التصور للموت الخلية الليتيك الضامة اثناء العدوى المتفطرات في الاجنه Zebrafish عن طريق المجهر الانترافيتال
Summary
يصف هذا البروتوكول تقنيه لتصور السلوك الضام والموت في الاجنه الجنينية اثناء العدوى المتفطره المردية . يتم تضمين خطوات لاعداد البكتيريا ، والعدوى من الاجنه ، والمجهر الانترافيتال. ويمكن تطبيق هذه التقنية علي مراقبه السلوك الخلوي والموت في سيناريوهات مماثله تنطوي علي عدوي أو التهاب معقم.
Abstract
Zebrafish هو كائن نموذجي ممتاز لدراسة سلوك الخلايا المناعية الفطرية نظرا لطبيعته الشفافة والاعتماد فقط علي نظامه المناعي الفطري اثناء التطور المبكر. وقد تم إنشاء نموذج العدوى المتفطره الفطرية من زبراافيش (m. مارنوم) في دراسة الاستجابة المناعية المضيفة ضد العدوى المتفطرات. وقد اقترح ان مختلف أنواع الموت خليه الضامة سوف يؤدي إلى النتائج المتنوعة للعدوى المتفطرات. هنا نحن وصف بروتوكول باستخدام المجهر انترافيتال لمراقبه وفاه الخلية الضامة في الاجنه الزرد بعد العدوى m. مارنوم . الخطوط المحورة وراثيا zebrafish التي تسمي علي وجه التحديد الضامة والعدلات هي المصابة عن طريق الحقن المجهري العضلي من فلوريسسينتلي المسمي m. مارنوم في اما الدماغ الأوسط أو الجذع. وفي وقت لاحق ، يتم تركيب الاجنه المصابة بالزبرد علي ذوبان منخفض ويلاحظها المجهر البؤري في ابعاد X-Y-Z-T. لان التصوير الحي علي المدى الطويل يتطلب استخدام طاقة الليزر المنخفضة لتجنب الرشح الضوئي والسمية الضوئية ، ينصح بشده بالتعبير المعدل وراثيا. يسهل هذا البروتوكول تصور العمليات الديناميكية في الجسم الحي ، بما في ذلك هجره الخلايا المناعية ، وتفاعل الممرض المضيف ، وموت الخلايا.
Introduction
وقد ثبت ان العدوى المتفطرات تسبب وفاه الخلية المناعية المضيف1. علي سبيل المثال ، فان سلاله موهنه تؤدي إلى موت الخلايا المبرمج في الضامة وتحتوي علي العدوى. ومع ذلك ، فان سلاله خبيثه تؤدي إلى موت الخلايا الليتيك ، مما تسبب في نشر البكتيريا1،2. النظر إلى تاثير هذه الأنواع المختلفة من موت الخلايا لديها علي المضيف المضادة للمتفطرات الاستجابة ، وهناك حاجه إلى ملاحظه مفصله من وفاه الخلايا الضامة اثناء العدوى المتفطرات في الجسم المجري.
الطرق التقليدية لقياس موت الخلايا هي لاستخدام البقع الخلية الميتة ، مثل الخامس annnexin ، tunel ، أو اكريدين اورانج/بروبيديوم يوديد تلطيخ3،4،5. ومع ذلك ، هذه الطرق غير قادره علي تسليط الضوء علي عمليه ديناميكية من موت الخلايا في الجسم الحي. وقد تيسرت بالفعل مراقبه موت الخلايا في المختبر عن طريق التصوير الحي6. ومع ذلك ، ما إذا كانت النتائج تحاكي بدقه الظروف الفسيولوجية لا يزال غير واضح.
وكانت zebrafish نموذجا ممتازا لدراسة المضيفين مكافحه المتفطره الاستجابات. لديها جهاز المناعة المحمية للغاية مماثله لتلك التي من البشر ، والجينوم التلاعب بها بسهوله ، والاجنه في وقت مبكر شفافة ، والذي يسمح للتصوير الحي7،8،9. بعد العدوى مع m. مارنوم ، الكبار الزرد شكل نموذجي البنيات الحبيبية ناضجه ، وشكل الزرد الجنينية الحبيبية في وقت مبكر مثلالهياكل 9 ،10. وقد تم استكشاف العملية الديناميكية للخلايا المناعية الفطرية التفاعل البكتيريا في السابق في النموذج العدوى م. مارنوم 11,12. ومع ذلك ، نظرا لارتفاع متطلبات الدقة المكانية والزمانيه ، تظل التفاصيل المحيطة بوفاة الخلايا المناعية الفطرية غير معرفه إلى حد كبير.
