Сопутствующей изоляции первичных астроцитов и микроглии для протозоа паразитарной инфекции
Summary
Общая цель этого протокола состоит в том, чтобы проинструктировать, поддерживать и отделять морина астроцитов и микроглии клеток из центральной нервной системы, а затем инфекции с паразитами простейшие.
Abstract
Астроциты и микроглии являются наиболее распространенными глиальными клетками. Они отвечают за физиологическую поддержку и гомеостазное обслуживание в центральной нервной системе (ЦНС). Растущие данные об их участии в борьбе с инфекционными заболеваниями оправдывают возникающую заинтересованность в совершенствовании методологий изоляции первичных астроцитов и микроглии для оценки их реакции на инфекции, влияющие на ЦНС. Учитывая влияние Трипаносома cruzi (T. cruzi) и Toxoplasma gondii (T. gondii) инфекции в ЦНС, здесь мы предоставляем метод для извлечения, поддержания, диссоциации и заражения морин астроцитов и микроглии клеток с паразитами простейши. Извлеченные клетки из новорожденных кортиков поддерживаются в пробирке в течение 14 дней с периодической дифференциальной заменой носителей. Астроциты и микроглии получаются из одного и того же протокола извлечения с помощью механической диссоциации. После фенотипирования цитометрией течения клетки заражаются паразитами простейшие паразиты. Скорость инфекции определяется флуоресценционной микроскопией в разных временных точках, что позволяет оценить дифференциальную способность глиальных клеток контролировать вторжение и репликацию простейшей. Эти методы представляют собой простые, дешевые и эффективные методы для изучения реакции астроцитов и микроглии на инфекции, открывая поле для дальнейшего нейроиммунологического анализа.
Introduction
ЦНС в основном состоит из нейронов и глиальных клеток1,,2,,3. Микроглия и астроциты являются наиболее распространенными клетками глии в ЦНС. Микроглия, резидент макрофаг, является иммунокомпетентным и фагоцитарной глии ячейки в ЦНС3,4, в то время как астроциты несут ответственность за поддержание гомеостаза и оказывают поддерживающие функции5.
Несмотря на глиальные клетки, классически известный, чтобы нести ответственность за поддержку и защиту нейронов6,7, новые функции этих клеток были описаны в недавней литературе, в том числе их ответы на инфекции8,9,10,11. Таким образом, есть толчок для разработки методов, чтобы изолировать эти глиальные клетки, чтобы понять их функции индивидуально.
Существуют некоторые альтернативные модели для изучения глиальных клеток, а не первичных культур, таких как увековеченные линии клеток и модели in vivo. Тем не менее, увековеченные клетки чаще подвергаются генетическим дрейфующим и морфологическим изменениям, в то время как исследования in vivo навязывают ограниченные условия манипуляции. И наоборот, первичные культуры просты в обращении, лучше напоминают в клетках vivo, а также позволяют нам контролировать экспериментальные факторы12,13. Здесь мы описываем руководящие принципы о том, как извлечь, поддерживать и разъединять морина астроцитов и микроглии первичных клеток в том же протоколе. Кроме того, мы также приведив примеры того, как работать с простейшой инфекцией в этих культурах.
Клетки ЦНС, извлеченные из неонатальных мышей (до 3 дней), культивировались в течение 14 дней на дифференциальных носителях, что позволяет преференциать росту астроцитов и клеток микроглии. Так как микроглия отдыхала над прикрепленными астроцитами, популяции клеток были механически разобщены в орбитальном инкубаторе. Затем мы собрали все супернатанты, содержащие микроглии и добавили трипсин, чтобы отделить астроциты. Изолированные глиальные клетки были фенотипически оценены цитометрией потока и покрывались в соответствии с желаемым экспериментом.
Мы также представили примеры того, как заразить эти изолированные микроглии и астроциты с простейшие паразиты. T. gondii является высоко нейротропных простейшие ответственность за токсоплазмоз14, в то время как T. cruzя несет ответственность за болезнь Шагаса, который может приводить к развитию неврологических расстройств в ЦНС15,16. Кроме того, было сообщено, что инфекция T. gondii17,18 или T. cruzi19,20,21были предполагаемой причиной смерти у пациентов с ослабленным иммунитетом.21 Поэтому большое значение имеет выяснение иммунологической роли глиальных клеток ЦНС в борьбе с простейшие инфекции.
