Analisi del consumo di ossigeno dell'isola pancreatica del primate non umano
Summary
Questo protocollo dimostra la misurazione accurata e riproducibile del consumo di ossigeno nelle isole pancreatiche dei primati non umani. Le tecniche di caricamento dell’isolotto e il rivestimento della micropiastra forniscono un quadro per la misurazione efficiente della respirazione in altri tipi di sferoidi coltivati.
Abstract
La misurazione del consumo di ossigeno in gruppi di sferoidi di cellule, come le isole pancreatiche ex vivo, è stata storicamente impegnativa. Dimostriamo la misurazione del consumo di ossigeno alle irate utilizzando una micropiastra da 96 pozzetto progettata per la misurazione del consumo di ossigeno negli sferoidi. In questo analisi, le microplacche sferoidi sono rivestite con un adesivo per cellule e tessuti il giorno prima del saggio. Utilizziamo un piccolo volume di soluzione adesiva per incoraggiare l’aderenza alle alteienze solo sul fondo del pozzo. Il giorno del saggio, 15 isolotti vengono caricati direttamente nella base di ogni pozzo utilizzando una tecnica che garantisce un posizionamento ottimale delle isole e una misurazione accurata del consumo di ossigeno. Vari aspetti della respirazione mitocondriale sono sondati farmacologicamente in isolotti di primati non umani, tra cui la respirazione dipendente dall’ATP, la respirazione massima e la perdita di protoni. Questo metodo consente risultati coerenti e riproducibili utilizzando solo un piccolo numero di isolotti per pozzo. Teoricamente può essere applicato a qualsiasi sferoide coltivato di dimensioni simili.
Introduction
Al fine di mantenere i normali livelli di glucosio nel sangue, la cellula pancreatica deve rilevare le elevazioni nel glucosio e secernere insulina di conseguenza. L’accoppiamento della secrezione di insulina con i livelli di glucosio è direttamente collegato al metabolismo del glucosio e alla produzione di ATP attraverso il fosforonte ossidativo mitocondriale. Così, i mitocondri svolgono un ruolo fondamentale nell’accoppiamento stimolo-secrezione1. La valutazione della funzione mitocondriale a cellule z può rivelare difetti che portano a una compromissione della secrezione di insulina. Anche la secrezione di cellule glucagoniche è strettamente legata alla funzione mitocondriale2. Anche se le linee cellulari isolate immortalate si sono dimostrate utili per alcuni tipi di saggi, la fisiologia di queste cellule non riassume con precisione la funzione dell’isolotto intero, come dimostra la potenziazione della secrezione di insulina da glucagon3,4 e l’inibizione della secrezione glucagona da parte di insulina / somatostatina5,6 in isolotti intatti. Questo dimostra la necessità di misurare il consumo di ossigeno utilizzando isolotti interi e intatti.
Le tecniche per la misurazione della respirometria delle cellule isolli si sono evolute nel tempo, dall’uso di coloranti fluorescenti sensibili all’ossigeno7 ai sensori allo stato solido che misurano direttamente il consumo di ossigeno8. Inizialmente progettati per monostrato, cellule aderenti, sistemi di piastra di coltura cellulare comunemente utilizzati hanno dimostrato di essere inefficaci per le isole pancreatiche. Poiché le isolotti non aderiscono naturalmente ai pozzi, sono inclini ad essere spinti alla periferia della coltura e con conseguente misurazione imprecisa del consumo di ossigeno9. Per combattere questo problema, sono state sviluppate piastre specializzate a 24 pozzetti con una depressione centrale che potrebbe contenere isolotti9. Tuttavia, il sistema a piastre 24 pozzi era limitato dal gran numero di isolotti richiesti (50-80 per pozzo) e dal numero di condizioni che potevano essere testate contemporaneamente10. Il recente sviluppo di microplacche da 96 pozzetti progettate specificamente per l’analisi del flusso extracellulare negli sferoidi ha superato queste barriere, consentendo la misurazione dell’iletmetria con 20 o meno isolotti per pozzo10.
