Visualisatie van macrofaag lytische celdood tijdens mycobacteriële infectie in zebravis-embryo's via Intravital microscopie
Summary
Dit protocol beschrijft een techniek voor het visualiseren van macrofaag gedrag en overlijden in embryonale zebravis tijdens infectie met Mycobacterium de . Stappen voor de bereiding van bacteriën, infectie van de embryo’s, en intravital microscopie zijn opgenomen. Deze techniek kan worden toegepast op de observatie van cellulaire gedrag en overlijden in soortgelijke scenario’s met betrekking tot infectie of steriele ontsteking.
Abstract
Zebravis is een uitstekend modelorganisme voor het bestuderen van aangeboren immuun Celgedrag als gevolg van de transparante aard en het vertrouwen uitsluitend op zijn aangeboren immuunsysteem tijdens de vroege ontwikkeling. De zebravis Mycobacterium de (M. de) infectie model is goed opgericht in het bestuderen van gastheer immuunrespons tegen mycobacteriële infectie. Er is gesuggereerd dat verschillende macrofaag celdood types zal leiden tot de diverse uitkomsten van mycobacteriële infectie. Hier beschrijven we een protocol met behulp van intravital microscopie te observeren macrofaag celdood in zebravis embryo’s na M. de infectie. Zebravis transgene lijnen die specifiek labelen macrofagen en neutrofielen zijn geïnfecteerd via intramusculaire micro injectie van fluorescently gelabelde M. de in ofwel de veroorzaakt of de romp. Besmette zebravis embryo’s worden vervolgens op laag smelt agarose gemonteerd en waargenomen door confocale microscopie in X-Y-Z-T afmetingen. Omdat langdurig Live beeldvorming een laag Laser vermogen vereist om fotobleaching en fototoxiciteit te voorkomen, wordt een sterk uitgesproken transgene aanbevolen. Dit protocol vergemakkelijkt de visualisatie van de dynamische processen in vivo, met inbegrip van immuuncelmigratie, gastheer pathogeen interactie, en celdood.
Introduction
Mycobacteriële infectie is aangetoond dat gastheer immuuncel overlijden1. Bijvoorbeeld, een verzwakte stam zal leiden tot apoptosis in macrofagen en de infectie bevatten. Een virulente stam zal echter leiden tot lytische celdood, waardoorbacteriële verspreiding1,2. Gezien de impact van deze verschillende soorten celdood op host anti-mycobacteriële respons, is een gedetailleerde observatie van macrofaag celdood tijdens mycobacteriële infectie in vivo nodig.
De conventionele methoden voor het meten van celdood zijn het gebruik van dode celvlekken, zoals annnexin V, Tunel of acridine Orange/propidium jodide kleuring3,4,5. Deze methoden kunnen echter geen licht werpen op het dynamische proces van celdood in vivo. De waarneming van celdood in vitro is al vergemakkelijkt door Live Imaging6. Echter, of de resultaten nauwkeurig nabootsen van fysiologische omstandigheden blijft onduidelijk.
Zebrafish zijn een uitstekend model voor het bestuderen van host anti-Mycobacterium reacties. Het heeft een sterk bewaard immuunsysteem vergelijkbaar met dat van mensen, een gemakkelijk gemanipuleerd genoom, en de vroege embryo’s zijn transparant, waardoor Live beeldvorming7,8,9mogelijk wordt. Na infectie met M. marinum vormen volwassen zebravis typische rijpe granuloom structuren, en embryonale zebravis vorm vroeg granuloom zoals structuren9,10. Het dynamische proces van aangeboren immuuncelbacteriën interactie is eerder onderzocht in de zebravis M. de infectie model11,12. Echter, als gevolg van hoge ruimtelijke-temporele resolutie eis, de details rond de dood van de aangeboren immuuncellen blijven grotendeels ongedefinieerd.
