الجمع بين الأجهزة Fluidic مع المجهر والتدفق cytometry لدراسة النقل الميكروبي في وسائل الإعلام المسامية عبر المقاييس المكانية
Summary
تعد منحنيات الاختراق (BTCs) أدوات فعالة لدراسة نقل البكتيريا في وسائل الإعلام المسامية. هنا نقدم الأدوات القائمة على الأجهزة المائعة في تركيبة مع المجهر والفرز تدفق cytometric للحصول على BTCs.
Abstract
إن فهم نقل الكائنات الدقيقة وتشتتها وترسبها في وسائل الإعلام المسامية مهمة علمية معقدة تضم مواضيع متنوعة مثل الديناميكا المائية والإيكولوجيا والهندسة البيئية. إن نميجة النقل البكتيري في بيئات مسامية على نطاقات مكانية مختلفة أمر بالغ الأهمية للتنبؤ بشكل أفضل بعواقب النقل البكتيري، ومع ذلك فإن النماذج الحالية غالباً ما تفشل في الارتقاء من المختبر إلى الظروف الميدانية. هنا، نقدم أدوات تجريبية لدراسة النقل البكتيري في وسائل الإعلام المسامية على مقياسين مكانيين. والهدف من هذه الأدوات هو الحصول على الملاحظة العيانية (مثل منحنيات الاختراق أو ملامح الترسب) من البكتيريا المحقونة في مصفوفات مسامية شفافة. على نطاق صغير (10-1000 ميكرومتر)، يتم الجمع بين الأجهزة microfluidic مع البصرية البصرية مجهرية الفيديو ومعالجة الصور للحصول على منحنيات اختراق، وفي الوقت نفسه، لتتبع الخلايا البكتيرية الفردية على مقياس المسام. على نطاق أوسع، يتم الجمع بين قياس التدفق مع موزع الروبوتية عصامي للحصول على منحنيات اختراق. نحن نوضح فائدة هذه الأدوات لفهم أفضل لكيفية نقل البكتيريا في وسائل الإعلام المسامية المعقدة مثل منطقة hyporheic من تيارات. وبما أن هذه الأدوات توفر قياسات متزامنة عبر المقاييس، فإنها تمهد الطريق لنماذج قائمة على الآلية، وهي ذات أهمية حاسمة للارتقاء. وتطبيق هذه الأدوات قد لا يسهم في تطوير تطبيقات جديدة في مجال الإصلاح البيولوجي فحسب، بل قد يلقي أيضاً ضوءاً جديداً على الاستراتيجيات الإيكولوجية للكائنات المجهرية التي تستعمر الركائز المسامية.
Introduction
وقد دفعت أساسا الدراسات التي تهدف إلى فهم نقل الميكروبات عبر وسائل مسامية من المخاوف من التلوث1, انتقال المرض2 والعلاج الحيوي3. وفي هذا الصدد، تم التعامل مع البكتيريا في الغالب كجزيئات في نماذج النقل4، وقد تم تحديد عمليات مثل الترشيح أو الإجهاد أو تسوية الجاذبية أو إعادة التعبئة من الأغشية الحيوية كمحركات للاحتفاظ بالميكروبات أو نقلها5. ومع ذلك، فإن دراسة نقل البكتيريا عبر المناظر الطبيعية المسامية يمكن أن تطلعنا أيضًا على الاستراتيجيات البيئية التي تدعم نجاحها في هذه البيئات المعقدة. ومع ذلك، يتطلب هذا تجارب جديدة ونماذج رياضية تعمل على مستوى الخلية المفردة أو السكان أو المجتمع المحلي الميكروبي.
