שילוב התקנים נוזליים עם מיקרוסקופיה וציתום זרימה לחקר תחבורה מיקרוביאלית במדיה נקבובית על פני קשקשים מרחביים
Summary
עקומות פורצות דרך (BTCs) הן כלים יעילים לחקר הובלת חיידקים במדיה נקבובית. כאן אנו מציגים כלים המבוססים על התקנים נוזליים בשילוב עם מיקרוסקופיה וספירת ציטומטרית זרימה כדי להשיג BTCs.
Abstract
הבנת ההובלה, הפיזור והתצהיר של מיקרואורגניזמים במדיה נקבובית היא משימה מדעית מורכבת הכוללת נושאים מגוונים כמו הידרודינמיקה, אקולוגיה והנדסה סביבתית. מידול תחבורה חיידקית בסביבות נקבוביות בקנה מידה מרחבי שונה הוא קריטי כדי לחזות טוב יותר את ההשלכות של תחבורה חיידקים, עדיין מודלים נוכחיים לעתים קרובות להיכשל בקנה מידה ממעבדה לתנאי שדה. כאן, אנו מציגים כלים ניסיוניים לחקר תחבורה חיידקית במדיה נקבובי בשני קשקשים מרחביים. מטרתם של כלים אלה היא להשיג התבוננות מאקרוסקופית (כגון עקומות פורצות דרך או פרופילי תצהיר) של חיידקים המוזרקים למטריצות נקבוביות שקופות. בקנה מידה קטן (10-1000 μm), התקנים מיקרו-נוזלים משולבים עם וידאו אופטי-מיקרוסקופי ועיבוד תמונה כדי להשיג עקומות פורצות דרך, ו, באותו זמן, כדי לעקוב אחר תאים חיידקיים בודדים בקנה המידה הנקבוביות. בקנה מידה גדול יותר, ציתום זרימה משולב עם מתקן רובוטי מעשה עצמי כדי להשיג עקומות פורצות דרך. אנו ממחישים את התועלת של כלים אלה כדי להבין טוב יותר כיצד חיידקים מועברים במדיה נקבובי מורכבת כגון האזור hyporheic של נחלים. מכיוון שכלים אלה מספקים מדידות בו-זמנית על-פני סולמות, הם סוללים את הדרך למודלים מבוססי מנגנון, החשובים ביותר לצורך upscaling. יישום של כלים אלה עשוי לא רק לתרום לפיתוח יישומים חדשניים לשיקום ביולוגי, אלא גם לשפוך אור חדש על האסטרטגיות האקולוגיות של מיקרואורגניזמים ליישב מצעים נקבוביים.
Introduction
מחקרים שמטרתם להבין את ההובלה של חיידקים באמצעות מדיה נקבובית היו מונעים בעיקר עלידי חששות של זיהום 1, השידור של מחלה2 ותיקון ביולוגי3. בהקשר זה, חיידקים טופלו בעיקר כחלקיקים במודליםתחבורה 4 ותהליכים כגון סינון, מאמץ, יישוב כבידתי או remobilization מ biofilms זוהו כנהגים של שמירה או הובלה של חיידקים5. עם זאת, לימוד התחבורה של חיידקים באמצעות נופים נקבוביים יכול גם ליידע אותנו על האסטרטגיות האקולוגיות שבבסיס הצלחתם בסביבות מורכבות אלה. עם זאת, זה דורש ניסויים חדשניים ומודלים מתמטיים הפועלים ברמת התא היחיד, האוכלוסייה או הקהילה המיקרוביאלית.
