Het combineren van fluidic devices met microscopie en flow cytometrie om microbiële transporten te bestuderen in poreuze media over ruimtelijke schalen

Studies die gericht zijn op het begrijpen van het vervoer van microben via poreuze media zijn voornamelijk veroorzaakt door bezorgdheid over besmetting¹, de overdracht van ziekte² en bioremediatie³. In dit verband zijn bacteriën meestal behandeld als deeltjes in transportmodellen⁴ en zijn processen zoals filtratie, overbelasting, gravitatieregeling of hermobilisatie van biofilms geïdentificeerd als aanjagers van retentie of transport van microben⁵. Het bestuderen van het transport van bacteriën door poreuze landschappen kan ons echter ook informeren over de ecologische strategieën die hun succes in deze complexe omgevingen ondersteunen. Toch vereist dit nieuwe experimenten en wiskundige modellen die werken op het niveau van één cel, populatie of microbiële gemeenschap.

Natuurlijke poreuze omgevingen, zoals die gevonden in de hyporheïsche zone van beken en rivieren, zijn dicht gekoloniseerd door diverse gemeenschappen van biofilm-vormende microben⁶. Biofilms vormen structuren die de stroom wijzigen en dus het transport en de verspreiding van bacteriën in de vloeibare fase^7,8. Het vervoer van bacteriën op porieschaal hangt af van de beperkte beschikbaarheid van ruimte in de poreuze matrix en beweeglijkheidsgerelateerde verspreiding kan een effectieve manier zijn om de individuele geschiktheid te vergroten door verminderde concurrentie om hulpbronnen in minder dichtbevolkte gebieden. Aan de andere kant kunnen motilebacteriën ook meer geïsoleerde gebieden van de poreuze matrix bereiken en de uitgebreide verkenning van dergelijke gebieden kan ecologische mogelijkheden bieden om motile populaties¹⁰. Bij grotere ruimtelijke schalen leidt biofilmgroei de stroompaden af die ook leiden tot (gedeeltelijke) verstopping van poriën en dus tot de vaststelling van nog meer gekanaliseerde en heterogene stromingsvoorwaarden¹¹. Dit heeft gevolgen voor de toevoer van voedingsstoffen en de verspreidingscapaciteit, de frequentie en de afstand. Preferentiële stroom, bijvoorbeeld, kan genereren zogenaamde “fast-tracks” en motile bacteriën kunnen bereiken nog hogere snelheden dan de lokale stroom langs deze tracks¹². Dit is een effectieve manier om de verkenning van nieuwe habitats te verhogen.

Een verscheidenheid van instrumenten maken gebruik voor de studie van het vervoer van motile en niet-motile bacteriën (en deeltjes) in poreuze media. Numerieke modellen hebben grote voorspellende capaciteiten die belangrijk zijn voor toepassingen, maar worden vaak beperkt door inherente aannames⁴. Laboratoriumexperimenten^13,14 in combinatie met baanbrekende curve (BTC) modellering hebben belangrijke inzichten opgeleverd in het belang van bacteriële celoppervlakeigenschappen voor het vasthouden van efficiëntie¹⁵. BBC’s (d.w.z. tijden reeks deeltjesconcentratie op een vaste locatie) worden meestal verkregen via constantere emissies en meting van celnummers bij de uitstroom van het experimentele apparaat. In deze context weerspiegelen BTC’s de advection-dispersiedynamiek van bacteriën in de poreuze matrix en kunnen ze worden verlengd met een gootsteenterm die waarde hechting. Het modelleren van BBC’s alleen lost echter niet de rol op van de ruimtelijke organisatie van het poreuze substraat of biofilm voor transportprocessen. Andere macroscopische waarneembare stoffen zoals dispersiviteit of afzettingsprofielen hebben bewezen belangrijke informatie te verschaffen over de ruimtelijke verdeling of de behouden deeltjes of groeiende gemeenschappen. Microfluidics is een technologie die het mogelijk maakt het bestuderen van transport in poreuze media door microscopie onderzoek^9,12,16, en met uitzondering van een recent werk¹⁰, experimentele systemen zijn meestal beperkt tot een enkele lengte schaal van resolutie, dat wil zeggen, de porie schaal of de gehele vloeistofapparaat schaal.

