原虫性原虫感染に対する原発星およびミクログリアの同時分離
Summary
このプロトコルの全体的な目標は、マウスアストロサイトおよびミクログリア細胞を中枢神経系から抽出、維持、解離し、続いて原虫寄生虫に感染する方法を指示することである。
Abstract
アストロサイトとミクログリアは、最も豊富なグリア細胞です。彼らは中枢神経系(CNS)における生理学的支援およびホメオスタシスの維持を担当する。感染症の制御に関与した証拠の増加は、CNSに影響を与える感染症に対する彼らの反応を評価するために、原発性アストロサイトおよびミクログリアを分離する方法論の改善に対する新たな関心を正当化する。CNSにおけるトリパノソーマ・クルジ(T.クルジ)およびトキソプラズマ・ゴンディ(T.ゴンディ)感染の影響を考慮して、ここではマウスアストロサイトおよびミクログリア細胞を原虫寄生虫で抽出、維持、解別、感染させる方法を提供する。新生児皮質から抽出された細胞は、周期的な差動培地交換で14日間インビトロで維持される。アストロサイトとミクログリアは、機械的解離により同じ抽出プロトコルから得られる。フローサイトメトリーによるフェノタイピングの後、細胞は原虫寄生虫に感染する。感染率は異なる時点での蛍光顕微鏡によって決定され、したがって、原虫の浸潤および複製を制御するグリア細胞の差動能力の評価を可能にする。これらの技術は、感染症に対するアストロサイトおよびミクログリアの応答を研究するための簡単で安価で効率的な方法を表し、さらなる神経免疫学分析のための分野を開く。
Introduction
CNSは主にニューロンとグリア細胞11、2、32で3構成されています。ミクログリアおよびアストロサイトは、CNSにおいて最も豊富なグリア細胞である。ミクログリアは、マクロファージの居住者であり、CNS3,4における免疫担当および貪食性グリア細胞3であり、4一方、アストロサイトは恒常性を維持し、支持機能を発揮する役割を担う。
,グリア細胞は、ニューロン6,77の支持と保護を担う古典的な役割を6担っていると公知であるにもかかわらず、これらの細胞の新たな機能は、感染88、9、10、119,10に対するそれらの応答を含む最近の文献に記載されている。11したがって、これらのグリア細胞を分離してそれらの機能を個別に理解する方法を開発するプッシュがあります。
不死化細胞系や生体内モデルなど、一次培養ではなくグリア細胞を研究するための代替モデルがいくつかあります。しかし、不死化細胞は遺伝的漂流および形態学的変化を受ける可能性が高く、生体内研究では限られた操作条件を課す。逆に、一次培養は扱いやすく、生体細胞に似ており、実験因子12,13,13を制御することもできます。ここでは、同じプロトコルでマウスアストロサイトおよびミクログリア一次細胞を抽出、維持、解別する方法に関するガイドラインを説明する。また、これらの培養物における原虫感染の働き方についても紹介しています。
新生児マウスから抽出したCNS細胞(3日齢まで)を、アストロサイトおよびミクログリア細胞の優等成長を可能にする微分培地上で14日間培養した。ミクログリアは付着した星状細胞の上に残るため、細胞集団は軌道インキュベーターで機械的に解光された。次に、ミクログリアを含む上澄みをすべて採取し、トリプシンを添加してアストロサイトを取り外した。単離グリア細胞をフローサイトメトリーにより平年的に評価し、所望の実験に従ってめっきした。
我々はまた、原生動物寄生虫にこれらの孤立したミクログリアおよびアストロサイトに感染する方法の例を提供した。T. gondiiはトキソプラズマ症14を担う非常に神経性のプロトゾアンであり、T. cruzi は CNS15, 16,16における神経疾患の発症につながる可能性があるシャーガス病の原因です。さらに、T. gondii17,18またはT. cruzi19,20,,21による感染が免疫不全患者の推定死因であったことも報告されています。したがって、原生動物感染を制御する上でのCNSからのグリア細胞の免疫学的役割の解明は非常に重要である。
Protocol
マウスを含むすべての実験的手順は、ブラジルの国家法(11.794/2008)に従って行われ、サンパウロ連邦大学(UNIFESP)の機関動物のケアと使用委員会(IACUC)によって承認されました。 1. グリア細胞の抽出、維持、解離 注: グリア細胞抽出に使用されるマウスの数は、目的の実験を行うために必要な細胞の量によって異なります。このプロトコルでは、合計2….
