العزلة المصاحبة للخلايا الفلكية الأولية وMicroglia لعدوى طفيلي بروتوزوا
Summary
الهدف العام من هذا البروتوكول هو توجيه كيفية استخراج وصيانة وفصل الخلايا المادرينية وخلايا الميكروجليا من الجهاز العصبي المركزي ، تليها العدوى بالطفيليات الأولية.
Abstract
الخلايا الفلكية وmicroglia هي الخلايا الدبقية الأكثر وفرة. وهي مسؤولة عن الدعم الفسيولوجي وصيانة التوازن في الجهاز العصبي المركزي (CNS). وتبرر الأدلة المتزايدة على مشاركتها في مكافحة الأمراض المعدية الاهتمام الناشئ بتحسين منهجيات عزل الخلايا الفلكية الأولية والميكروغليا من أجل تقييم استجاباتها للإصابات التي تؤثر على الجهاز العصبي المركزي. بالنظر إلى تأثير تريبانوصوما كروزي (T. cruzi) وToxoplasma gondii (T. gondii)العدوى في الجهاز العصبي المركزي ، نقدم هنا طريقة لاستخراج وصيانة وانفصام وإصابة الخلايا الفلكية المادرين وخلايا microglia مع الطفيليات البروتوزوا. يتم الاحتفاظ بالخلايا المستخرجة من القشريات حديثي الولادة في المختبر لمدة 14 يومًا مع استبدال الوسائط التفاضلية الدورية. يتم الحصول على الخلايا الفلكية وmicroglia من نفس بروتوكول الاستخراج عن طريق التفكك الميكانيكي. بعد الفينومينب عن طريق قياس خلايا التدفق ، تصاب الخلايا بطفيليات بروتوزوا. يتم تحديد معدل العدوى عن طريق المجهر الفلوري في نقاط زمنية مختلفة ، مما يتيح تقييم القدرة التفاضلية للخلايا الدبقية على السيطرة على غزو البروتوزوان والنسخ المتماثل. تمثل هذه التقنيات طرقًا بسيطة ورخيصة وفعالة لدراسة استجابات الخلايا الفلكية والميكروجليا للعدوى ، مما يفتح المجال لمزيد من تحليل المناعة العصبية.
Introduction
ويتكون الجهاز العصبي المركزي أساسا من الخلايا العصبية والخلايا الدبقية1,2,3. Microglia والخلايا الفلكية هي خلايا جليا الأكثر وفرة في الجهاز العصبي المركزي. Microglia، الضامة المقيم، هو المناعة والخلية غليا البلعوم في CNS3،,4،في حين أن الخلايا الفلكية هي المسؤولة عن الحفاظ على التوازن وممارسة وظائف داعمة5.
على الرغم من الخلايا الدبقية التي تعرف تقليديا لتكون مسؤولة عن دعم وحماية الخلايا العصبية6,7, وقد وصفت الوظائف الناشئة من هذه الخلايا في الأدب الأخير, بما في ذلك استجاباتهم للعدوى8,9,,10,11. وبالتالي ، هناك دفع لتطوير أساليب لعزل هذه الخلايا الدبقية لفهم وظائفها بشكل فردي.
هناك بعض النماذج البديلة لدراسة الخلايا الدبقية بدلا من الثقافات الأولية، مثل الأنساب الخلايا الخالدة وفي نماذج الحي. ومع ذلك ، فإن الخلايا الخالدة أكثر عرضة للخضوع للانجراف الوراثي والتغيرات المورفولوجية ، في حين أن الدراسات في الجسم الحي تفرض شروط تلاعب محدودة. على العكس من ذلك، الثقافات الأولية هي سهلة للتعامل معها، أفضل تشبه في خلايا الجسم الحي وتسمح لنا أيضا للسيطرة على العوامل التجريبية12،,13. هنا، ونحن نصف المبادئ التوجيهية حول كيفية استخراج والحفاظ على وفصلها الخلايا الفلكية المورين والخلايا الأولية microglia في نفس البروتوكول. وعلاوة على ذلك، نقدم أيضا أمثلة على كيفية العمل مع عدوى البروتوزوا في هذه الثقافات.