Hier introduceren we een reeks gecombineerde methoden om het transport van motile- en niet-motilebacteriën in poreuze landschappen op verschillende schalen te bestuderen. We combineren waarnemingen van bacterieel transport op de porieschaal met informatie op grotere schaal, door middel van BTC-analyse. Microfluïde apparaten die zijn opgebouwd uit zachte lithografie met behulp van polydimethylsiloxaan (PDMS) zijn biocompatibel, bestand tegen een reeks chemicaliën, maken replicabiliteit tegen lage kosten mogelijk en bieden een uitstekende optische transparantie en een lage autofluorescentie die cruciaal is voor microscopische observatie. Microfluidics op basis van PDMS is eerder gebruikt om het transport van microben in eenvoudige kanalen¹⁷ of in complexere geometrieën te bestuderen¹². Echter, meestal microfluidics experimenten richten zich op korte termijn horizonten en epi-fluorescentie microscopische observatie van levende cellen is vaak beperkt tot genetisch gemodificeerde stammen (bijvoorbeeld, GFP-gelabelde stammen). Hier presenteren we tools om bacterieel transport te bestuderen met behulp van PDMS-gebaseerde microfluïde apparaten in combinatie met microscopie en grotere apparaten vervaardigd uit poly (methylmethacrylaat) (PMMA, ook bekend als plexiglas) in combinatie met flow cytometrie. PDMS en PMMA verschillen in gaspermeabiliteit en oppervlakte-eigenschappen, waardoor complementaire mogelijkheden zijn om bacterieel transport te bestuderen. Terwijl het microfluidic apparaat een gecontroleerdere omgeving verstrekt, staat het grotere apparaat voor experimenten over langere periodes van tijd of gebruikend natuurlijke bacteriële gemeenschappen toe. Microscopie tellen op hoge temporele resolutie in een specifiek gebied wordt gebruikt om BTC te verkrijgen in de PDMS-gebaseerde microfluïde apparaat. Om celtellingen voor BTC-modellering te verkrijgen van het OP PMMA gebaseerde apparaat, introduceren we een zelfgebouwde geautomatiseerde vloeistofdispenser in combinatie met stroomcytometrie. In deze opstelling passeren cellen het vloeibare apparaat en worden achtereenvolgens in 96 putplaten afgegeven. De temporele resolutie wordt beperkt door het minimumvolume dat nauwkeurig kan worden afgegeven en dus de gemiddelde stroomsnelheid door het vloeibare apparaat. Fixatief in de putten voorkomt groei en vergemakkelijkt DNA-kleuring voor downstream flow-cytometrische opsoming. Om bacteriële groei tijdens transportexperimenten te voorkomen gebruiken we een minimaal medium (begroeide beweeglijkheidsbuffer).

Aangezien protocollen voor de bereiding van vloeistofapparaten op verschillende schalen direct beschikbaar zijn, introduceren we slechts kort de technieken om dergelijke apparaten te produceren en richten we ons eerder op de experimentele procedures om BBC’s op te nemen. Op dezelfde manier bestaan er verschillende routines voor de stromingscytometrische opsoming van microben en gebruikers vereisen deskundige kennis om resultaten te interpreteren die zijn verkregen door flow cytometrie. We rapporteren het nieuwe gebruik van microfluïde apparaten in combinatie met microscopische beeldvorming om BTC’s van fluorescerend getagde cellen vast te leggen. Op de porieschaal worden lokale snelheden en trajecten verkregen door middel van beeldverwerking. Verder tonen we het gebruik van een PMMA-gebaseerde fluidic apparaat in combinatie met flow-cytometrische tellen om bacteriële transport van motile en niet-motile cellen in poreuze omgevingen gekoloniseerd door een native stream biofilm te observeren.