Representative Results
14日目に、グリア細胞培養(図1A)が機械的解離を行った。CD11b、CD45およびGFAPマーカーに従って、細胞集団をフローサイトメトリーで分析した。アストロサイトの人口は89.5%、ミクログリア集団では96.6%の純度を観察できた(図1B)。単離後、細胞は96ウェルの平板にメッキされ、24時間後にそれぞれの感染プロトコルに従…
Discussion
この20年間で、別個の生物学的文脈における単離グリア細胞機能の研究の重要性が拡大しています。ニューロンを超えてCNSを理解することは、細胞生物学において、特に感染症や炎症性の状態88、9、249,24の下でまだ成長している分野です。グリア細胞は、ニューロンの物理的サポート(以前に知られていたように)だけでな?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
サンパウロ連邦大学(UNIFESP)のレナート・A・モルタ教授にmAb 2C2反Ssp-4をありがとうございました。この作品は、フンダサン・デ・アンパロ・ア・ペスキサ・ド・エスタド・デ・サンパウロ(FAPESP、K.R.B.への助成金2017/25942-0)、コンセルホ・ナシオナル・デ・デセンボルヴィメント・シエンティフィコ・エ・テクノロジコ(CNPq、 402100/2016-6をK.R.B.に付与し、インスティトゥート・ナシオナル・デ・シエンシア・エ・テクノロジア・デ・ヴァシナス(INCTV/CNPq)、クールデナサン・デ・アペルフェイソアメント・デ・ペソアル・デ・ニーヴェル・スペリオール(CAPES、金融コード001)を付与します。M.P.A.はCNPqからフェローシップを受け、A.L.O.P.はCAPESからフェローシップを受け、I.S.FとL.Z.M.F.B.はFAPESPからフェローシップを受けます。
Materials
| 70% Ethanol | Dinâmica Química Contemporânea | Cat: 2231 | Sterilize |
| 75 cm2 Flask | Corning | Cat: 430720U | Plastic material |
| 96 well cell culture plate | Greiner Cellstar | Cat: 655090 | Cell culture |
| Ammonium Chloride (NH4Cl) | Dinâmica Química Contemporânea | Cat: C10337.01.AH | Remove autofluorescence |
| Anti-GFAP antibody | Abcam | Cat.: ab49874 | Immunofluorescence antidoby |
| Bottle Top Filter 0.22 mm CA | Corning | Cat: 430513 | Culture medium filter |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma Aldrich | Cat: A7906 | FACS Buffer preparation |
| CD11b (FITC) | BD Pharmigen | Cat.: 553310 | Flow cytometry antibody |
| CD45 (PE) | Invitrogen | Cat.: 12-0451-83 | Flow cytometry antibody |
| Centrifuge | Eppendorf | Cat: 5810R | Centrifugation |
| Centrifuge | Eppendorf | 5415R | Centrifugation |
| Class II biosafety cabinet | Pachane | Cat: 200 | Biosafety cabinet for sterile procedures |
| CO2 Incubator | ThermoScientific | Model: 3110 | Primary cells maintenance |
| Conical tubes 15 mL | Corning | Cat: 430766 | Plastic material |
| Conical tubes 50 mL | Corning | Cat: 352070 | Plastic material |
| Countess automated cell counter | Invitrogen | Cat: C10281 | Cell counter |
| DAPI | Invitrogen | Cat.: D1306 | Immunofluorescence antidoby |
| Digital Microscope Camera | Nikon | Cat: DS-RI1 | Capture images on microscope |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | Cat: 12800-058 | Cell culture medium |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma Aldrich | Cat: E9884 | FACS Buffer preparation |
| F12 Nutrient Mixture | Gibco | Cat: 21700-026 | Cell culture medium |
| FACS Canto II | BD Biosciences | Unavaiable | Flow cytometer |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | LGC Biotechnology | Cat: 10-bio500-1 | Cell culture medium supplement |
| Flow Jo (software) | Flow Jo | Version: Flow Jo_9.9.4 | Data analysis |
| Fluorescence intenselight | Nikon | Cat: C-HGFI | Fluorescence source |
| GFAP (APC) | Invitrogen | Cat.: 50-9892-82 | Flow cytometry antibody |
| Goat – anti-mouse IgG (FITC) | Kirkeegood&Perry Lab (KPL) | Cat.: 172-1806 | Immunofluorescence antidoby |
| HBSS – Hank's Balanced Salt Solution | Gibco | Cat: 14175079 | Cell culture medium |
| HEPES | Sigma Aldrich | Cat: H4034 | Cell culture medium supplement |
| IC Fixation Buffer | Invitrogen | Cat: 00-8222-49 | Cell fixation for Flow Citometry |
| Inverted microscope | Nikon | Model: ECLIPSE TS100 | Microscope |
| Isoflurane | Cristália | Cat: 21.2665 | Inhaled anesthetic |
| Methanol | Synth | Cat: 01A1085.01.BJ | Fixation for Immunofluorescence |
| Micro spatula | ABC stainless | Unavaiable | Surgical material |
| Microtube 1.5 mL | Axygen | Cat: MCT-150-C | Plastic material |
| Monoclonal antibody (mAb) 2C2 anti-Ssp-4 | Non commercial | Non commercial | Immunofluorescence antidoby |
| Multichannel Pipette (p200) | Corning | Cat: 751630124 | Pipette reagents |
