Análisis del consumo de oxígeno de los islotes pancreáticos no humanos
Summary
Este protocolo demuestra la medición precisa y reproducible del consumo de oxígeno en islotes pancreáticos de primates no humanos. Las técnicas de carga de islos y el recubrimiento de la microplaca proporcionan un marco para la medición eficiente de la respiración en otros tipos de esferoides cultivados.
Abstract
La medición del consumo de oxígeno en grupos esferoides de células, como islotes pancreáticos ex vivo, ha sido históricamente difícil. Demostramos la medición del consumo de oxígeno de los islos utilizando una microplaca de 96 pocillos diseñada para la medición del consumo de oxígeno en esferoides. En este ensayo, las microplacas esferoides están recubiertas con un adhesivo para células y tejidos el día anterior al ensayo. Utilizamos un pequeño volumen de solución adhesiva para fomentar la adherencia del isla solo a la parte inferior del pozo. El día del ensayo, 15 islotes se cargan directamente en la base de cada pozo utilizando una técnica que garantiza un posicionamiento óptimo de los islotes y una medición precisa del consumo de oxígeno. Varios aspectos de la respiración mitocondrial son sondeados farmacológicamente en islotes de primates no humanos, incluyendo respiración dependiente de ATP, respiración máxima y fuga de protones. Este método permite resultados consistentes y reproducibles utilizando sólo un pequeño número de islotes por pozo. Teóricamente se puede aplicar a cualquier esferoides cultivados de tamaño similar.
Introduction
Con el fin de mantener los niveles normales de glucosa en sangre, la célula pancreática debe sentir elevaciones en la glucosa y secretar insulina en consecuencia. El acoplamiento de la secreción de insulina con los niveles de glucosa está directamente relacionado con el metabolismo de la glucosa y la producción de ATP a través de la fosforilación oxidativa mitocondrial. Por lo tanto, las mitocondrias desempeñan un papel crítico en el acoplamiento estímulo-secreción1. La evaluación de la función mitocondrial de las células puede revelar defectos que conducen a una secreción de insulina deteriorada. La secreción de glucagón por células pancreáticas también está estrechamente ligada a la función mitocondrial2. Aunque las líneas celulares de islotes inmortalizadas han demostrado ser útiles para algunos tipos de ensayos, la fisiología de estas células no recapitula con precisión la función de islotes enteros, como lo ilustra la potenciación de la secreción de insulina por glucagón3,4 y la inhibición de la secreción de glucagón por insulina/somatostatina5,6 en islotes intactos. Esto demuestra la necesidad de medir el consumo de oxígeno utilizando islotes enteros e intactos.
Las técnicas para la medición de la respirometría de células de islotes han evolucionado con el tiempo, desde el uso de colorantes fluorescentes sensibles al oxígeno7 hasta sensores de estado sólido que miden directamente el consumo de oxígeno8. Inicialmente diseñadopara células monocapa y adherentes, los sistemas de placas de cultivo celular comúnmente utilizados han demostrado ser ineficaces para los islotes pancreáticos. Como los islotes no se adhieren naturalmente a los pozos, son propensos a ser empujados a la periferia del cultivo bien resultando en una medición inexacta del consumo de oxígeno9. Para combatir este problema, se desarrollaron placas especializadas de 24 pocillos con una depresión central que podría contener islotes9. Sin embargo, el sistema de placas de 24 pocillos estaba limitado por el gran número de islotes requeridos (50-80 por pozo) y el número de condiciones que se podían probar simultáneamente10. El reciente desarrollo de microplacas de 96 pocillos diseñadas específicamente para el análisis de flujo extracelular en esferoides ha superado estas barreras, permitiendo la medición de la respirometría de islotes con 20 o menos islotes por pozo10.
Aquí, demostramos el uso de este sistema para medir el consumo de oxígeno en los islotes del macaco japonés (Macaca fuscata), un modelo animal con biología de islotes similar a los humanos11,12. En este protocolo, se analizan 15 islotes macacos por pozo. En nuestras manos, 15 islotes por pozo produjeron un mayor consumo de oxígeno basal que menos islotes, con activación robusta y represión de la respiración en respuesta a la manipulación farmacológica. Destacamos los pasos para prepararnos para el ensayo, un método eficaz para la carga constante de islotes en el centro de cada pozo, y desafíos comunes al realizar este ensayo.
Protocol
Representative Results
Discussion
El estudio del consumo de oxígeno de los islotes se ha visto obstaculizado anteriormente por la forma esférica de los islotes, su falta de adherencia a las superficies de cultivo y el número de islotes requeridos por pozo. En este protocolo, destacamos la eficacia de la microplaca esferoide de 96 pocillos para medir el consumo de oxígeno de los islotes en un pequeño número de islotes y demostramos una técnica para manipular y cargar islotes que es técnicamente factible y produce Resultados.
<p class="jove_con…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores desean reconocer el Núcleo de Cribado de Alto Rendimiento de Vanderbilt por el uso de sus instalaciones, Agilent Biotechnologies, el Dr. Paul Kievit (Universidad de Salud y Ciencia de Oregón) para los aislamientos de islas de primates no humanos, y Eric Donahue (Universidad DeVanderbilt) para obtener ayuda con la Figura 1. J.M.E. fue apoyado por NIGMS de los Institutos Nacionales de Salud bajo el número de premio T32GM007347. M.G. fue apoyado por el NIH/NIDDK (R24DK090964-06) y el Departamento de Asuntos de Veteranos (BX003744).
Materials
| Cell culture dish, 60 mm X 15 mm style | Corning | 430166 | |
| Cell-Tak Cell and Tissue Adhesive | Corning | 354240 | |
| Conical tube, 50 mL | Falcon | 352070 | |
| Dextrose anhydrous | Fisher Scientific | BP350-1 | For glucose solution, 200 mg/ml, sterile filetered |
| Disposable reservoirs (sterile), 25 ML | Vistalab | 3054-1033 | for loading multichannel pipet |
| EZFlow Sterile 0.45 μm PES Syringe Filter, 13 mm | Foxx Life Sciences | 371-3115-OEM | |
| L-glutamine | Gibco | 25030-081 | 200 mM (100x) |
| Multichannel pipette tips | ThermoFisher Scientific | 94410810 | |
| Multichannel pipette, 15-1250 μL | ThermoFisher Scientific | 4672100BT | Recommended |
| P20, P200, and P1000 pipettes | Eppendorf | 2231000602 | |
| pH Probe | Hanna Instruments | HI2210-01 | |
| Pipette tips, 20 μL, 200 μL, 1000 μL | Olympus | 24-404, 24-412, 24-430 | |
| Seahorse XF Base Media | Agilent | 103334-100 | |
| Seahorse XF Cell Mito Stress Test Kit | Agilent | 103015-100 | Includes Oligomycin, FCCP, and Rotenone/Antimycin A |
| Seahorse XFe96 Analyzer | Agilent | S7800B | Including prep station with 37 °C non-CO2 incubator |
| Seahorse XFe96 Spheroid Fluxpak Mini | Agilent | 102905-100 | Includes sensor cartridge, spheroid microplate, and calibrant |
| Sodium bicarbonate | Fisher Scientific | BP328-500 | |
| Sodium pyruvate | Gibco | 11360-070 | 100 mM (100x) |
| Stereo Microscope | Olympus | SZX9 | |
| Syringe (sterile), 5 mL | BD | 309603 | For sterile filtration |
| Water (sterile) | Sigma | W3500-500mL |
References
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