ניתוח של שאינם אנושיים הלבלב של איון צריכת החמצן
Summary
פרוטוקול זה מדגים את המדידה המדויקת והניתנת לכימות של צריכת החמצן באיונים שאינם אנושיים הלבלב. שיטות הטעינה של איון וציפוי המיקרופלטה מספקות מסגרת למדידת יעילות של נשימה בסוגים אחרים של הספרואידים מתורבתים.
Abstract
המדידה של צריכת החמצן באשכולות ספרואיד של תאים, כגון איולי לשעבר vivo הלבלב, היסטורית היה מאתגר. אנו להדגים את המדידה של צריכת חמצן של איון באמצעות 96-ובכן מיקרופלייט המיועדים למדידת צריכת החמצן ב spheroids. בתוך מעשה זה, מיקרולוחיות ספרואיד מצופות בדבק תא ורקמה ביום שלפני השיטת הפעולה. אנו מנצלים נפח קטן של הפתרון דבק כדי לעודד הדבקות איון רק בתחתית הבאר. ביום השימוש, 15 איונים נטענים ישירות לבסיס של כל הבאר באמצעות טכניקה המבטיחה מיקום אופטימלי של איונים ומדידה מדויקת של צריכת החמצן. היבטים שונים של נשימה מיטוכונדריאלי מאובטים באופן פרמקולוגית באיונים לא אנושיים, כולל נשימה תלוית ATP, נשימה מירבית ודליפת פרוטון. שיטה זו מאפשרת לתוצאות עקביות, הניתן לשימוש באמצעות מספר קטן של איונים לכל טוב. זה יכול תיאורטית להיות מיושם על כל הרוהרואידים תרבותי בגודל דומה.
Introduction
על מנת לשמור על רמות הגלוקוז בדם נורמלי, התא β הלבלב חייב לחוש את הגבהים בגלוקוז ולהפריש אינסולין בהתאם. צימוד הפרשת האינסולין עם רמות הגלוקוז קשור ישירות לחילוף החומרים של הגלוקוז ולייצור ATP דרך זרחון חמצוני מיטוכונדריאלי. כך, המיטו, לשחק תפקיד קריטי הפרשות הגירוי צימוד1. הערכת β-מיטוכונדריאלי-תא יכולה לחשוף פגמים המובילים לפגיעה באינסולין. הפרשה של גלוקגון על ידי תאים הלבלב α הוא גם קשור הדוק פונקציה מיטוכונדריאלי2. למרות מונצח קווי התא הוכיחו שימושי עבור סוגים מסוימים של assays הפיזיולוגיה של תאים אלה אינה מדויקת באופן מדויק הפונקציה איון שלם, כפי שמודגם על ידי פוטנציאל של הפרשת אינסולין על ידי גלוקגון3,4 ואת עיכוב הפרשת גלוקגון על ידי אינסולין/סומטוסטטין5,6 ב איים שלמים. זה מדגים את הצורך מדידת צריכת החמצן באמצעות איים שלמים, שלם.
טכניקות עבור המדידה של תא מוריקה של התא איון התפתחו לאורך זמן, מהשימוש של צבעי פלורסנט רגישים חמצן7 כדי חיישנים במצב מוצק כי מדידת ישירות צריכת החמצן8. תוכנן בתחילה עבור monolayer, תאים חסיד, בדרך כלל מערכות השימוש בתרבות התא הוכיחו להיות לא יעילים עבור איולי הלבלב. כמו האיים לא לדבוק באופן טבעי הבארות, הם נוטים להיות נדחף לפריפריה של התרבות היטב וכתוצאה מכך מדידה לא מדויקת של צריכת החמצן9. כדי להילחם בבעיה זו, לוחיות 24-היטב מיוחדות עם דיכאון מרכזי שיכול להכיל איונים פותחו9. עם זאת, הצלחת 24-באר מערכת היה מוגבל על ידי מספר גדול של איונים נדרש (50-80 לכל טוב) ואת מספר התנאים שניתן היה לבדוק בו10. ההתפתחות האחרונה של 96-מיקרולוחיות היטב תוכנן במיוחד עבור ניתוח השטף החילוץ ב spheroids יש להתגבר על המחסומים האלה, המאפשר את המדידה של איון הגז מוריקה עם 20 או פחות איים לכל טוב10.