Protocol
Representative Results
Discussion
В последние два десятилетия растет значение изучения функций изолированных глиальных клеток в различных биологических контекстах. Понимание ЦНС за нейроны по-прежнему растущее поле в клеточной биологии, особенно при инфекциях или воспалительных заболеваний8,<sup class…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы хотели бы поблагодарить профессора д-ра Ренато А. Мортару из Федерального университета Сан-Паулу (UNIFESP) за mAb 2C2 anti-Ssp-4. Эта работа была поддержана грантами от Фонда ампаро и Пескиса-ду-Эстадо-де-Сан-Паулу (FAPESP, грант 2017/25942-0 К.Р.Б.), Conselho Nacional de Desenvolvimento Cient’fico e Tecnol’gico (CNPq, грант 402100/2016-6 К.Р.Б.), Национальный институт сиенсии-де-Текнология де Вацинас (INCTV/CNPq) и Coordena’o de Aperfei’oamento de Pessoal de N’vel Superior (CAPES, Финансовый кодекс 001). M.P.A. получает стипендию от CNPq, A.L.O.P. получает стипендию от CAPES, а I.S.F и L.M.F.B. получает стипендию от FAPESP.
Materials
| 70% Ethanol | Dinâmica Química Contemporânea | Cat: 2231 | Sterilize |
| 75 cm2 Flask | Corning | Cat: 430720U | Plastic material |
| 96 well cell culture plate | Greiner Cellstar | Cat: 655090 | Cell culture |
| Ammonium Chloride (NH4Cl) | Dinâmica Química Contemporânea | Cat: C10337.01.AH | Remove autofluorescence |
| Anti-GFAP antibody | Abcam | Cat.: ab49874 | Immunofluorescence antidoby |
| Bottle Top Filter 0.22 mm CA | Corning | Cat: 430513 | Culture medium filter |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma Aldrich | Cat: A7906 | FACS Buffer preparation |
| CD11b (FITC) | BD Pharmigen | Cat.: 553310 | Flow cytometry antibody |
| CD45 (PE) | Invitrogen | Cat.: 12-0451-83 | Flow cytometry antibody |
| Centrifuge | Eppendorf | Cat: 5810R | Centrifugation |
| Centrifuge | Eppendorf | 5415R | Centrifugation |
| Class II biosafety cabinet | Pachane | Cat: 200 | Biosafety cabinet for sterile procedures |
| CO2 Incubator | ThermoScientific | Model: 3110 | Primary cells maintenance |
| Conical tubes 15 mL | Corning | Cat: 430766 | Plastic material |
| Conical tubes 50 mL | Corning | Cat: 352070 | Plastic material |
| Countess automated cell counter | Invitrogen | Cat: C10281 | Cell counter |
| DAPI | Invitrogen | Cat.: D1306 | Immunofluorescence antidoby |
| Digital Microscope Camera | Nikon | Cat: DS-RI1 | Capture images on microscope |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | Cat: 12800-058 | Cell culture medium |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma Aldrich | Cat: E9884 | FACS Buffer preparation |
| F12 Nutrient Mixture | Gibco | Cat: 21700-026 | Cell culture medium |
| FACS Canto II | BD Biosciences | Unavaiable | Flow cytometer |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | LGC Biotechnology | Cat: 10-bio500-1 | Cell culture medium supplement |
| Flow Jo (software) | Flow Jo | Version: Flow Jo_9.9.4 | Data analysis |
| Fluorescence intenselight | Nikon | Cat: C-HGFI | Fluorescence source |
| GFAP (APC) | Invitrogen | Cat.: 50-9892-82 | Flow cytometry antibody |
| Goat – anti-mouse IgG (FITC) | Kirkeegood&Perry Lab (KPL) | Cat.: 172-1806 | Immunofluorescence antidoby |
| HBSS – Hank's Balanced Salt Solution | Gibco | Cat: 14175079 | Cell culture medium |
| HEPES | Sigma Aldrich | Cat: H4034 | Cell culture medium supplement |
| IC Fixation Buffer | Invitrogen | Cat: 00-8222-49 | Cell fixation for Flow Citometry |
| Inverted microscope | Nikon | Model: ECLIPSE TS100 | Microscope |
| Isoflurane | Cristália | Cat: 21.2665 | Inhaled anesthetic |
| Methanol | Synth | Cat: 01A1085.01.BJ | Fixation for Immunofluorescence |
| Micro spatula | ABC stainless | Unavaiable | Surgical material |
| Microtube 1.5 mL | Axygen | Cat: MCT-150-C | Plastic material |
| Monoclonal antibody (mAb) 2C2 anti-Ssp-4 | Non commercial | Non commercial | Immunofluorescence antidoby |
