуоресценции микроскопического наблюдения живых клеток, как правило, ограничивается генетически модифицированных штаммов (например, GFP-тегами штаммов). Здесь мы представляем инструменты для изучения бактериального транспорта с использованием микрофлюидных устройств на основе PDMS в сочетании с микроскопией и более крупными устройствами, изготовленными из поли (метил-метакрилата) (PMMA, также известного как плексиглас) в сочетании с цитометрией потока. PDMS и PMMA отличаются проницаемостью газа и поверхностными свойствами, тем самым предоставляя дополнительные возможности для изучения бактериального транспорта. В то время как микрофлюидное устройство обеспечивает более контролируемую среду, более крупное устройство позволяет проводить эксперименты в течение длительных периодов времени или с использованием естественных бактериальных сообществ. Микроскопия, подсчитываемая при высоком временном разрешении в выделенной области, используется для получения BTC в микрофлюидных устройствах на основе PDMS. Чтобы получить количество ячеев для моделирования BTC с устройства на основе PMMA, мы вводим самосконструируемый автоматизированный жидкий дозатор в сочетании с цитометрией потока. В этой установке, клетки проходят жидкостное устройство и последовательно распределяется в 96 пластин хорошо. Временное разрешение ограничено минимальным объемом, который можно точно распределить, и, таким образом, средней скоростью потока через жидкое устройство. Фиксация в скважинах предотвращает рост и облегчает окрашивание ДНК для нисходящего потока-цитометрического перечисления. Для предотвращения роста бактерий в ходе транспортных экспериментов мы используем минимальную среду (такую же подвижность буфера).

Поскольку протоколы по подготовке жидкостных устройств в различных масштабах легко доступны, мы лишь кратко вводим методы производства таких устройств и, скорее, сосредоточиваемся на экспериментальных процедурах записи БТК. Аналогичным образом существуют различные процедуры для цитометрического перечисления потока микробов, и пользователи требуют экспертных знаний для интерпретации результатов, полученных с помощью цитометрии потока. Мы сообщаем о новой использовании микрофлюидных устройств в сочетании с микроскопической визуализацией для записи БТК клеток с флуоресцентными тегами. В поровом масштабе локальные скорости и траектории получаются с помощью обработки изображений. Кроме того, мы демонстрируем использование жидкого устройства на основе PMMA в сочетании с потоко-цитометрическим подсчетом для наблюдения за бактериальной транспортировкой подвижных и недвижимых клеток в пористых средах, колонизированных биопленкой родного потока.