البيئات الطبيعية المسامية، مثل تلك الموجودة في منطقة ما هوة تحت الأرض من الجداول والأنهار، هي مستعمرة بكثافة من قبل مجتمعات متنوعة من الميكروبات التي تشكل بيو فيلم6. الأغشية الحيوية تشكل هياكل تعديل تدفق وبالتالي نقل وتشتت البكتيريا في المرحلة السائلة7,8. ويتوقف نقل البكتيريا على مقياس المسام على محدودية توافر المساحة في المصفوفة المسامية والتشتت المرتبط بالحركية، وقد يكون وسيلة فعالة لزيادة اللياقة البدنية الفردية من خلال تقليل المنافسة على الموارد في المناطق الأقل كثافة سكانية. ومن ناحية أخرى، يمكن أن تصل بكتيريا الضباب أيضا إلى مناطق أكثر عزلة من المصفوفة المسامية، وقد يوفر الاستكشاف الموسع لهذه المناطق فرصا إيكولوجية للسكان من الأراضي المُخرَسة10. في نطاقات مكانية أكبر، يحول نمو الغشاء الحيوي مسارات التدفق المؤدية أيضاً إلى انسداد (جزئي) للمسام، وبالتالي، إلى إنشاء ظروف تدفق أكثر قناة وغير متجانسة11. وهذا له عواقب على إمدادات المغذيات والقدرة على التشتت والتردد والمسافة. التدفق التفضيلي، على سبيل المثال، يمكن أن تولد ما يسمى “المسارات السريعة” والبكتيريا المتحركة يمكن أن تحقق سرعات أعلى من التدفق المحلي على طول هذه المسارات12. وهذه طريقة فعالة لزيادة استكشاف الموائل الجديدة.
مجموعة متنوعة من الأدوات الاستفادة من لدراسة نقل البكتيريا المتحركة وغير المتحركة (والجسيمات) في وسائل الإعلام المسامية. النماذج العددية لديها قدرات تنبؤية كبيرة مهمة للتطبيقات ، ولكن غالبا ما تكون محدودة من الافتراضات المتأصلة4. وقد قدمت التجارب على نطاق مختبر13،14 جنبا إلى جنب مع منحنى اختراق (BTC) النمذجة رؤى هامة في أهمية خصائص سطح الخلايا البكتيرية للكفاءة الشائكة15. وعادة ما يتم الحصول على الـ BTCs (أي سلسلة مرات تركيز الجسيمات في موقع ثابت) عن طريق إطلاقات ثابتة وقياس أرقام الخلايا عند تدفق الجهاز التجريبي. وفي هذا السياق، تعكس الـ BTCs ديناميات تشتت البكتيريا في المصفوفة المسامية ويمكن تمديدها بواسطة مصطلح بالوعة حسابي للمرفق. غير أن نمـي نمـيـة الـ BTCs وحدها لا تحل دور التنظيم المكاني للركيزة المسامية أو البيوفيلم لعمليات النقل. وقد ثبت أن أدوات المراقبة العيانية الأخرى مثل التشتت أو الترسبات تقدم معلومات هامة عن التوزيع المكاني أو الجسيمات المحتفظ بها أو المجتمعات المتنامية. Microfluidics هي التكنولوجيا التي تسمح لدراسة النقل في وسائل الإعلام المسامية عن طريق التحقيق المجهري9،12،16، وباستثناء العمل الأخير10، وعادة ما تكون مقيدة النظم التجريبية لمقياس طول واحد من القرار ، وهذا هو ، مقياس المسام أو مقياس الجهاز السائل بأكمله.
هنا، نقدم مجموعة من الطرق المشتركة لدراسة نقل البكتيريا المتحركة وغير المتحركة في المناظر الطبيعية المسامية على موازين مختلفة. نحن نجمع بين ملاحظات النقل البكتيري على مقياس المسام مع المعلومات على نطاق أوسع، عن طريق تحليل BTC. الأجهزة Microfluidic بنيت من الطباعة الحجرية لينة باستخدام polydimethylsiloxane (PDMS) هي متوافقة بيولوجيا، ومقاومة لمجموعة من المواد الكيميائية، والسماح للتكرار بتكلفة منخفضة وتوفير شفافية بصرية ممتازة، فضلا عن ضعف الفلوروسكينية الحيوية للمراقبة المجهرية. Microfluidics استنادا إلى PDMS وقد سبق استخدامها لدراسة نقل الميكروبات في قنوات بسيطة17 أو في هندستها أكثر تعقيدا12. ومع ذلك، تركز تجارب ميكروفليديس عادة على الآفاق قصيرة الأجل، وعادة ما تقتصر المراقبة المجهرية للغلاية الفلورية على السلالات المعدلة وراثيا (مثل السلالات الموسومة بـ GFP). هنا نقدم أدوات لدراسة النقل البكتيري باستخدام أجهزة microfluidic المستندة إلى PDMS في تركيبة مع أجهزة المجهر وأكبر ملفقة من بولي (ميثيل