כאן, אנו להדגים את השימוש במערכת זו כדי למדוד צריכת חמצן באיים מ מקוק יפני (macaca פאסכאטה), מודל בעל חיים עם ביולוגיה איון דומה לבני אדם11,12. , בפרוטוקול זה. מנתחים 15 מקוק בבאר בידינו, 15 איונים לכל התוצרת הגבוהה בסיסית צריכת החמצן הבסיסית מאשר פחות איונים, עם הפעלה חזקה ודיכוי של נשימה בתגובה טיפול תרופתי. אנו מדגישים את הצעדים להכנה לצורך התמדה, שיטה אפקטיבית להעלאת האיונים העקביים במרכז הבאר, ואתגרים משותפים בעת ביצוע הצורך.
Protocol
Representative Results
Discussion
המחקר של צריכת חמצן של איון כבר הושפע בעבר על ידי הצורה כדורית של איונים, חוסר הדבקות שלהם משטחי התרבות, ואת מספר איונים נדרש לכל טוב. בפרוטוקול זה, אנו להדגיש את היעילות של 96-היטב מיקרו-לוחית ספרואיד עבור מדידת צריכת החמצן של איון על מספר קטן של איונים ולהדגים טכניקה לטיפול וטעינת איונים שה…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים רוצים להכיר את הליבה של תפוקה גבוהה של ואנדרבילט ההקרנה לשימוש המתקנים שלהם, Agilent Biotechnologies, ד ר. פול Kievit (אורגון בריאות ומדע האוניברסיטה) עבור הפרימטים שאינם אנושיים, ו אריק דונהיו (אוניברסיטת ואנדרבילט) לסיוע עם איור 1. J.M.E. של המכון הלאומי לבריאות תחת מספר הפרס T32GM007347. מ היה נתמך על ידי NIH/NIDDK (R24DK090964-06) ואת המחלקה לעניינים ותיקי (BX003744).
Materials
| Cell culture dish, 60 mm X 15 mm style | Corning | 430166 | |
| Cell-Tak Cell and Tissue Adhesive | Corning | 354240 | |
| Conical tube, 50 mL | Falcon | 352070 | |
| Dextrose anhydrous | Fisher Scientific | BP350-1 | For glucose solution, 200 mg/ml, sterile filetered |
| Disposable reservoirs (sterile), 25 ML | Vistalab | 3054-1033 | for loading multichannel pipet |
| EZFlow Sterile 0.45 μm PES Syringe Filter, 13 mm | Foxx Life Sciences | 371-3115-OEM | |
| L-glutamine | Gibco | 25030-081 | 200 mM (100x) |
| Multichannel pipette tips | ThermoFisher Scientific | 94410810 | |
| Multichannel pipette, 15-1250 μL | ThermoFisher Scientific | 4672100BT | Recommended |
| P20, P200, and P1000 pipettes | Eppendorf | 2231000602 | |
| pH Probe | Hanna Instruments | HI2210-01 | |
| Pipette tips, 20 μL, 200 μL, 1000 μL | Olympus | 24-404, 24-412, 24-430 | |
| Seahorse XF Base Media | Agilent | 103334-100 | |
| Seahorse XF Cell Mito Stress Test Kit | Agilent | 103015-100 | Includes Oligomycin, FCCP, and Rotenone/Antimycin A |
| Seahorse XFe96 Analyzer | Agilent | S7800B | Including prep station with 37 °C non-CO2 incubator |
| Seahorse XFe96 Spheroid Fluxpak Mini | Agilent | 102905-100 | Includes sensor cartridge, spheroid microplate, and calibrant |
| Sodium bicarbonate | Fisher Scientific | BP328-500 | |
| Sodium pyruvate | Gibco | 11360-070 | 100 mM (100x) |
| Stereo Microscope | Olympus | SZX9 | |
| Syringe (sterile), 5 mL | BD | 309603 | For sterile filtration |
| Water (sterile) | Sigma | W3500-500mL |
References
- Mulder, H. Transcribing β-cell mitochondria in health and disease. Molecular Metabolism. 6 (9), 1040-1051 (2017).