| NIS Elements Software | Nikon | Version 4.0 | Acquire and analyse images |
| Non-fat milk | Nestlé | Cat: 9442405 | Blocking solution for immunofluorescence |
| Orbital Shaker Incubator | ThermoScientific | Model: 481 Cat: 11 | Dissociate microglia from astrocytes |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma Aldrich | Cat: P6148 | Fixation for Immunofluorescence |
| PBS | Non commercial | Non commercial | Neutral Buffer |
| Penicillin G | Sigma Aldrich | Cat: P-7794 | Cell culture medium supplement |
| Permeabilization Buffer (10X) | Invitrogen | Cat: 00-8333-56 | Cell permeabilization for Flow Citometry |
| Petri dish 60×15 mm (Disposable, sterile) | Prolab | Cat: 0303-8 | Plastic material |
| pH meter | Kasvi | K39-1014B | Calibrate pH solution |
| RPMI 1640 Medium | Gibco | Cat: 31800-014 | Cell culture medium |
| Scissors | ABC stainless | Cat: LO9-W4 | Surgical material |
| Serological pipette 10 mL | Corning | Cat: 4101 | Plastic material |
| Serological pipette 5 mL | Corning | Cat: 4051 | Plastic material |
| Single Channel Pipette (p1000) | Gilson Pipetman | Cat: F123602 | Pipette reagents |
| Single Channel Pipette (p200) | Gilson Pipetman | Cat: F123601 | Pipette reagents |
| Sodium bicarbonate | Sigma Aldrich | Cat: S6297 | Cell culture medium supplement |
| Streptomycin sulfate salt | Sigma Aldrich | Cat: S9137 | Cell culture medium supplement |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | Cat: T9284 | Permeabilization for immunofluorescence |
| Trypsin | Gibco | Cat: 27250-018 | Digestive enzyme |
| Tweezers | ABC stainless | Cat: L28-P4-172 | Surgical material |
| Water Bath | Novatecnica | Model: 09020095 | Digeste tissue at 37 ºC with trypsin |
References
- Azevedo, F. A. C., et al. Equal numbers of neuronal and nonneuronal cells make the human brain an isometrically scaled-up primate brain. Journal of Comparative Neurology. 513 (5), 532-541 (2009).
- Herculano-Houzel, S. The glia/neuron ratio: How it varies uniformly across brain structures and species and what that means for brain physiology and evolution. Glia. 62 (9), 1377-1391 (2014).
- Jäkel, S., Dimou, L. Glial Cells and Their Function in the Adult Brain: A Journey through the History of Their Ablation. Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 1-17 (2017).
- Streit, W. J. Microglia as neuroprotective, immunocompetent cells of the CNS. Glia. 40 (2), 133-139 (2002).
- Sofroniew, M. V. Molecular dissection of reactive astrogliosis and glial scar formation. Trends in Neuroscience. 32 (12), 638-647 (2009).
- Virchow, R. Die Cellularpathologie in ihrer Begründung auf physiologische and pathologische Gewebelehre. Verlag von August Hirschfeld, Berlin. , (1858).
- Nimmerjahn, A., Kirchhoff, F., Helmchen, F. Resting Microglial Cells Are Highly Dynamic Surveillants of Brain Parenchyma in vivo. Science. 308 (5726), 1314-1318 (2005).
- Samartino, C. G., et al. Brucella abortus induces the secretion of proinflammatory mediators from glial cells leading to astrocyte apoptosis. American Journal of Pathology. 176 (3), 1323-1338 (2010).
- Jamilloux, Y., et al. Inflammasome activation restricts Legionella pneumophila replication in primary microglial cells through flagellin detection. Glia. 61 (4), 539-549 (2013).
- Freeman, L., et al. NLR members NLRC4 and NLRP3 mediate sterile inflammasome activation in microglia and astrocytes. Journal of Experimental Medicine. 214 (5), 1351-1370 (2017).
- Pacheco, A. L., et al. The impairment in the NLRP3-induced NO secretion renders astrocytes highly permissive to T. cruzi replication. Journal of Leukocyte Biology. 160 (1), 201-207 (2019).
- Stansley, B., Post, J., Hensley, K. A comparative review of cell culture systems for the study of microglial biology in Alzheimer’s disease. Journal of Neuroinflammation. 9 (1), 115 (2012).