هنا نحن وصف كيفيه تصور عمليه الموت الخلية الضامة التي تسببها العدوى المتفطرات في الجسم الميت. ويمكن أيضا تطبيق هذا البروتوكول لتصور السلوك الخلوي في الجسم المجري اثناء التطور والتهاب.
Protocol
Representative Results
Discussion
يصف هذا البروتوكول التصور للوفاة الضامة اثناء العدوى المتفطرات. استنادا إلى عوامل مثل سلامه غشاء الخلية ، يمكن تقسيم موت الخلايا مدفوعة العدوى إلى موت الخلايا المبرمج ووفاه الخلية التحللي24،25. الموت الخلية lytic هو أكثر إرهاقا للكائن الحي من المبرمج ، لأنه يح…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر الدكتور زيلونغ ون لتقاسم سلالات الزرد ، الدكتور ستيفان اواهلرز والدكتور ديفيد توبين لتقاسم الموارد المتعلقة m. مارنوم ، yuepeng هو للمساعدة في اعداد الرقم. وقد دعم هذا العمل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (81801977) ، وبرنامج تدريب الشباب المتميز للجنة الصحة البلدية في شنغهاي (2018YQ54) (B.Y.) ، وبرنامج شنغهاي للإبحار (18YF1420400) (B.Y.) ، والصندوق المفتوح لمختبر شانغهاي الرئيسي للسل (2018KF02) (B.Y.).
Materials
| 0.05% Tween-80 | Sigma | P1379 | |
| 10 mL syringe | Solarbio | YA0552 | |
| 10% OADC | BD | 211886 | |
| 3-aminobenzoic acid | Sigma | E10521 | |
| 5 μm filter | Mille X | SLSV025LS | |
| 50 μl/ml hygromycin | Sangon Biotech | A600230 | |
| 7H10 | BD | 262710 | |
| 7H9 | BD | 262310 | |
| A glass bottom 35 mm dish | In Vitro Scientific | D35-10-0-N | |
| Agarose | Sangon Biotech | A60015 | |
| Confocal microscope | Leica | TCS SP5 II | |
| Enviromental Chamber | Pecon | temp control 37-2 digital | |
| Eppendorf microloader | Eppendorf | No.5242956003 | |
| Glass microscope slide | Bioland Scientific LLC | 7105P | |
| Glycerol | Sangon Biotech | A100854 | |
| Incubator | Keelrein | PH-140(A) | |
| M.marinum | ATCC BAA-535 | ||
| Microinjection needle | World Precision Instruments | IB100F-4 | |
| Microinjector | Eppendorf | Femtojet | |
| Micromanipulator | NARISHIGE | MN-151 | |
| msp12:cerulean | Ref.: PMID 25470057; 27760340 | ||
| Phenol red | Sigma | P3532 | |
| PTU | Sigma | P7629 | |
| Single concavity glass microscope slide | Sail Brand | 7103 | |
| Sonicator | SCICNTZ | JY92-IIDN | |
| Spectrophotometer (OD600) | Eppendorf AG | 22331 Hamburg | |
| Stereo Microscope | OLYMPUS | SZX10 | |
| Tg(mfap4:eGFP) | Ref.: PMID 30742890 | ||
| Tg(coro1a:eGFP;lyzDsRed2) | Ref.: PMID 31278008 | ||
| Tg(mpeg1:LRLG;lyz:eGFP) | Ref.: PMID 27424497; 17477879 |
References
- Behar, S. M., Divangahi, M., Remold, H. G. Evasion of innate immunity by Mycobacterium tuberculosis: is death an exit strategy. Nature Reviews Microbiology. 8 (9), 668-674 (2010).
- Lamkanfi, M., Dixit, V. M. Manipulation of host cell death pathways during microbial infections. Cell Host Microbe. 8 (1), 44-54 (2010).
- Crowley, L. C., Marfell, B. J., Scott, A. P., Waterhouse, N. J. Quantitation of Apoptosis and Necrosis by Annexin V Binding, Propidium Iodide Uptake, and Flow Cytometry. Cold Spring Harbor Protocol. 2016 (11), (2016).