ميتكريلات) (PMMA، المعروف أيضا باسم زجاج شبكي) في تركيبة مع تدفق cytometry. يختلف نظام إدارة المواد البكترية (PDMS) وMMA في نفاذية الغاز وخصائص السطح، مما يوفر فرصًا تكميلية لدراسة النقل البكتيري. في حين أن الجهاز microfluidic يوفر بيئة أكثر سيطرة ، فإن الجهاز الأكبر يسمح بالتجارب على مدى فترات طويلة من الزمن أو باستخدام المجتمعات البكتيرية الطبيعية. يتم استخدام العد المجهري بدقة زمنية عالية في منطقة مخصصة للحصول على BTC في جهاز microfluidic المستند إلى PDMS. للحصول على عدد الخلايا لـ BTC النمذجة من الجهاز القائم على PMMA، ونحن نقدم موزع السائل الآلي الذاتي شيدت في تركيبة مع عملية استئصال الخلايا تدفق. في هذا الإعداد، تمر الخلايا الجهاز المائع ويتم الاستغناء عنها على التوالي في 96 لوحة جيدا. يتم تقييد دقة الوقت بواسطة الحد الأدنى من حجم التي يمكن الاستغناء عنها بدقة وبالتالي معدل التدفق المتوسط من خلال الجهاز fluidic. المثبت في الآبار يمنع النمو ويسهل تلطيخ الحمض النووي لتعداد تدفق التقلبات الخلوية في المصب. لمنع النمو البكتيري أثناء تجارب النقل نستخدم الحد الأدنى من المتوسط (يطلق عليه حاجز الحركة).
وبما أن البروتوكولات لإعداد الأجهزة المائعة على مختلف المقاييس متاحة بسهولة، فإننا لا نقدم سوى بإيجاز تقنيات إنتاج هذه الأجهزة والتركيز بدلاً من ذلك على الإجراءات التجريبية لتسجيل BTCs. وبالمثل، توجد إجراءات روتينية مختلفة للعدّة السيتومترية لتدفق الميكروبات، ويتطلب المستخدمون معرفة الخبراء لتفسير النتائج التي يتم الحصول عليها عن طريق عملية استئصال الانسياب. نحن الإبلاغ عن استخدام رواية الأجهزة microfluidic في تركيبة مع التصوير المجهري لتسجيل BTCs من الخلايا الموسومة الفلورسنت. وعند مقياس المسام، يتم الحصول على السرعات والمسارات المحلية عن طريق معالجة الصور. علاوة على ذلك، نبرهن على استخدام جهاز سائل قائم على PMMA بالاقتران مع العد السيتري للتدفق لمراقبة النقل البكتيري للخلايا الضغيرية وغير المتحركة في بيئات مسامية مستعمر من قبل بيو فيلم حيوي أصلي.
Protocol
Representative Results
Discussion
هنا نقترح طريقتين لدراسة نقل الميكروبات من خلال نظم مسامية على مستوى الخلية الواحدة والسكان. وفي حين أن دراسة ظواهر النقل باستخدام نمّام BTC قد وفرت رؤى قيّمة حول انتشار مسببات الأمراض أو الملوثات على نطاقات النظام الإيكولوجي، فإن الصعوبات التي تعترض المدى من التجارب المختبرية إلى الظروف …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نحن نعترف بمساعدة أنطوان فيدر مع إعداد موزع الروبوتية وسيناريو dispenser.py.
Materials
| EDTA | Sigma | ||
| Elastomer Sylgard 184 | Dowsil | 101697 | |
| Flow cytometer NovoCyte | Acea | ||
| Glucose | Sigma | https://www.makeblock.com/project/xy-plotter-robot-kit | |
| LB broth | BD | ||
| Liquid dispenser, XY Plotter Robot Kit | makeblock | ||
| Microscope Axio Imager | Zeiss | ||
| Microscope AxioZoom v16 | Zeiss | ||
| Microscope slides, 75 mm × 25 mm | Corning | ||
| Minipuls 3 peristaltic pump | Gilson | ||
| Plasma bonder Corona SB | BlackHole Lab | ||
| Potassium phosphate | Sigma | ||
| Syringe pump New Era NE 4000 | New Era | ||
| Syto 13 Green Fluorescent Nucleic Acid Stain | Molecular Probes, Invitrogen | ||
| Tygon tubing | Ismatec | ||
| WF31SA universal milling machine | Mikron |
References
- Stevik, K., Aa, K., Ausland, G., Fredrik Hanssen, J. Retention and removal of pathogenic bacteria in wastewater percolating through porous media: a review. Water Research. 38 (6), 1355-1367 (2004).