| Multichannel Pipette (p200) | Corning | Cat: 751630124 | Pipette reagents |
| NIS Elements Software | Nikon | Version 4.0 | Acquire and analyse images |
| Non-fat milk | Nestlé | Cat: 9442405 | Blocking solution for immunofluorescence |
| Orbital Shaker Incubator | ThermoScientific | Model: 481 Cat: 11 | Dissociate microglia from astrocytes |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma Aldrich | Cat: P6148 | Fixation for Immunofluorescence |
| PBS | Non commercial | Non commercial | Neutral Buffer |
| Penicillin G | Sigma Aldrich | Cat: P-7794 | Cell culture medium supplement |
| Permeabilization Buffer (10X) | Invitrogen | Cat: 00-8333-56 | Cell permeabilization for Flow Citometry |
| Petri dish 60×15 mm (Disposable, sterile) | Prolab | Cat: 0303-8 | Plastic material |
| pH meter | Kasvi | K39-1014B | Calibrate pH solution |
| RPMI 1640 Medium | Gibco | Cat: 31800-014 | Cell culture medium |
| Scissors | ABC stainless | Cat: LO9-W4 | Surgical material |
| Serological pipette 10 mL | Corning | Cat: 4101 | Plastic material |
| Serological pipette 5 mL | Corning | Cat: 4051 | Plastic material |
| Single Channel Pipette (p1000) | Gilson Pipetman | Cat: F123602 | Pipette reagents |
| Single Channel Pipette (p200) | Gilson Pipetman | Cat: F123601 | Pipette reagents |
| Sodium bicarbonate | Sigma Aldrich | Cat: S6297 | Cell culture medium supplement |
| Streptomycin sulfate salt | Sigma Aldrich | Cat: S9137 | Cell culture medium supplement |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | Cat: T9284 | Permeabilization for immunofluorescence |
| Trypsin | Gibco | Cat: 27250-018 | Digestive enzyme |
| Tweezers | ABC stainless | Cat: L28-P4-172 | Surgical material |
| Water Bath | Novatecnica | Model: 09020095 | Digeste tissue at 37 ºC with trypsin |
References
- Azevedo, F. A. C., et al. Equal numbers of neuronal and nonneuronal cells make the human brain an isometrically scaled-up primate brain. Journal of Comparative Neurology. 513 (5), 532-541 (2009).
- Herculano-Houzel, S. The glia/neuron ratio: How it varies uniformly across brain structures and species and what that means for brain physiology and evolution. Glia. 62 (9), 1377-1391 (2014).
- Jäkel, S., Dimou, L. Glial Cells and Their Function in the Adult Brain: A Journey through the History of Their Ablation. Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 1-17 (2017).
- Streit, W. J. Microglia as neuroprotective, immunocompetent cells of the CNS. Glia. 40 (2), 133-139 (2002).
- Sofroniew, M. V. Molecular dissection of reactive astrogliosis and glial scar formation. Trends in Neuroscience. 32 (12), 638-647 (2009).
- Virchow, R. Die Cellularpathologie in ihrer Begründung auf physiologische and pathologische Gewebelehre. Verlag von August Hirschfeld, Berlin. , (1858).
- Nimmerjahn, A., Kirchhoff, F., Helmchen, F. Resting Microglial Cells Are Highly Dynamic Surveillants of Brain Parenchyma in vivo. Science. 308 (5726), 1314-1318 (2005).
- Samartino, C. G., et al. Brucella abortus induces the secretion of proinflammatory mediators from glial cells leading to astrocyte apoptosis. American Journal of Pathology. 176 (3), 1323-1338 (2010).
- Jamilloux, Y., et al. Inflammasome activation restricts Legionella pneumophila replication in primary microglial cells through flagellin detection. Glia. 61 (4), 539-549 (2013).
- Freeman, L., et al. NLR members NLRC4 and NLRP3 mediate sterile inflammasome activation in microglia and astrocytes. Journal of Experimental Medicine. 214 (5), 1351-1370 (2017).
- Pacheco, A. L., et al. The impairment in the NLRP3-induced NO secretion renders astrocytes highly permissive to T. cruzi replication. Journal of Leukocyte Biology. 160 (1), 201-207 (2019).
- Stansley, B., Post, J., Hensley, K. A comparative review of cell culture systems for the study of microglial biology in Alzheimer’s disease. Journal of Neuroinflammation. 9 (1), 115 (2012).
