Combinazione di dispositivi fluidici con microscopia e citometria di flusso per studiare il trasporto microbico nei mezzi porosi attraverso le scale spaziali

Gli studi volti a comprendere il trasporto di microbi attraverso mezzi porosi sono stati principalmente guidati da^{preoccupazioni di contaminazione 1,}trasmissione della^{malattia 2} e biorimediazione³. A questo proposito, i batteri sono stati per lo più trattati come particelle nei^{modelli di trasporto 4} e processi come filtrazione, deformazione, sedimentazione gravitazionale o rimobilitazione da biofilm sono stati identificati come fattori di ritenzione o trasporto di microbi⁵. Tuttavia, studiare il trasporto di batteri attraverso paesaggi porosi può anche informarci sulle strategie ecologiche alla base del loro successo in questi ambienti complessi. Tuttavia, ciò richiede nuovi esperimenti e modelli matematici che operano a livello di singola cellula, popolazione o comunità microbica.

Gli ambienti porosi naturali, come quelli che si trovano nella zona iporeica di torrenti e fiumi, sono densamente colonizzati da diverse comunità di microbi biofilm-forming⁶. I biofilm formano strutture che modificano il flusso e quindi il trasporto e la dispersione dei batteri nella fase^{liquida 7,,8}. Il trasporto di batteri su scala porosa dipende dalla limitata disponibilità di spazio nella matrice porosa e la dispersione legata alla motilità può essere un modo efficace per aumentare l’idoneità individuale attraverso una ridotta competizione per le risorse nelle aree meno densamente popolate. D’altra parte, i batteri motili possono anche raggiungere regioni più isolate della matrice porosa e l’esplorazione estesa di tali aree può fornire opportunità ecologiche alle popolazioni mobile¹⁰. Su scale spaziali più grandi, la crescita del biofilm devia i percorsi di flusso portando anche all’intasamento (parziale) dei pori e, quindi, alla creazione di condizioni di flusso ancora più canalizzate ed eterogenee^11. Ciò ha conseguenze per l’approvvigionamento di nutrienti e la capacità di dispersione, la frequenza e la distanza. Il flusso preferenziale, ad esempio, può generare le cosiddette “corsie preferenziali” e i batteri motili possono raggiungere velocità ancora più elevate rispetto al flusso locale^{lungo questi binari 12}. Questo è un modo efficace per aumentare l’esplorazione di nuovi habitat.

Una varietà di strumenti si avvale dello studio del trasporto di batteri (e particelle) mobile e non mobile in mezzi porosi. I modelli numerici hanno grandi capacità predittive importanti per le applicazioni, tuttavia sono spesso limitati da ipotesi intrinseche⁴. Gli esperimenti su scala^{di laboratorio 13,,14} combinati con la modellazione della curva di svolta (BTC) hanno fornito importanti spunti sull’importanza delle proprietà della superficie cellulare batterica per l’efficienza dell’incollaggio¹⁵. Tipicamente, i BTC (cioè, serie volte serie di concentrazione di particelle in un luogo fisso) sono ottenuti attraverso rilasci a velocità costante e misurazione del numero di cellule al deflusso del dispositivo sperimentale. In questo contesto, i BTC riflettono la dinamica di advezione-dispersione dei batteri nella matrice porosa e possono essere estesi da un termine di affondamento che rappresenta l’attaccamento. Tuttavia, la modellazione dei BTC da sola non risolve il ruolo dell’organizzazione spaziale del substrato poroso o del biofilm per i processi di trasporto. Altri osservabili macroscopici come la dispersività o i profili di deposizione hanno dimostrato di fornire informazioni importanti sulla distribuzione spaziale o sulle particelle trattenute o sulle comunità in crescita. La microfluidica è una tecnologia che consente di studiare il trasporto in mezzi porosi mediante indagine di microscopia^9,12,16, e ad eccezione di un recente lavoro¹⁰, i sistemi sperimentali sono tipicamente vincolati a una singola scala di lunghezza di risoluzione, cioè la scala dei pori o l’intera scala del dispositivo fluido.

Qui, introduciamo una suite di metodi combinati per studiare il trasporto di batteri motili e non motili in paesaggi porosi su diverse scale. Combiniamo le osservazioni del trasporto batterico su scala dei pori con informazioni su larga scala, attraverso l’analisi BTC. I dispositivi microfluidici costruiti con litografia morbida utilizzando polidimetilsilossano (PDMS) sono bio-compatibili, resistenti a una vasta gamma di sostanze chimiche, consentono la replicabilità a bassi costi e forniscono un’eccellente trasparenza ottica e una bassa autofluorescenza critica per l’osservazione microscopica. La microfluidica a base di PDMS è stata precedentemente utilizzata per studiare il trasporto di microbi in^{canali semplici 17} o in geometrie più complesse¹². Tuttavia, tipicamente gli esperimenti di microfluidica si concentrano su orizzonti a breve termine e l’osservazione microscopica dell’epi-fluorescenza delle cellule viventi è comunemente limitata a ceppi geneticamente modificati (ad esempio, ceppi taggati dalla GFP). Qui presentiamo strumenti per studiare il trasporto batterico utilizzando dispositivi microfluidici basati su PDMS in combinazione con microscopia e dispositivi più grandi fabbricati da poli (metacrilato metile) (PMMA, noto anche come plexiglass) in combinazione con citometria a flusso. PDMS e PMMA differiscono per permeabilità al gas e proprietà superficiali, offrendo così opportunità complementari per studiare il trasporto batterico. Mentre il dispositivo microfluidico fornisce un ambiente più controllato, il dispositivo più grande consente esperimenti per lunghi periodi di tempo o utilizzando comunità batteriche naturali. Il conteggio delle microscopie ad alta risoluzione temporale in un’area dedicata viene utilizzato per ottenere BTC nel dispositivo microfluidico basato su PDMS. Per ottenere il conteggio delle celle per la modellazione BTC dal dispositivo basato su PMMA, introduciamo un distributore automatico di liquidi autocostruito in combinazione con la citometria a flusso. In questa configurazione, le cellule passano il dispositivo fluido e vengono erogate consecutivamente in 96 piastre di pozzo. La risoluzione temporale è limitata dal volume minimo che può essere accuratamente eroso e quindi dalla portata media attraverso il dispositivo fluido. Il fissatore nei pozzi previene la crescita e facilita la colorazione del DNA per l’enumerazione citometrica a flusso a valle. Per prevenire la crescita batterica durante gli esperimenti di trasporto utilizziamo un mezzo minimo (termo buffer di motilità).

Poiché i protocolli per la preparazione di dispositivi fluidici su scale diverse sono prontamente disponibili, introduciamo solo brevemente le tecniche per produrre tali dispositivi e ci concentriamo piuttosto sulle procedure sperimentali per registrare i BTC. Allo stesso modo, esistono varie routine per l’enumerazione citometrica del flusso dei microbi e gli utenti richiedono conoscenze esperte per interpretare i risultati ottenuti dalla citometria del flusso. Reportiamo il nuovo uso di dispositivi microfluidici in combinazione con l’imaging microscopico per registrare I BTC di cellule con tag fluorescenti. Alla scala dei pori, le velocità e le traiettorie locali si ottengono attraverso l’elaborazione delle immagini. Inoltre, dimostriamo l’uso di un dispositivo fluido a base di PMMA in combinazione con il conteggio flusso-citometrico per osservare il trasporto batterico di cellule mobili e non mobili in ambienti porosi colonizzati da un biofilm a flusso nativo.