- Maechler, P., Wollheim, C. B. Mitochondrial signals in glucose-stimulated insulin secretion in the beta cell. The Journal of Physiology. 529 (Pt 1), 49-56 (2000).
- Curry, D. L. Glucagon Potentiation of Insulin Secretion by the Perfused Rat Pancreas. Diabetes. 19 (6), 420 (1970).
- Song, G., Pacini, G., Ahrén, B., D’Argenio, D. Z. Glucagon Increases Insulin Levels by Stimulating Insulin Secretion Without Effect on Insulin Clearance in Mice. Peptides. 88, 74-79 (2017).
- Vergari, E., et al. Insulin inhibits glucagon release by SGLT2-induced stimulation of somatostatin secretion. Nature Communications. 10 (1), 139 (2019).
- Watts, M., Ha, J., Kimchi, O., Sherman, A. Paracrine regulation of glucagon secretion: the β/α/δ model. American Journal of Physiology–Endocrinology and Metabolism. 310 (8), E597-E611 (2016).
- Sweet, I. R., et al. Continuous measurement of oxygen consumption by pancreatic islets. Diabetes Technology & Therapeutics. 4 (5), 661-672 (2002).
- . Agilent Seahorse XF Instruments Overview and Selection Guide Available from: https://www.agilent.com/en/products/cell-analysis/seahorse-xf-instruments-selection-guide (2019)
- Wikstrom, J. D., et al. A novel high-throughput assay for islet respiration reveals uncoupling of rodent and human islets. PLoS One. 7 (5), e33023 (2012).
- Taddeo, E. P., et al. Individual islet respirometry reveals functional diversity within the islet population of mice and human donors. Molecular Metabolism. 16, 150-159 (2018).
- Conrad, E., et al. The MAFB transcription factor impacts islet alpha-cell function in rodents and represents a unique signature of primate islet beta-cells. American Journal of Physiology–Endocrinology and Metabolism. 310 (1), E91-E102 (2016).
- Steiner, D. J., Kim, A., Miller, K., Hara, M. Pancreatic islet plasticity: interspecies comparison of islet architecture and composition. Islets. 2 (3), 135-145 (2010).
- Elsakr, J. M., et al. Maternal Western-style diet affects offspring islet composition and function in a non-human primate model of maternal over-nutrition. Molecular Metabolism. , (2019).
- Soutar, M. P. M., et al. FBS/BSA media concentration determines CCCP’s ability to depolarize mitochondria and activate PINK1-PRKN mitophagy. Autophagy. , 1-10 (2019).
- Hirshberg, B., et al. Pancreatic Islet Transplantation Using the Nonhuman Primate (Rhesus) Model Predicts That the Portal Vein Is Superior to the Celiac Artery as the Islet Infusion Site. Diabetes. 51 (7), 2135-2140 (2002).
- Divakaruni, A. S., Paradyse, A., Ferrick, D. A., Murphy, A. N., Jastroch, M. Analysis and interpretation of microplate-based oxygen consumption and pH data. Methods in Enzymology. 547, 309-354 (2014).
- Papas, K. K., et al. Islet Oxygen Consumption Rate (OCR) Dose Predicts Insulin Independence in Clinical Islet Autotransplantation. PLoS One. 10 (8), e0134428 (2015).