- Ribet, D., Cossart, P. How bacterial pathogens colonize their hosts and invade deeper tissues. Microbes and Infection. 17 (3), 173-183 (2015).
- Ginn, T. R., Wood, B. D., Nelson, K. E., Scheibe, T. D., Murphy, E. M., Clement, T. P. Processes in microbial transport in the natural subsurface. Advances in Water Resources. 25 (8), 1017-1042 (2002).
- Tufenkji, N. Modeling microbial transport in porous media: Traditional approaches and recent developments. Advances in Water Resources. 30 (6-7), 1455-1469 (2007).
- Foppen, J. W., Van, M. H., Schijven, J. Measuring and modelling straining of Escherichia coli in saturated porous media. Journal of contaminant hydrology. 93 (1-4), 236-254 (2007).
- Battin, T. J., Besemer, K., Bengtsson, M. M., Romani, A. M., Packmann, A. I. The ecology and biogeochemistry of stream biofilms. Nature Reviews Microbiology. 14 (4), 251-263 (2016).
- Scheidweiler, D., Peter, H., Pramateftaki, P., Anna, P., de Battin, T. J. Unraveling the biophysical underpinnings to the success of multispecies biofilms in porous environments. The ISME Journal. 1, (2019).
- Carrel, M., et al. Biofilms in 3D porous media: Delineating the influence of the pore network geometry, flow and mass transfer on biofilm development. Water Research. 134, 280-291 (2018).
- Bhattacharjee, T., Datta, S. S. Bacterial hopping and trapping in porous media. Nature Communications. 10 (1), 2075 (2019).
- Scheidweiler, D., Miele, F., Peter, H., Battin, T. J., de Anna, P. Trait-specific dispersal of bacteria in heterogeneous porous environments: from pore to porous medium scale. Journal of The Royal Society Interface. 17 (164), 20200046 (2020).
- Morales, V. L., Parlange, J. Y., Steenhuis, T. S. Are preferential flow paths perpetuated by microbial activity in the soil matrix? A review. Journal of Hydrology. 393 (1), 29-36 (2010).
- Creppy, A., Clément, E., Douarche, C., D’Angelo, M. V., Auradou, H. Effect of motility on the transport of bacteria populations through a porous medium. Physical Review Fluids. 4 (1), 013102 (2019).
- Camesano, T. A., Logan, B. E. Influence of Fluid Velocity and Cell Concentration on the Transport of Motile and Nonmotile Bacteria in Porous Media. Environmental Science & Technology. 32 (11), 1699-1708 (1998).
- Lutterodt, G., Basnet, M., Foppen, J. W. A., Uhlenbrook, S. The effect of surface characteristics on the transport of multiple Escherichia coli isolates in large scale columns of quartz sand. Water Research. 43 (3), 595-604 (2009).
- Bozorg, A., Gates, I. D., Sen, A. Impact of biofilm on bacterial transport and deposition in porous media. Journal of Contaminant Hydrology. 183 (Supplement C), 109-120 (2015).
- Long, T., Ford, R. M. Enhanced Transverse Migration of Bacteria by Chemotaxis in a Porous T-Sensor. Environmental Science & Technology. 43 (5), 1546-1552 (2009).
- Rusconi, R., Garren, M., Stocker, R. Microfluidics Expanding the Frontiers of Microbial Ecology. Annual Review of Biophysics. 43 (1), 65-91 (2014).
- Xia, Y., Whitesides, G. M. Soft Lithography. Annual Review of Materials Science. 28 (1), 153-184 (1998).
- Crocker, J. C., Grier, D. G. Methods of Digital Video Microscopy for Colloidal Studies. Journal of Colloid and Interface Science. 179 (1), 298-310 (1996).
- del Giorgio, P. A., Bird, D. F., Prairie, Y. T., Planas, D. Flow cytometric determination of bacterial abundance in lake plankton with the green nucleic acid stain SYTO 13. Limnology and Oceanography. 41 (4), 783-789 (1996).
