Analyse de la consommation d'oxygène des primates non humains
Summary
Ce protocole démontre la mesure précise et reproductible de la consommation d’oxygène dans les îlots pancréatiques non-humains de primate. Les techniques de chargement des îfles et le revêtement de la microplaque fournissent un cadre pour une mesure efficace de la respiration dans d’autres types de sphéroïdes cultivés.
Abstract
La mesure de la consommation d’oxygène dans les amas sphéroïdes des cellules, telles que les îlots pancréatiques ex vivo, a historiquement été difficile. Nous démontrons la mesure de la consommation d’oxygène d’îtte utilisant une microplaque de 96 puits conçue pour la mesure de la consommation d’oxygène dans les sphéroïdes. Dans cet analyse, les microplaques sphéroïdes sont recouvertes d’un adhésif cellulaire et tissulaire la veille de l’analyse. Nous utilisons un petit volume de solution adhésive pour encourager l’adhérence des îcles au fond du puits. Le jour de l’analyse, 15 îlots sont chargés directement dans la base de chaque puits à l’aide d’une technique qui assure un positionnement optimal des îlots et une mesure précise de la consommation d’oxygène. Divers aspects de la respiration mitochondriale sont sondés pharmacologiquement dans les îlots de primates non humains, y compris la respiration dépendante de l’ATP, la respiration maximale et la fuite de protons. Cette méthode permet des résultats cohérents et reproductibles en utilisant seulement un petit nombre d’îlots par puits. Il peut théoriquement être appliqué à tous les sphéroïdes cultivés de taille similaire.
Introduction
Afin de maintenir des niveaux normaux de glucose dans le sang, la cellule pancréatique doit sentir des élévations dans le glucose et sécrédre l’insuline en conséquence. Le couplage de la sécrétion d’insuline avec les niveaux de glucose est directement lié au métabolisme de glucose et à la production de l’ATP par la phosphorylation oxydative mitochondriale. Ainsi, les mitochondries jouent un rôle critique dans le couplage stimulus-sécrétion1. L’évaluation de la fonction mitochondriale à cellules d’A peut révéler des défauts qui mènent à la sécrétion altérée d’insuline. La sécrétion de glucagon par les cellules pancréatiques est également étroitement liée à la fonction mitochondriale2. Bien que les lignées cellulaires immortalisées d’îlots se soient avérées utiles pour certains types d’essais, la physiologie de ces cellules ne récapitule pas avec précision la fonction des îlots entiers, comme l’illustre la potentialisation de la sécrétion d’insuline par le glucagon3,4 et l’inhibition de la sécrétion de glucagon par l’insuline/somatostatine5,6 dans les îlots intacts. Cela démontre la nécessité de mesurer la consommation d’oxygène à l’aide d’îlots entiers intacts.
Les techniques de mesure de la réspirométrie des cellules des îtaux ont évolué au fil du temps, de l’utilisation de colorants fluorescents sensibles à l’oxygène7 à des capteurs à l’état solide qui mesurent directement la consommation d’oxygène8. Initialement conçus pour monolayer, les cellules adhérentes, les systèmes de plaque de culture cellulaire couramment utilisés se sont avérés inefficaces pour les îlots pancréatiques. Comme les îlots n’adhèrent pas naturellement aux puits, ils sont enclins à être poussés à la périphérie de la culture bien résultant en une mesure inexacte de la consommation d’oxygène9. Pour lutter contre ce problème, des plaques spécialisées de 24 puits avec une dépression centrale qui pourrait contenir des îlots ont été développées9. Cependant, le système de plaque de 24 puits a été limité par le grand nombre d’îlots requis (50-80 par puits) et le nombre de conditions qui pourraient être testées simultanément10. Le développement récent de microplates de 96 puits conçues spécifiquement pour l’analyse des flux extracellulaires chez les sphéroïdes a permis de surmonter ces obstacles, permettant de mesurer la réspirométrie des îlots avec 20 îlots ou moins par puits10.