Qui, dimostriamo l’uso di questo sistema per misurare il consumo di ossigeno in isolotti dal macaco giapponese (Macaca fuscata), un modello animale con biologia simile isolotto agli esseri umani11,12. In questo protocollo vengono analizzate 15 isole di macachi per pozzo. Nelle nostre mani, 15 isole per bene prodotto un maggiore consumo di ossigeno di base rispetto a meno isole, con robusta attivazione e repressione della respirazione in risposta alla manipolazione farmacologica. Mettiamo in evidenza i passaggi per preparare il saggio, un metodo efficace per un carico coerente di isolotti al centro di ogni pozzo e sfide comuni quando si esegue questo saggio.
Protocol
Representative Results
Discussion
Lo studio del consumo di ossigeno alle isole è stato in precedenza ostacolato dalla forma sferica delle isole, dalla loro mancanza di aderenza alle superfici di coltura e dal numero di isolotti necessari per ogni pozzo. In questo protocollo, mettiamo in evidenza l’efficacia della micropiastra sferoide da 96 pozzetto per misurare il consumo di ossigeno nelle isole su un piccolo numero di isolotti e dimostriamo una tecnica per la movimentazione e il caricamento delle isole tecnicamente fattibile e che produce Risultati.</…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori desiderano riconoscere il Vanderbilt High Throughput Screening Core per l’uso delle loro strutture, Agilent Biotechnologies, Dr. Paul Kievit (Oregon Health and Science University) per isolazioni di isolotti di primati non umani, e Eric Donahue (Vanderbilt University) per l’assistenza con Figura 1. J.M.E. è stato sostenuto dal NIGMS del National Institutes of Health con il numero di premio T32GM007347. M.G. è stato supportato dal NIH/NIDDK (R24DK090964-06) e dal Department of Veterans Affairs (BX003744).
Materials
| Cell culture dish, 60 mm X 15 mm style | Corning | 430166 | |
| Cell-Tak Cell and Tissue Adhesive | Corning | 354240 | |
| Conical tube, 50 mL | Falcon | 352070 | |
| Dextrose anhydrous | Fisher Scientific | BP350-1 | For glucose solution, 200 mg/ml, sterile filetered |
| Disposable reservoirs (sterile), 25 ML | Vistalab | 3054-1033 | for loading multichannel pipet |
| EZFlow Sterile 0.45 μm PES Syringe Filter, 13 mm | Foxx Life Sciences | 371-3115-OEM | |
| L-glutamine | Gibco | 25030-081 | 200 mM (100x) |
| Multichannel pipette tips | ThermoFisher Scientific | 94410810 | |
| Multichannel pipette, 15-1250 μL | ThermoFisher Scientific | 4672100BT | Recommended |
| P20, P200, and P1000 pipettes | Eppendorf | 2231000602 | |
| pH Probe | Hanna Instruments | HI2210-01 | |
| Pipette tips, 20 μL, 200 μL, 1000 μL | Olympus | 24-404, 24-412, 24-430 | |
| Seahorse XF Base Media | Agilent | 103334-100 | |
| Seahorse XF Cell Mito Stress Test Kit | Agilent | 103015-100 | Includes Oligomycin, FCCP, and Rotenone/Antimycin A |
| Seahorse XFe96 Analyzer | Agilent | S7800B | Including prep station with 37 °C non-CO2 incubator |
| Seahorse XFe96 Spheroid Fluxpak Mini | Agilent | 102905-100 | Includes sensor cartridge, spheroid microplate, and calibrant |
| Sodium bicarbonate | Fisher Scientific | BP328-500 | |
| Sodium pyruvate | Gibco | 11360-070 | 100 mM (100x) |
| Stereo Microscope | Olympus | SZX9 | |
| Syringe (sterile), 5 mL | BD | 309603 | For sterile filtration |
| Water (sterile) | Sigma | W3500-500mL |
References
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