İnsan Dışı Primat Pankreatik Adacık Oksijen Tüketiminin Analizi
Summary
Bu protokol, insan dışı primat pankreas adacıklarında oksijen tüketiminin doğru ve tekrarlanabilir ölçümünü göstermektedir. Adacık yükleme teknikleri ve mikroplaka kaplama kültürlü küresel diğer türde solunum verimli ölçümü için bir çerçeve sağlar.
Abstract
Ex vivo pankreas adacıkları gibi küresel hücre kümelerinde oksijen tüketiminin ölçümü tarihsel olarak zor olmuştur. Adacık oksijen tüketiminin ölçülmesini, küresel lerde oksijen tüketiminin ölçülmesi için tasarlanmış 96 kuyuluk bir mikroplaka ile gösteriyoruz. Bu tözde, küresel mikroplakalar bir hücre ve doku yapıştırıcısı ile önceki gün asanın la kaplıdır. Adacık bağlılığını sadece kuyunun dibine yapışmasını teşvik etmek için küçük hacimli yapışkan çözüm kullanıyoruz. Tsuruk gününde, 15 adacık, adacıkların optimum konumlandırılmasını ve oksijen tüketiminin doğru ölçülmesini sağlayan bir teknik kullanılarak doğrudan her kuyunun tabanına yüklenir. Mitokondriyal solunumun çeşitli yönleri, ATP’ye bağımlı solunum, maksimal solunum ve proton sızıntısı gibi insan dışı primat adacıklarında farmakolojik olarak incelenir. Bu yöntem, kuyu başına yalnızca az sayıda adacık kullanarak tutarlı, tekrarlanabilir sonuçlar sağlar. Teorik olarak benzer büyüklükteki kültürlere uygulanabilir.
Introduction
Normal kan şekeri düzeylerini korumak için, pankreas β hücre glikoz yükseklikleri algılamak ve buna göre insülin salgılar. İnsülin salgısının glikoz düzeyleri ile birleå mesi, glukoz metabolizması ve mitokondriyal oksidatif fosforilasyon yoluyla ATP Ã1/4retimi ile doÄ rudan baÄ lantılı dÃ1/4Å Ã1/4rÃ1/4lÃ1/4yor. Böylece, mitokondri uyarıcı-salgı kaplin kritik bir rol oynamaktadır1. Β-hücre mitokondriyal fonksiyonunun değerlendirilmesi, insülin salgısının bozulmasına yol açan kusurları ortaya çıkarabilir. Pankreas α hücreleri tarafından glukagon salgıları da yakından mitokondriyal fonksiyon2bağlıdır . Ölümsüzleştirilmiş adacık hücre hatları tahliller bazı türleri için yararlı kanıtlanmış olmasına rağmen, Bu hücrelerin fizyolojisi doğru tüm adacık fonksiyonu özetlemek değil, glukagon tarafından insülin salgılanması potentiation gösterildiği gibi3,4 ve insülin tarafından glukagon salgılanması inhibisyonu5,6 bozulmamış adacıklar. Bu, bütün, bozulmamış adacıklar kullanılarak oksijen tüketimini ölçme ihtiyacını göstermektedir.
Adacık hücre respirometrisinin ölçümü teknikleri zamanla, oksijene duyarlı floresan boyaların kullanımındanoksijen tüketimini doğrudan ölçen katı hal sensörlerine kadar gelişmiştir8. Başlangıçta monolayer için tasarlanmış, yapışık hücreler, yaygın olarak kullanılan hücre kültürü plaka sistemleri pankreas adacıkları için etkisiz olduğu kanıtlanmıştır. Adacıklar doğal olarak kuyulara yapışmadığı için, kültürün çevresine itilmeye yatkındırlar ve bu da oksijen tüketiminin yanlış ölçülmesi ile sonuçlanır9. Bu sorunla mücadele etmek için, adacıklar içerebilir merkezi bir depresyon ile özel 24-iyi plakalar geliştirilmiştir9. Ancak, 24-iyi plaka sistemi gerekli adacıkların çok sayıda (kuyu başına 50-80) ve aynı anda10test edilebilir koşulların sayısı ile sınırlıydı. Küresel lerde ekstrasellüler akı analizi için özel olarak tasarlanmış 96-iyi mikroplakalar son gelişme iyi10başına 20 veya daha az adacık ile adacık respirometri ölçümü sağlayan, bu engelleri aşmıştır.
