微生物通过微血管内皮细胞对血脑屏障渗透性分析

1. 制备缓冲液和试剂 在1L玻璃瓶中加入1L双蒸馏H2O中的1L玻璃瓶中，加入10克氯化钠（NaCl）、2克氯化钾（KCl）、14.4克磷酸二氢二水合酸钠（Na2HPO4 + 2H2O）和2克磷酸钾（KH2PO4），制备10倍磷酸盐缓冲盐（10x PBS）。 高压灭菌10xPBS溶液，在900 mL的双蒸馏水中稀释100 mL，以获得1x PBS。 使用高压灭菌器对溶液进行灭菌。将玻璃瓶放入篮中，合上盖子，在 121 °C 和 98.9 kPa 下消毒 15 分钟。注：此协议始终用于进一步步骤中的高压灭菌解决方案。 通过稀释 0.5 mg/mL 纤维素溶液和 0.3 mg/mL 胶原蛋白 IV 溶液，在 1.5 mL 微管中分别使用 1x PBS 至 100 mg/μL 等分，制备 10 μg/mL 胶原蛋白 IV 和 10 μg/mL 纤维素溶液。此后，将两种等分的100μL与1，800μL的1x PBS混合在2 mL微管中，并将其储存在-20°C。 通过在培养基中加入4%的胎儿牛血清和2 mM L-谷氨酰胺和100毫克/L青霉素/链霉素，制备DMEM/F-12培养基，并将其储存在4°C。 在 50 mL 管中稀释 45 mL 的 1x PBS 的 10x 浓缩胰蛋白酶-EDTA 溶液的 5 mL，制备 1x 胰蛋白酶-EDTA 溶液并将其储存在 4°C。 在 500 mL 玻璃瓶中称量 10 g LB 肉汤底座，制备 500 mL LB 介质。加入500 mL的消毒水，并高压灭菌。 在 500 mL 玻璃瓶中称量 10 g LB 肉汤底座和 7.5 g 的琼脂，准备 LB 琼脂。在高压灭菌前加入500 mL的消毒水，不要关闭烧瓶盖。高压灭菌器，让溶液冷却，直到接触时温暖。 通过在 DMEM/F-12 介质中加入 4% 的胎儿牛血清和 2 mM L-谷氨酰胺，但不含青霉素/链霉素，并将其储存在 4°C，如步骤 1.3 中一样，制备无抗生素培养基。 2. 血脑屏障模拟细胞的生长 要组装 12 孔板，请将细胞培养物插入孔中（图2A）。 将板和每个刀片解压在生物安全柜中，并在那里执行进一步步骤。使用消毒钳抓住刀片在其宽基上移动它。 用90μL的10微克/mL胶原蛋白IV和10μg/mL纤维蛋白混合物覆盖每个刀片的多孔膜。在细胞培养箱中孵育12孔板24小时，在37°C下孵化（图2B）。 将 1 mL 的 1x PBS 移入每个刀片，然后用真空泵吸出溶液，用于细胞培养，将刀片洗涤两次。 通过在上部移液 0.5 mL 的预预热 DMEM/F-12 介质和下腔室的 1.5 mL 来平衡膜。在具有5%CO2大气的细胞培养箱中，在37°C下孵育板30分钟（图2C）。 种子2 x 105人类微血管内皮细胞进入每个上腔，并在细胞培养箱中以37°C孵育12孔板（图2D）。 使用真空泵从细胞培养液中吸出培养基，然后通过移液 10 mL 的 1x PBS 清洗单层，然后用真空泵对溶液进行吸气。 将溶液的5 mL移液液液移入细胞培养瓶，用1x浓缩胰蛋白酶-EDTA完全覆盖细胞。在细胞培养箱中37°C下孵育烧瓶3-5分钟。注：如果细胞未分离，请用力将烧瓶敲打手掌，以清除细胞。 在15 mL管中，将5mL与移液器作为电池悬浮液的等分，并加入5 mL的含FCS介质，以阻止酶反应。 在 210 x g下将悬浮液离心 3 分钟，用真空泵去除上清液，用移液器将颗粒重新悬浮在 5 mL 的介质中。 将细胞悬浮液的10μL与10μL的0.4%锥蓝色染色剂混合在1.5 mL微管中，使用细胞计数器。