סביבות נקבוביות טבעיות, כגון אלה שנמצאו באזור ההיפורי של נחלים ונהרות, מתיישבות בצפיפות על ידי קהילות מגוונות של חיידקים יוצרי ביופילם6. Biofilms יוצרים מבנים המ משנים את הזרימה ולכן הובלה ופיזור של חיידקים בשלבנוזלי 7,8. הובלת חיידקים בקנה מידה נקבוביות תלויה בזמינות החלל מוגבלת במטריקס נקבובי ופיזור הקשורות לתנוניות עשוי להיות דרך יעילה כדי להגדיל את הכושר הפרט באמצעות תחרות מופחתת על משאבים באזורים מאוכלסים פחות בצפיפות. מצד שני, חיידקים מוטיב יכולים גם להגיע לאזורים מבודדים יותר של המטריצה הנקבובית, והחקירה המורחבת של אזורים כאלה עשויה לספק הזדמנויות אקולוגיות לאוכלוסיות10. בקנה מידה מרחבי גדול יותר, צמיחת biofilm מסיט את נתיבי הזרימה גם מוביל (חלקי) סתימת נקבוביות, ובכך, להקמת תנאי זרימה מתועלים והטרוגנייםעוד יותר 11. זה יש השלכות על אספקת חומרים מזינים וקיבולת פיזור, תדירות ומרחק. זרימה מועדף, למשל, יכול ליצור מה שנקרא “מסלולים מהירים” וחיידקים מוטיב יכולים להגיע למהילות גבוהות עוד יותר מאשר הזרימה המקומיתלאורך מסלולים אלה 12. זוהי דרך יעילה להגביר את חקר בתי גידול חדשניים.
מגוון כלים מועילים לחקר הובלת חיידקים צייתנים ולא מוטיבים (וחלקיקים) במדיה נקבובית. מודלים מספריים יש יכולות חיזוי גדול חשוב עבור יישומים, עם זאת מוגבלים לעתים קרובות על ידי הנחות הטבועות4. ניסויים בקנה מידהמעבדה 13,14 בשילוב עם מידול עקומה פריצת דרך (BTC) סיפקו תובנות חשובות בחשיבות של תכונות פני תא חיידקי עבורדבק יעילות 15. בדרך כלל, BTCs (כלומר, סדרת פעמים של ריכוז חלקיקים במיקום קבוע) מתקבלים באמצעות מהדורות קצב קבוע ומדידה של מספרי תאים בזרימה של המכשיר הניסיוני. בהקשר זה, BTCs משקפים את הדינמיקה של אדו-פיזור חיידקים במטריקס הנקבובי ותורחב על ידי מונח כיור חשבונאות עבור קובץ מצורף. עם זאת, מידול של BTCs לבד אינו פותר את התפקיד של ארגון מרחבי של המצע נקבובי או biofilm עבור תהליכי תחבורה. נצפים מאקרוסקופיים אחרים כמו פרופילי פיזור או תצהיר הוכחו כמספקים מידע חשוב על ההתפלגות המרחבית או על החלקיקים השמורים או על הקהילות הגדלות. מיקרו-נוזלים היא טכנולוגיה המאפשרת לימוד תחבורה במדיה נקבובית על ידיחקירת מיקרוסקופ 9,12,16, וחוץמעבודה אחרונה 10, מערכות ניסיוניות מוגבלות בדרך כלל בקנה מידה אורך אחד של רזולוציה, כל כך, סולם הנקבוביות או סולם המכשיר הנוזלי כולו.
כאן, אנו מציגים סוויטה של שיטות משולבות כדי ללמוד את ההובלה של חיידקים מוטיב ולא מוטיב בנופים נקבוביים בקנה מידה שונים. אנו משלבים תצפיות של תחבורה חיידקית בקנה מידה נקבוביות עם מידע בקנה מידה גדול יותר, באמצעות ניתוח BTC. התקנים מיקרו-נוזלים הבנויים מליתוגרפיה רכה באמצעות פולידימטילסילוקסן (PDMS) תואמים ביולוגית, עמידים בפני מגוון כימיקלים, מאפשרים שכפול בעלויות נמוכות ומספקים שקיפות אופטית מצוינת, כמו גם פלואורסצינטי נמוך קריטי לתצפית מיקרוסקופית. מיקרו-נוזלים המבוססים על PDMS שימשו בעבר לחקר ההובלה של חיידקים בערוצים פשוטים17 או בגיאומטריות מורכבות יותר12. עם זאת, בדרך כלל ניסויים מיקרו-נוזלים מתמקדים באופקים לטווח קצר והתבוננות מיקרוסקופית אפינפרין-פלואורסצי של תאים חיים מוגבלת בדרך כלל זנים מהונדסים גנטית (למשל, זנים מתויגים GFP). כאן אנו מציגים כלים לחקר תחבורה חיידקית באמצעות התקנים מיקרו-נוזלים מבוססי PDMS בשילוב עם מיקרוסקופיה והתקנים גדולים יותר מפוברקים מפולי (מתיל