Burada, japon makak(Macaca fuscata),insanlara benzer adacık biyolojisi ile bir hayvan modeli11,12adacıklarda oksijen tüketimini ölçmek için bu sistemin kullanımını göstermek . Bu protokolde, her biri 15 makak adacık analiz edilir. Elimizde, 15 adacık lar iyi az adacıklar daha yüksek bazal oksijen tüketimi üretilen, sağlam aktivasyon ve farmakolojik manipülasyon yanıt olarak solunum baskı ile. Her kuyunun merkezinde adacıkların tutarlı bir şekilde yüklenmesi için etkili bir yöntem olan ve bu titreyi gerçekleştirirken karşılaşılan genel zorluklara hazırlanmak için gereken adımları vurguluyoruz.
Protocol
Representative Results
Discussion
Adacık oksijen tüketimi çalışma daha önce adacıkların küresel şekli, kültür yüzeylerine bağlılık eksikliği ve iyi başına gerekli adacık sayısı tarafından engel olmuştur. Bu protokolde, 96 kuyulu küresel mikroplakanın az sayıda adacık üzerinde adacık oksijen tüketimini ölçmek için etkinliğini vurgulamakta ve teknik olarak uygun ve tutarlı hale gelen adacıkların taşınması ve yüklenmesi için bir teknik göstermekteyiz. Sonuç -ları.
Adacıkların mikrop…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar kendi tesislerinin kullanımı için Vanderbilt Yüksek Throughput Tarama Çekirdek kabul etmek istiyorum, Agilent Biyoteknolojiler, Dr Paul Kievit (Oregon Sağlık ve Bilim Üniversitesi) insan olmayan primat adacık izolasyonları için, ve Eric Donahue (Vanderbilt Üniversitesi) Şekil 1 ile yardım için. J.M.E. T32GM007347 ödül numarası ile Ulusal Sağlık Enstitüleri NIGMS tarafından desteklendi. M.G. NIH/NIDDK (R24DK090964-06) ve Gazi İşleri Dairesi (BX003744) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Cell culture dish, 60 mm X 15 mm style | Corning | 430166 | |
| Cell-Tak Cell and Tissue Adhesive | Corning | 354240 | |
| Conical tube, 50 mL | Falcon | 352070 | |
| Dextrose anhydrous | Fisher Scientific | BP350-1 | For glucose solution, 200 mg/ml, sterile filetered |
| Disposable reservoirs (sterile), 25 ML | Vistalab | 3054-1033 | for loading multichannel pipet |
| EZFlow Sterile 0.45 μm PES Syringe Filter, 13 mm | Foxx Life Sciences | 371-3115-OEM | |
| L-glutamine | Gibco | 25030-081 | 200 mM (100x) |
| Multichannel pipette tips | ThermoFisher Scientific | 94410810 | |
| Multichannel pipette, 15-1250 μL | ThermoFisher Scientific | 4672100BT | Recommended |
| P20, P200, and P1000 pipettes | Eppendorf | 2231000602 | |
| pH Probe | Hanna Instruments | HI2210-01 | |
| Pipette tips, 20 μL, 200 μL, 1000 μL | Olympus | 24-404, 24-412, 24-430 | |
| Seahorse XF Base Media | Agilent | 103334-100 | |
| Seahorse XF Cell Mito Stress Test Kit | Agilent | 103015-100 | Includes Oligomycin, FCCP, and Rotenone/Antimycin A |
| Seahorse XFe96 Analyzer | Agilent | S7800B | Including prep station with 37 °C non-CO2 incubator |
| Seahorse XFe96 Spheroid Fluxpak Mini | Agilent | 102905-100 | Includes sensor cartridge, spheroid microplate, and calibrant |
| Sodium bicarbonate | Fisher Scientific | BP328-500 | |
| Sodium pyruvate | Gibco | 11360-070 | 100 mM (100x) |
| Stereo Microscope | Olympus | SZX9 | |
| Syringe (sterile), 5 mL | BD | 309603 | For sterile filtration |
| Water (sterile) | Sigma | W3500-500mL |
References
- Mulder, H. Transcribing β-cell mitochondria in health and disease. Molecular Metabolism. 6 (9), 1040-1051 (2017).