- Lian, H., Roy, E., Zheng, H. Protocol for Primary Microglial Culture Preparation. Bio-Protocol. 6 (21), 1-10 (2016).
- Lüder, C. G. K., Giraldo-Velásquez, M., Sendtner, M., Gross, U. Toxoplasma gondii in primary rat CNS cells: Differential contribution of neurons, astrocytes, and microglial cells for the intracerebral development and stage differentiation. Experimental Parasitology. 92 (1), 23-32 (1999).
- Chagas, C. Nova tripanozomiaze humana: estudos sobre a morfolojia e o ciclo evolutivo do Schizotrypanum cruzi n. gen., n. sp., ajente etiolojico de nova entidade morbida do homem. Memorias do Instituto Oswaldo Cruz. 1 (2), (1909).
- Berkowitz, A. L., Raibagkar, P., Pritt, B. S., Mateen, F. J. Neurologic manifestations of the neglected tropical diseases. Journal of Neurological Sciences. 349 (1), 20-32 (2015).
- Jones, J. L., et al. Toxoplasmic encephalitis in HIV-infected persons: risk factors and trends. The Adult/Adolescent Spectrum of Disease Group. AIDS. 10 (12), 1393-1399 (1996).
- Luft, B. J., et al. Toxoplasmic Encephalitis in Patients with the Acquired Immunodeficiency Syndrome. New England Journal of Medicine. 329 (14), 995-1000 (1993).
- Madalosso, G., et al. Chagasic meningoencephalitis: Case report of a recently included AIDS-defining illness in Brazil. Revista do Instituto de Medicina Tropical de Sao Paulo. 46 (4), 199-202 (2004).
- Rocha, A., et al. Pathology of patients with Chagas’ disease and acquired immunodeficiency syndrome. American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 50 (3), 261-268 (1994).
- Yasukawa, K., et al. Case report: Trypanosoma cruzi meningoencephalitis in a patient with acquired immunodeficiency syndrome. American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 91 (1), 84-85 (2014).
- Bennett, M. L., et al. New tools for studying microglia in the mouse and human CNS. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), 1738-1746 (2016).
- Roederer, M. Compensation in Flow Cytometry. Current Protocols in Cytometry. 22 (1), (2002).
- Silva, A. A., et al. Priming astrocytes with TNF enhances their susceptibility to Trypanosoma cruzi infection and creates a self-sustaining inflammatory milieu. Journal of Neuroinflammation. 14 (182), (2017).
- Tsacopoulos, M., Evêquoz-Mercier, V., Perrottet, P., Buchner, E. Honeybee retinal glial cells transform glucose and supply the neurons with metabolic substrate. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 85 (22), 8727-8731 (1988).
- Nagase, M., Takahashi, Y., Watabe, A. M., Kubo, Y., Kato, F. On-site energy supply at synapses through monocarboxylate transporters maintains excitatory synaptic transmission. Journal of Neuroscience. 34 (7), 2605-2617 (2014).
- Buckman, L. B., Thompson, M. M., Moreno, H. N., Ellacott, K. L. J. Regional astrogliosis in the mouse hypothalamus in response to obesity. Journal of Comparative Neurology. 521 (6), 1322-1333 (2013).
- Vesce, S., Bezzi, P., Volterra, A. The active role of astrocytes in synaptic transmission. Cellular and Molecular Life Sciences. 56 (11-12), 991-1000 (1999).
- Arcuri, C., Mecca, C., Bianchi, R., Giambanco, I., Donato, R. The Pathophysiological Role of Microglia in Dynamic Surveillance, Phagocytosis and Structural Remodeling of the Developing CNS. Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 191 (2017).
- Floden, A. M., Combs, C. K. Microglia repetitively isolated from in vitro mixed glial cultures retain their initial phenotype. Journal of Neuroscience Methods. 164 (2), 218-224 (2007).
- Schildge, S., Bohrer, C., Beck, K., Schachtrup, C. Isolation and culture of mouse cortical astrocytes. Journal of Visualized Experiments. (71), e50079 (2013).
- Sarkar, S., et al. Rapid and refined CD11b magnetic isolation of primary microglia with enhanced purity and versatility. Journal of Visualized Experiments. (122), e55364 (2017).
- Tamashiro, T. T., Dalgard, C. L., Byrnes, K. R. Primary microglia isolation from mixed glial cell cultures of neonatal rat brain tissue. Journal of Visualized Experiments. (66), e3814 (2012).