methacrylate) (PMMA, המכונה גם פרספקס) בשילוב עם ציתום זרימה. PDMS ו PMMA שונים חחלנות גז ומאפייני פני השטח, ובכך מתן הזדמנויות משלימות ללמוד תחבורה חיידקים. בעוד המכשיר microfluidic מספק סביבה מבוקרת יותר, המכשיר הגדול מאפשר ניסויים על פני פרקי זמן ממושכים או באמצעות קהילות חיידקים טבעיים. ספירת מיקרוסקופים ברזולוציה זמנית גבוהה באזור ייעודי משמשת להשגת BTC בהתקן מיקרו-נוזלים מבוסס PDMS. כדי להשיג ספירות תאים עבור מידול BTC מהתקן מבוסס PMMA, אנו מציגים מתקן נוזלי אוטומטי שנבנה באופן עצמאי בשילוב עם ציתום זרימה. בהתקנה זו, תאים לעבור את המכשיר הנוזלי והם מחולקים ברצף לתוך 96 צלחות באר. רזולוציית הזמן מוגבלת על ידי נפח מינימלי שניתן לחלק במדויק ולכן קצב הזרימה הבינוני דרך המכשיר הנוזלי. קיבעון בארות מונע צמיחה ומקל על כתמי DNA לתפיכת זרימה-ציטומטרית במורד הזרם. כדי למנוע צמיחה חיידקית במהלך ניסויי תחבורה אנו משתמשים במדיום מינימלי (מוזמן מאגר תנועתיות).
מאז פרוטוקולים להכנת התקנים נוזליים בקנה מידה שונים זמינים, אנו רק לזמן קצר להציג את הטכניקות כדי לייצר מכשירים כאלה ולא להתמקד בהליכים ניסיוניים כדי להקליט BTCs. באופן דומה, שגרות שונות קיימות עבור תקרת זרימה ציטוטית של חיידקים ומשתמשים דורשים ידע מומחה כדי לפרש תוצאות שהושגו על ידי ציטומטריית זרימה. אנו מדווחים על השימוש החדשני במכשירים מיקרו-נוזלים בשילוב עם הדמיה מיקרוסקופית כדי להקליט BTCs של תאים מתויגים פלורסנט. בסולם הנקבוביות, מהומות מקומיות ומסלולים מתקבלים באמצעות עיבוד תמונה. יתר על כן, אנו מדגימים את השימוש במכשיר נוזלי מבוסס PMMA בשילוב עם זרימה-ציטומטרית ספירה כדי לצפות הובלה חיידקים של תאים מוטיב ולא מוטיב בסביבות נקבוביות התיישבו על ידי biofilm זרם מקורי.
Protocol
Representative Results
Discussion
כאן אנו מציעים שני אמצעים ללמוד את ההובלה של חיידקים באמצעות מערכות נקבוביות ברמת תא יחיד ואוכלוסייה. בעוד המחקר של תופעות תחבורה באמצעות מידול BTC סיפק תובנות יקרות ערך להתפשטות של פתוגנים או מזהמים בקנה מידה של המערכת האקולוגית, קשיים בקנה מידה מניסויי מעבדה לתנאי שדה עדיין קיימים. הכלים…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מכירים את עזרתו של אנטואן וידמר עם ההתקנה של המתקן הרובוטי dispenser.py תסריט.
Materials
| EDTA | Sigma | ||
| Elastomer Sylgard 184 | Dowsil | 101697 | |
| Flow cytometer NovoCyte | Acea | ||
| Glucose | Sigma | https://www.makeblock.com/project/xy-plotter-robot-kit | |
| LB broth | BD | ||
| Liquid dispenser, XY Plotter Robot Kit | makeblock | ||
| Microscope Axio Imager | Zeiss | ||
| Microscope AxioZoom v16 | Zeiss | ||
| Microscope slides, 75 mm × 25 mm | Corning | ||
| Minipuls 3 peristaltic pump | Gilson | ||
| Plasma bonder Corona SB | BlackHole Lab | ||
| Potassium phosphate | Sigma | ||
| Syringe pump New Era NE 4000 | New Era | ||
| Syto 13 Green Fluorescent Nucleic Acid Stain | Molecular Probes, Invitrogen | ||
| Tygon tubing | Ismatec | ||
| WF31SA universal milling machine | Mikron |
References
- Stevik, K., Aa, K., Ausland, G., Fredrik Hanssen, J. Retention and removal of pathogenic bacteria in wastewater percolating through porous media: a review. Water Research. 38 (6), 1355-1367 (2004).