将10μL的混合物加入计数室滑块，放入细胞计数器，然后开始计数。 将计数器聚焦在单元格上，使其边缘为深蓝色和中间白色。之后，启动适当的细胞计数程序。 要计算每个刀片的体积，请将每刀片获得的 2 x 105个单元格与细胞悬浮液的计算浓度分开。 3. 血脑屏障模型的培养 在37°C下孵育12孔板14天。 上腔室的介质更换 0.5 mL，下腔介质每 2-3 天更换 1.5 mL。在将介质放入电池瓶之前，请将其加热。真空泵吸气 （图 2E）。注：小心工作，避免接触膜。 通过显微镜成像细胞，检查细胞的状态，并确定汇合。确保14天后汇合度为100%。 4. 细菌的制备 测量前一天，将大肠杆菌菌株的菌群化为LB介质。在37°C下孵育培养管24小时，在孵育摇床中孵育180rpm（图2F）。 在 4°C 的 LB 琼脂板上培养大肠杆菌菌株。取一个带消毒的采摘管，并将采摘放入具有 3 mL LB 介质的制备培养管中。 为每个刀片准备一个 LB 琼脂板，并填充培养皿，将其总体积减半。让他们变成固体，并存储在4°C。 5. 细胞治疗 播种后的第14天，用化合物处理细胞或测量转皮电阻（TEER），如果计划（图2G）。注： 始终有一些未经处理的细胞作为控件。 要用感兴趣的化合物处理细胞，将该化合物稀释到DMEM/F-12介质中的最终浓度。将0.5 mL的混合物加入上腔室，将1.5 mL添加到下腔。在细胞培养箱中孵育所需的时间。 之后，通过真空泵吸气和移液，用无抗生素介质交换完整的介质（图2H）。 6. 渗透性测量 要获得恒定浓度的细菌，使用波长为 600 nm 的光度计测量光学密度。在 50 mL 猎鹰管中用 LB 培养基将细菌的隔夜溶液稀释到 OD600 0.5 ± 0.05。在冰上工作。 将 1 mL 的 LB 介质填充到比色皿中。启动光度计，将比色皿放入，标记的一侧向前。按底部”空白”以测量空白值之后。 通过将细菌溶液填充到比色皿中，放入，并按压底部样品，测量细菌溶液的密度。在稀释过程中重复测量，直到获得最终浓度。 在生物安全柜中工作，在 OD600 = 0.5 处，可以使用准备好的 12 孔板和细菌溶液处理细菌。将450μL的细菌溶液只加入每个含有0.5 mL的介质的上腔（图2I）。 在培养箱中孵育12孔板6小时，温度为37°C。注： 协议要求在此处暂停。 用移液器从每个下腔室取出带钳子的刀片，将介质的 50 μL 采样（图 2J）。小心不要将介质从上部腔泄漏到下腔。 将每个样品放在单独的琼脂板上（图2K）。将样品掉落在板上，用细胞扩张器条纹溶液。 在孵化器中，在37°C下孵育琼脂板24小时。 计算每个板中的菌落（图 2L）。 7. 分析数据 将数据写在表中，并计算已观察到的已处理和未经处理的细胞群的平均值和标准偏差。 将平均值显示为菌落的绝对数量。 要使结果规范化，通过将所有结果与控制值分开来计算菌落的相对数量。 图 2：协议中各个步骤的详细演示。（A） 将带消毒钳子的刀片放入 12 孔板中。（B） 用90μL的纤维素和胶原蛋白IV混合物覆盖每个插入物，孵育24小时（C）用预热培养基将膜模平衡30分钟（D）种子2 x 105人脑微血管内皮细胞。（E） 在适当的时间内培育盘子.（F） 测量前一天，将大肠杆菌菌群放入LB培养管中，孵育24小时（G）处理细胞或测量TEER。（H） 用无抗生素的培养基交换完整的介质。（I） 将450 μL的细菌溶液（OD600 + 0.5）加入每个上腔，孵育6小时（J）样品50μL的介质，从每个下腔取出带钳子的刀片。（K） 在琼脂板上将样品板板，孵育24小时 （L） 计数菌落并分析数据.请点击此处查看此图的较大版本。