- Maechler, P., Wollheim, C. B. Mitochondrial signals in glucose-stimulated insulin secretion in the beta cell. The Journal of Physiology. 529 (Pt 1), 49-56 (2000).
- Curry, D. L. Glucagon Potentiation of Insulin Secretion by the Perfused Rat Pancreas. Diabetes. 19 (6), 420 (1970).
- Song, G., Pacini, G., Ahrén, B., D’Argenio, D. Z. Glucagon Increases Insulin Levels by Stimulating Insulin Secretion Without Effect on Insulin Clearance in Mice. Peptides. 88, 74-79 (2017).
- Vergari, E., et al. Insulin inhibits glucagon release by SGLT2-induced stimulation of somatostatin secretion. Nature Communications. 10 (1), 139 (2019).
- Watts, M., Ha, J., Kimchi, O., Sherman, A. Paracrine regulation of glucagon secretion: the β/α/δ model. American Journal of Physiology–Endocrinology and Metabolism. 310 (8), E597-E611 (2016).
- Sweet, I. R., et al. Continuous measurement of oxygen consumption by pancreatic islets. Diabetes Technology & Therapeutics. 4 (5), 661-672 (2002).
- . Agilent Seahorse XF Instruments Overview and Selection Guide Available from: https://www.agilent.com/en/products/cell-analysis/seahorse-xf-instruments-selection-guide (2019)
- Wikstrom, J. D., et al. A novel high-throughput assay for islet respiration reveals uncoupling of rodent and human islets. PLoS One. 7 (5), e33023 (2012).
- Taddeo, E. P., et al. Individual islet respirometry reveals functional diversity within the islet population of mice and human donors. Molecular Metabolism. 16, 150-159 (2018).
- Conrad, E., et al. The MAFB transcription factor impacts islet alpha-cell function in rodents and represents a unique signature of primate islet beta-cells. American Journal of Physiology–Endocrinology and Metabolism. 310 (1), E91-E102 (2016).
- Steiner, D. J., Kim, A., Miller, K., Hara, M. Pancreatic islet plasticity: interspecies comparison of islet architecture and composition. Islets. 2 (3), 135-145 (2010).
- Elsakr, J. M., et al. Maternal Western-style diet affects offspring islet composition and function in a non-human primate model of maternal over-nutrition. Molecular Metabolism. , (2019).
- Soutar, M. P. M., et al. FBS/BSA media concentration determines CCCP’s ability to depolarize mitochondria and activate PINK1-PRKN mitophagy. Autophagy. , 1-10 (2019).
- Hirshberg, B., et al. Pancreatic Islet Transplantation Using the Nonhuman Primate (Rhesus) Model Predicts That the Portal Vein Is Superior to the Celiac Artery as the Islet Infusion Site. Diabetes. 51 (7), 2135-2140 (2002).
- Divakaruni, A. S., Paradyse, A., Ferrick, D. A., Murphy, A. N., Jastroch, M. Analysis and interpretation of microplate-based oxygen consumption and pH data. Methods in Enzymology. 547, 309-354 (2014).
- Papas, K. K., et al. Islet Oxygen Consumption Rate (OCR) Dose Predicts Insulin Independence in Clinical Islet Autotransplantation. PLoS One. 10 (8), e0134428 (2015).