تم استزراع خلايا الجهاز العصبي المركزي المستخرجة من الفئران الوليدية (حتى 3 أيام) لمدة 14 يومًا على الوسائط التفاضلية التي تسمح بالنمو التفضيلي للخلايا الفلكية وخلايا الميكروجليا. وبما أن الميكروجليا ترتاح فوق الخلايا الفلكية المرفقة، فقد انفصلت مجموعات الخلايا ميكانيكيا ً في حاضنة مدارية. بعد ذلك ، جمعنا كل supernatant التي تحتوي على microglia وأضاف التربسين لفصل الخلايا الفلكية. تم تقييم الخلايا الدبقية المعزولة بشكل ظاهري عن طريق قياس خلايا التدفق ومطلية وفقًا للتجربة المطلوبة.
كما قدمنا أمثلة حول كيفية إصابة هذه الميكروجليا المعزولة والخلايا الفلكية بالطفيليات الأولية. T. gondii هو protozoan العصبية للغاية المسؤولة عن toxoplasmosis14, في حين T. كروزالأول هو المسؤول عن مرض شاغاس الذي يمكن أن يؤدي إلى تطوير الاضطرابات العصبية في الجهاز العصبي المركزي15,16. وعلاوة على ذلك, وقد أفيد أيضا أن العدوى مع T. gondii17,18 أو T. cruzi19,20,21 كانت السبب المفترض للوفاة في المرضى الذين يعانون من نقص المناعة. لذلك ، فإن توضيح الدور المناعي للخلايا الدبقية من الجهاز العصبي المركزي في السيطرة على التهابات البروتوزوا له أهمية كبيرة.
Protocol
Representative Results
Discussion
وقد اتسعت أهمية دراسة وظائف الخلايا الدبقية المعزولة في سياقات بيولوجية متميزة في العقدين الماضيين. فهم الجهاز العصبي المركزي وراء الخلايا العصبية لا يزال حقل متزايد في بيولوجيا الخلايا, خاصة في ظل العدوى أو الظروف الالتهابية8,9,24. الخلا?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نود أن نشكر البروفيسور الدكتور ريناتو أ. هارومنتا من جامعة ساو باولو الاتحادية على برنامج MAb 2C2 المناهض لـ Ssp-4. وقد دعم هذا العمل بمنح مقدمة من مؤسسة امباساو دي أمبارو إي بيسكيسا دو استادو دي ساو باولو (FAPESP, منحة 2017/25942-0 إلى K.R.B.), Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq, منحة 402100/2016-6 إلى K.R.B.)، المعهد الوطني للعلوم والتكنولوجيا والعلوم (INCTV/CNPq) وCoordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES, Finance Code 001). تتلقى M.P.A. زمالة من CNPq، ويتلقى A.L.O.P. زمالة من CAPES، ويتلقى I.S.F.F.B. زمالة من FAPESP.