Hier beschrijven we hoe het proces van macrofaag lytische celdood, veroorzaakt door mycobacteriële infectie in vivo, te visualiseren. Dit protocol kan ook worden toegepast voor het visualiseren van cellulaire gedrag in vivo tijdens de ontwikkeling en ontsteking.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dit protocol beschrijft de visualisatie van macrofaag sterfte tijdens mycobacteriële infectie. Op basis van factoren zoals de integriteit van het celmembraan, kan infectie gedreven celdood worden onderverdeeld in apoptosis en lytische celdood24,25. Lytic Cell Death is meer stressvol voor het organisme dan apoptosis, omdat het een sterke ontstekingsreactie veroorzaakt, 24,25. Observatie van lytische celdo…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We bedanken Dr. zilong Wen voor het delen van zebravis stammen, Dr. Stefan oehlers en Dr. David Tobin voor het delen van M. de gerelateerde middelen, yuepeng hij voor hulp in de voorbereiding van de figuur. Dit werk werd gesteund door de National Natural Science Foundation of China (81801977) (B.Y.), het uitstekende opleidingsprogramma voor jongeren van Shanghai Municipal Health Commission (2018YQ54) (B.Y.), Shanghai Sailing Program (18YF1420400) (B.Y.) en het open fonds van Shanghai Key Laboratory of tuberculose (2018KF02) (B.Y.).
Materials
| 0.05% Tween-80 | Sigma | P1379 | |
| 10 mL syringe | Solarbio | YA0552 | |
| 10% OADC | BD | 211886 | |
| 3-aminobenzoic acid | Sigma | E10521 | |
| 5 μm filter | Mille X | SLSV025LS | |
| 50 μl/ml hygromycin | Sangon Biotech | A600230 | |
| 7H10 | BD | 262710 | |
| 7H9 | BD | 262310 | |
| A glass bottom 35 mm dish | In Vitro Scientific | D35-10-0-N | |
| Agarose | Sangon Biotech | A60015 | |
| Confocal microscope | Leica | TCS SP5 II | |
| Enviromental Chamber | Pecon | temp control 37-2 digital | |
| Eppendorf microloader | Eppendorf | No.5242956003 | |
| Glass microscope slide | Bioland Scientific LLC | 7105P | |
| Glycerol | Sangon Biotech | A100854 | |
| Incubator | Keelrein | PH-140(A) | |
| M.marinum | ATCC BAA-535 | ||
| Microinjection needle | World Precision Instruments | IB100F-4 | |
| Microinjector | Eppendorf | Femtojet | |
| Micromanipulator | NARISHIGE | MN-151 | |
| msp12:cerulean | Ref.: PMID 25470057; 27760340 | ||
| Phenol red | Sigma | P3532 | |
| PTU | Sigma | P7629 | |
| Single concavity glass microscope slide | Sail Brand | 7103 | |
| Sonicator | SCICNTZ | JY92-IIDN | |
| Spectrophotometer (OD600) | Eppendorf AG | 22331 Hamburg | |
| Stereo Microscope | OLYMPUS | SZX10 | |
| Tg(mfap4:eGFP) | Ref.: PMID 30742890 | ||
| Tg(coro1a:eGFP;lyzDsRed2) | Ref.: PMID 31278008 | ||
| Tg(mpeg1:LRLG;lyz:eGFP) | Ref.: PMID 27424497; 17477879 |
References
- Behar, S. M., Divangahi, M., Remold, H. G. Evasion of innate immunity by Mycobacterium tuberculosis: is death an exit strategy. Nature Reviews Microbiology. 8 (9), 668-674 (2010).
- Lamkanfi, M., Dixit, V. M. Manipulation of host cell death pathways during microbial infections. Cell Host Microbe. 8 (1), 44-54 (2010).
- Crowley, L. C., Marfell, B. J., Scott, A. P., Waterhouse, N. J. Quantitation of Apoptosis and Necrosis by Annexin V Binding, Propidium Iodide Uptake, and Flow Cytometry. Cold Spring Harbor Protocol. 2016 (11), (2016).
- Crowley, L. C., Marfell, B. J., Waterhouse, N. J. Detection of DNA Fragmentation in Apoptotic Cells by TUNEL. Cold Spring Harbor Protocol. 2016 (10), (2016).