- Crowley, L. C., Marfell, B. J., Waterhouse, N. J. Detection of DNA Fragmentation in Apoptotic Cells by TUNEL. Cold Spring Harbor Protocol. 2016 (10), (2016).
- Chan, L. L., McCulley, K. J., Kessel, S. L. Assessment of Cell Viability with Single-, Dual-, and Multi-Staining Methods Using Image Cytometry. Methods in Molecular Biology. 1601, 27-41 (2017).
- Rathkey, J. K., et al. Live-cell visualization of gasdermin D-driven pyroptotic cell death. Journal of Biological Chemistry. 292 (35), 14649-14658 (2017).
- Henry, K. M., Loynes, C. A., Whyte, M. K., Renshaw, S. A. Zebrafish as a model for the study of neutrophil biology. Journal of Leukocyte Biology. 94 (4), 633-642 (2013).
- Harvie, E. A., Huttenlocher, A. Neutrophils in host defense: new insights from zebrafish. Journal of Leukocyte Biology. 98 (4), 523-537 (2015).
- Lesley, R., Ramakrishnan, L. Insights into early mycobacterial pathogenesis from the zebrafish. Current Opinion Microbiology. 11 (3), 277-283 (2008).
- Tobin, D. M., Ramakrishnan, L. Comparative pathogenesis of Mycobacterium marinum and Mycobacterium tuberculosis. Cellular Microbiology. 10 (5), 1027-1039 (2008).
- Clay, H., et al. Dichotomous role of the macrophage in early Mycobacterium marinum infection of the zebrafish. Cell Host Microbe. 2 (1), 29-39 (2007).
- Davis, J. M., et al. Real-time visualization of mycobacterium-macrophage interactions leading to initiation of granuloma formation in zebrafish embryos. Immunity. 17 (6), 693-702 (2002).
- Benard, E. L., et al. Infection of zebrafish embryos with intracellular bacterial pathogens. Journal of Visualized Experiments. (61), e3781 (2012).
- Maglione, P. J., Xu, J., Chan, J. B. cells moderate inflammatory progression and enhance bacterial containment upon pulmonary challenge with Mycobacterium tuberculosis. Journal of Immunology. 178 (11), 7222-7234 (2007).
- Wang, Z., et al. Neutrophil plays critical role during Edwardsiella piscicida immersion infection in zebrafish larvae. Fish Shellfish Immunology. 87, 565-572 (2019).
- Wang, T., et al. Nlrc3-like is required for microglia maintenance in zebrafish. Journal of Genetics and Genomics. 46 (6), 291-299 (2019).
- Hall, C., Flores, M. V., Storm, T., Crosier, K., Crosier, P. The zebrafish lysozyme C promoter drives myeloid-specific expression in transgenic fish. BMC Developmental Biology. 7, 42 (2007).
- Xu, J., Wang, T., Wu, Y., Jin, W., Wen, Z. Microglia Colonization of Developing Zebrafish Midbrain Is Promoted by Apoptotic Neuron and Lysophosphatidylcholine. Developmental Cell. 38 (2), 214-222 (2016).
- Oehlers, S. H., et al. Interception of host angiogenic signalling limits mycobacterial growth. Nature. 517 (7536), 612-615 (2015).
- Kulms, D., Schwarz, T. Molecular mechanisms of UV-induced apoptosis. Photodermatology, Photoimmunology and Photomedicine. 16 (5), 195-201 (2000).
- van Ham, T. J., Mapes, J., Kokel, D., Peterson, R. T. Live imaging of apoptotic cells in zebrafish. FASEB Journal. 24 (11), 4336-4342 (2010).
- Zhang, Y., Chen, X., Gueydan, C., Han, J. Plasma membrane changes during programmed cell deaths. Cell Research. 28 (1), 9-21 (2018).
- Lu, Z., Zhang, C., Zhai, Z. Nucleoplasmin regulates chromatin condensation during apoptosis. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 102 (8), 2778-2783 (2005).
- Ashida, H., et al. Cell death and infection: a double-edged sword for host and pathogen survival. Journal of Cell Biology. 195 (6), 931-942 (2011).
- Traven, A., Naderer, T. Microbial egress: a hitchhiker’s guide to freedom. PLoS Pathogens. 10 (7), 1004201 (2014).