- Ribet, D., Cossart, P. How bacterial pathogens colonize their hosts and invade deeper tissues. Microbes and Infection. 17 (3), 173-183 (2015).
- Ginn, T. R., Wood, B. D., Nelson, K. E., Scheibe, T. D., Murphy, E. M., Clement, T. P. Processes in microbial transport in the natural subsurface. Advances in Water Resources. 25 (8), 1017-1042 (2002).
- Tufenkji, N. Modeling microbial transport in porous media: Traditional approaches and recent developments. Advances in Water Resources. 30 (6-7), 1455-1469 (2007).
- Foppen, J. W., Van, M. H., Schijven, J. Measuring and modelling straining of Escherichia coli in saturated porous media. Journal of contaminant hydrology. 93 (1-4), 236-254 (2007).
- Battin, T. J., Besemer, K., Bengtsson, M. M., Romani, A. M., Packmann, A. I. The ecology and biogeochemistry of stream biofilms. Nature Reviews Microbiology. 14 (4), 251-263 (2016).
- Scheidweiler, D., Peter, H., Pramateftaki, P., Anna, P., de Battin, T. J. Unraveling the biophysical underpinnings to the success of multispecies biofilms in porous environments. The ISME Journal. 1, (2019).
- Carrel, M., et al. Biofilms in 3D porous media: Delineating the influence of the pore network geometry, flow and mass transfer on biofilm development. Water Research. 134, 280-291 (2018).
- Bhattacharjee, T., Datta, S. S. Bacterial hopping and trapping in porous media. Nature Communications. 10 (1), 2075 (2019).
- Scheidweiler, D., Miele, F., Peter, H., Battin, T. J., de Anna, P. Trait-specific dispersal of bacteria in heterogeneous porous environments: from pore to porous medium scale. Journal of The Royal Society Interface. 17 (164), 20200046 (2020).
- Morales, V. L., Parlange, J. Y., Steenhuis, T. S. Are preferential flow paths perpetuated by microbial activity in the soil matrix? A review. Journal of Hydrology. 393 (1), 29-36 (2010).
- Creppy, A., Clément, E., Douarche, C., D’Angelo, M. V., Auradou, H. Effect of motility on the transport of bacteria populations through a porous medium. Physical Review Fluids. 4 (1), 013102 (2019).
- Camesano, T. A., Logan, B. E. Influence of Fluid Velocity and Cell Concentration on the Transport of Motile and Nonmotile Bacteria in Porous Media. Environmental Science & Technology. 32 (11), 1699-1708 (1998).
- Lutterodt, G., Basnet, M., Foppen, J. W. A., Uhlenbrook, S. The effect of surface characteristics on the transport of multiple Escherichia coli isolates in large scale columns of quartz sand. Water Research. 43 (3), 595-604 (2009).
- Bozorg, A., Gates, I. D., Sen, A. Impact of biofilm on bacterial transport and deposition in porous media. Journal of Contaminant Hydrology. 183 (Supplement C), 109-120 (2015).
- Long, T., Ford, R. M. Enhanced Transverse Migration of Bacteria by Chemotaxis in a Porous T-Sensor. Environmental Science & Technology. 43 (5), 1546-1552 (2009).
- Rusconi, R., Garren, M., Stocker, R. Microfluidics Expanding the Frontiers of Microbial Ecology. Annual Review of Biophysics. 43 (1), 65-91 (2014).
- Xia, Y., Whitesides, G. M. Soft Lithography. Annual Review of Materials Science. 28 (1), 153-184 (1998).
- Crocker, J. C., Grier, D. G. Methods of Digital Video Microscopy for Colloidal Studies. Journal of Colloid and Interface Science. 179 (1), 298-310 (1996).
- del Giorgio, P. A., Bird, D. F., Prairie, Y. T., Planas, D. Flow cytometric determination of bacterial abundance in lake plankton with the green nucleic acid stain SYTO 13. Limnology and Oceanography. 41 (4), 783-789 (1996).