Ici, nous démontrons l’utilisation de ce système pour mesurer la consommation d’oxygène dans les îlots du macaque japonais (Macaca fuscata), un modèle animal avec la biologie des îlots similaires à l’homme11,12. Dans ce protocole, 15 îlots de macaque sont analysés par puits. Dans nos mains, 15 îlots par puits ont produit une consommation d’oxygène de base plus élevée que moins d’îlots, avec une activation robuste et la répression de la respiration en réponse à la manipulation pharmacologique. Nous soulignons les étapes pour préparer l’effort, une méthode efficace pour le chargement constant des îlots au centre de chaque puits, et des défis communs lors de l’exécution de cet effort.
Protocol
Representative Results
Discussion
L’étude de la consommation d’oxygène des îlots a déjà été entravée par la forme sphérique des îlots, leur manque d’adhérence aux surfaces de culture et le nombre d’îlots requis par puits. Dans ce protocole, nous soulignons l’efficacité de la microplaque sphéroïde de 96 puits pour mesurer la consommation d’oxygène d’îlots sur un petit nombre d’îlots et démontrons une technique pour la manipulation et le chargement des îlots qui est techniquement faisable et produit cohérente Résultats.
<p class="…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs aimeraient remercier le Vanderbilt High Throughput Screening Core pour l’utilisation de leurs installations, Agilent Biotechnologies, le Dr Paul Kievit (Oregon Health and Science University) pour les isolements non humains des îaux de primates, et Eric Donahue (Université Vanderbilt) pour l’aide à la figure 1. J.M.E. a été soutenu par nigMS des National Institutes of Health sous le numéro de récompense T32GM007347. M.G. a reçu l’appui des NIH/NIDDK (R24DK090964-06) et du ministère des Anciens Combattants (BX003744).
Materials
| Cell culture dish, 60 mm X 15 mm style | Corning | 430166 | |
| Cell-Tak Cell and Tissue Adhesive | Corning | 354240 | |
| Conical tube, 50 mL | Falcon | 352070 | |
| Dextrose anhydrous | Fisher Scientific | BP350-1 | For glucose solution, 200 mg/ml, sterile filetered |
| Disposable reservoirs (sterile), 25 ML | Vistalab | 3054-1033 | for loading multichannel pipet |
| EZFlow Sterile 0.45 μm PES Syringe Filter, 13 mm | Foxx Life Sciences | 371-3115-OEM | |
| L-glutamine | Gibco | 25030-081 | 200 mM (100x) |
| Multichannel pipette tips | ThermoFisher Scientific | 94410810 | |
| Multichannel pipette, 15-1250 μL | ThermoFisher Scientific | 4672100BT | Recommended |
| P20, P200, and P1000 pipettes | Eppendorf | 2231000602 | |
| pH Probe | Hanna Instruments | HI2210-01 | |
| Pipette tips, 20 μL, 200 μL, 1000 μL | Olympus | 24-404, 24-412, 24-430 | |
| Seahorse XF Base Media | Agilent | 103334-100 | |
| Seahorse XF Cell Mito Stress Test Kit | Agilent | 103015-100 | Includes Oligomycin, FCCP, and Rotenone/Antimycin A |
| Seahorse XFe96 Analyzer | Agilent | S7800B | Including prep station with 37 °C non-CO2 incubator |
| Seahorse XFe96 Spheroid Fluxpak Mini | Agilent | 102905-100 | Includes sensor cartridge, spheroid microplate, and calibrant |
| Sodium bicarbonate | Fisher Scientific | BP328-500 | |
| Sodium pyruvate | Gibco | 11360-070 | 100 mM (100x) |
| Stereo Microscope | Olympus | SZX9 | |
| Syringe (sterile), 5 mL | BD | 309603 | For sterile filtration |
| Water (sterile) | Sigma | W3500-500mL |
References
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