- Lian, H., Roy, E., Zheng, H. Protocol for Primary Microglial Culture Preparation. Bio-Protocol. 6 (21), 1-10 (2016).
- Lüder, C. G. K., Giraldo-Velásquez, M., Sendtner, M., Gross, U. Toxoplasma gondii in primary rat CNS cells: Differential contribution of neurons, astrocytes, and microglial cells for the intracerebral development and stage differentiation. Experimental Parasitology. 92 (1), 23-32 (1999).
- Chagas, C. Nova tripanozomiaze humana: estudos sobre a morfolojia e o ciclo evolutivo do Schizotrypanum cruzi n. gen., n. sp., ajente etiolojico de nova entidade morbida do homem. Memorias do Instituto Oswaldo Cruz. 1 (2), (1909).
- Berkowitz, A. L., Raibagkar, P., Pritt, B. S., Mateen, F. J. Neurologic manifestations of the neglected tropical diseases. Journal of Neurological Sciences. 349 (1), 20-32 (2015).
- Jones, J. L., et al. Toxoplasmic encephalitis in HIV-infected persons: risk factors and trends. The Adult/Adolescent Spectrum of Disease Group. AIDS. 10 (12), 1393-1399 (1996).
- Luft, B. J., et al. Toxoplasmic Encephalitis in Patients with the Acquired Immunodeficiency Syndrome. New England Journal of Medicine. 329 (14), 995-1000 (1993).
- Madalosso, G., et al. Chagasic meningoencephalitis: Case report of a recently included AIDS-defining illness in Brazil. Revista do Instituto de Medicina Tropical de Sao Paulo. 46 (4), 199-202 (2004).
- Rocha, A., et al. Pathology of patients with Chagas’ disease and acquired immunodeficiency syndrome. American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 50 (3), 261-268 (1994).
- Yasukawa, K., et al. Case report: Trypanosoma cruzi meningoencephalitis in a patient with acquired immunodeficiency syndrome. American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 91 (1), 84-85 (2014).
- Bennett, M. L., et al. New tools for studying microglia in the mouse and human CNS. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), 1738-1746 (2016).
- Roederer, M. Compensation in Flow Cytometry. Current Protocols in Cytometry. 22 (1), (2002).
- Silva, A. A., et al. Priming astrocytes with TNF enhances their susceptibility to Trypanosoma cruzi infection and creates a self-sustaining inflammatory milieu. Journal of Neuroinflammation. 14 (182), (2017).
- Tsacopoulos, M., Evêquoz-Mercier, V., Perrottet, P., Buchner, E. Honeybee retinal glial cells transform glucose and supply the neurons with metabolic substrate. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 85 (22), 8727-8731 (1988).
- Nagase, M., Takahashi, Y., Watabe, A. M., Kubo, Y., Kato, F. On-site energy supply at synapses through monocarboxylate transporters maintains excitatory synaptic transmission. Journal of Neuroscience. 34 (7), 2605-2617 (2014).
- Buckman, L. B., Thompson, M. M., Moreno, H. N., Ellacott, K. L. J. Regional astrogliosis in the mouse hypothalamus in response to obesity. Journal of Comparative Neurology. 521 (6), 1322-1333 (2013).
- Vesce, S., Bezzi, P., Volterra, A. The active role of astrocytes in synaptic transmission. Cellular and Molecular Life Sciences. 56 (11-12), 991-1000 (1999).
- Arcuri, C., Mecca, C., Bianchi, R., Giambanco, I., Donato, R. The Pathophysiological Role of Microglia in Dynamic Surveillance, Phagocytosis and Structural Remodeling of the Developing CNS. Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 191 (2017).
- Floden, A. M., Combs, C. K. Microglia repetitively isolated from in vitro mixed glial cultures retain their initial phenotype. Journal of Neuroscience Methods. 164 (2), 218-224 (2007).
- Schildge, S., Bohrer, C., Beck, K., Schachtrup, C. Isolation and culture of mouse cortical astrocytes. Journal of Visualized Experiments. (71), e50079 (2013).
- Sarkar, S., et al. Rapid and refined CD11b magnetic isolation of primary microglia with enhanced purity and versatility. Journal of Visualized Experiments. (122), e55364 (2017).
- Tamashiro, T. T., Dalgard, C. L., Byrnes, K. R. Primary microglia isolation from mixed glial cell cultures of neonatal rat brain tissue. Journal of Visualized Experiments. (66), e3814 (2012).
Cite This Article
Pacheco, A. d. O. L., Amaral, M. P., de Farias, I. S., Bottino, L. Z. M. F., Bortoluci, K. R. Concomitant Isolation of Primary Astrocytes and Microglia for Protozoa Parasite Infection. J. Vis. Exp. (157), e60680, doi:10.3791/60680 (2020).