- Chan, L. L., McCulley, K. J., Kessel, S. L. Assessment of Cell Viability with Single-, Dual-, and Multi-Staining Methods Using Image Cytometry. Methods in Molecular Biology. 1601, 27-41 (2017).
- Rathkey, J. K., et al. Live-cell visualization of gasdermin D-driven pyroptotic cell death. Journal of Biological Chemistry. 292 (35), 14649-14658 (2017).
- Henry, K. M., Loynes, C. A., Whyte, M. K., Renshaw, S. A. Zebrafish as a model for the study of neutrophil biology. Journal of Leukocyte Biology. 94 (4), 633-642 (2013).
- Harvie, E. A., Huttenlocher, A. Neutrophils in host defense: new insights from zebrafish. Journal of Leukocyte Biology. 98 (4), 523-537 (2015).
- Lesley, R., Ramakrishnan, L. Insights into early mycobacterial pathogenesis from the zebrafish. Current Opinion Microbiology. 11 (3), 277-283 (2008).
- Tobin, D. M., Ramakrishnan, L. Comparative pathogenesis of Mycobacterium marinum and Mycobacterium tuberculosis. Cellular Microbiology. 10 (5), 1027-1039 (2008).
- Clay, H., et al. Dichotomous role of the macrophage in early Mycobacterium marinum infection of the zebrafish. Cell Host Microbe. 2 (1), 29-39 (2007).
- Davis, J. M., et al. Real-time visualization of mycobacterium-macrophage interactions leading to initiation of granuloma formation in zebrafish embryos. Immunity. 17 (6), 693-702 (2002).
- Benard, E. L., et al. Infection of zebrafish embryos with intracellular bacterial pathogens. Journal of Visualized Experiments. (61), e3781 (2012).
- Maglione, P. J., Xu, J., Chan, J. B. cells moderate inflammatory progression and enhance bacterial containment upon pulmonary challenge with Mycobacterium tuberculosis. Journal of Immunology. 178 (11), 7222-7234 (2007).
- Wang, Z., et al. Neutrophil plays critical role during Edwardsiella piscicida immersion infection in zebrafish larvae. Fish Shellfish Immunology. 87, 565-572 (2019).
- Wang, T., et al. Nlrc3-like is required for microglia maintenance in zebrafish. Journal of Genetics and Genomics. 46 (6), 291-299 (2019).
- Hall, C., Flores, M. V., Storm, T., Crosier, K., Crosier, P. The zebrafish lysozyme C promoter drives myeloid-specific expression in transgenic fish. BMC Developmental Biology. 7, 42 (2007).
- Xu, J., Wang, T., Wu, Y., Jin, W., Wen, Z. Microglia Colonization of Developing Zebrafish Midbrain Is Promoted by Apoptotic Neuron and Lysophosphatidylcholine. Developmental Cell. 38 (2), 214-222 (2016).
- Oehlers, S. H., et al. Interception of host angiogenic signalling limits mycobacterial growth. Nature. 517 (7536), 612-615 (2015).
- Kulms, D., Schwarz, T. Molecular mechanisms of UV-induced apoptosis. Photodermatology, Photoimmunology and Photomedicine. 16 (5), 195-201 (2000).
- van Ham, T. J., Mapes, J., Kokel, D., Peterson, R. T. Live imaging of apoptotic cells in zebrafish. FASEB Journal. 24 (11), 4336-4342 (2010).
- Zhang, Y., Chen, X., Gueydan, C., Han, J. Plasma membrane changes during programmed cell deaths. Cell Research. 28 (1), 9-21 (2018).
- Lu, Z., Zhang, C., Zhai, Z. Nucleoplasmin regulates chromatin condensation during apoptosis. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 102 (8), 2778-2783 (2005).
- Ashida, H., et al. Cell death and infection: a double-edged sword for host and pathogen survival. Journal of Cell Biology. 195 (6), 931-942 (2011).
- Traven, A., Naderer, T. Microbial egress: a hitchhiker’s guide to freedom. PLoS Pathogens. 10 (7), 1004201 (2014).