Materials
| 70% Ethanol | Dinâmica Química Contemporânea | Cat: 2231 | Sterilize |
| 75 cm2 Flask | Corning | Cat: 430720U | Plastic material |
| 96 well cell culture plate | Greiner Cellstar | Cat: 655090 | Cell culture |
| Ammonium Chloride (NH4Cl) | Dinâmica Química Contemporânea | Cat: C10337.01.AH | Remove autofluorescence |
| Anti-GFAP antibody | Abcam | Cat.: ab49874 | Immunofluorescence antidoby |
| Bottle Top Filter 0.22 mm CA | Corning | Cat: 430513 | Culture medium filter |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma Aldrich | Cat: A7906 | FACS Buffer preparation |
| CD11b (FITC) | BD Pharmigen | Cat.: 553310 | Flow cytometry antibody |
| CD45 (PE) | Invitrogen | Cat.: 12-0451-83 | Flow cytometry antibody |
| Centrifuge | Eppendorf | Cat: 5810R | Centrifugation |
| Centrifuge | Eppendorf | 5415R | Centrifugation |
| Class II biosafety cabinet | Pachane | Cat: 200 | Biosafety cabinet for sterile procedures |
| CO2 Incubator | ThermoScientific | Model: 3110 | Primary cells maintenance |
| Conical tubes 15 mL | Corning | Cat: 430766 | Plastic material |
| Conical tubes 50 mL | Corning | Cat: 352070 | Plastic material |
| Countess automated cell counter | Invitrogen | Cat: C10281 | Cell counter |
| DAPI | Invitrogen | Cat.: D1306 | Immunofluorescence antidoby |
| Digital Microscope Camera | Nikon | Cat: DS-RI1 | Capture images on microscope |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | Cat: 12800-058 | Cell culture medium |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma Aldrich | Cat: E9884 | FACS Buffer preparation |
| F12 Nutrient Mixture | Gibco | Cat: 21700-026 | Cell culture medium |
| FACS Canto II | BD Biosciences | Unavaiable | Flow cytometer |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | LGC Biotechnology | Cat: 10-bio500-1 | Cell culture medium supplement |
| Flow Jo (software) | Flow Jo | Version: Flow Jo_9.9.4 | Data analysis |
| Fluorescence intenselight | Nikon | Cat: C-HGFI | Fluorescence source |
| GFAP (APC) | Invitrogen | Cat.: 50-9892-82 | Flow cytometry antibody |
| Goat – anti-mouse IgG (FITC) | Kirkeegood&Perry Lab (KPL) | Cat.: 172-1806 | Immunofluorescence antidoby |
| HBSS – Hank's Balanced Salt Solution | Gibco | Cat: 14175079 | Cell culture medium |
| HEPES | Sigma Aldrich | Cat: H4034 | Cell culture medium supplement |
| IC Fixation Buffer | Invitrogen | Cat: 00-8222-49 | Cell fixation for Flow Citometry |
| Inverted microscope | Nikon | Model: ECLIPSE TS100 | Microscope |
| Isoflurane | Cristália | Cat: 21.2665 | Inhaled anesthetic |
| Methanol | Synth | Cat: 01A1085.01.BJ | Fixation for Immunofluorescence |
| Micro spatula | ABC stainless | Unavaiable | Surgical material |
| Microtube 1.5 mL | Axygen | Cat: MCT-150-C | Plastic material |
| Monoclonal antibody (mAb) 2C2 anti-Ssp-4 | Non commercial | Non commercial | Immunofluorescence antidoby |
| Multichannel Pipette (p200) | Corning | Cat: 751630124 | Pipette reagents |
| NIS Elements Software | Nikon | Version 4.0 | Acquire and analyse images |
| Non-fat milk | Nestlé | Cat: 9442405 | Blocking solution for immunofluorescence |
| Orbital Shaker Incubator | ThermoScientific | Model: 481 Cat: 11 | Dissociate microglia from astrocytes |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma Aldrich | Cat: P6148 | Fixation for Immunofluorescence |
| PBS | Non commercial | Non commercial | Neutral Buffer |
| Penicillin G | Sigma Aldrich | Cat: P-7794 | Cell culture medium supplement |
| Permeabilization Buffer (10X) | Invitrogen | Cat: 00-8333-56 | Cell permeabilization for Flow Citometry |
| Petri dish 60×15 mm (Disposable, sterile) | Prolab | Cat: 0303-8 | Plastic material |
| pH meter | Kasvi | K39-1014B | Calibrate pH solution |
| RPMI 1640 Medium | Gibco | Cat: 31800-014 | Cell culture medium |
| Scissors | ABC stainless | Cat: LO9-W4 | Surgical material |
| Serological pipette 10 mL | Corning | Cat: 4101 | Plastic material |
| Serological pipette 5 mL | Corning | Cat: 4051 | Plastic material |
| Single Channel Pipette (p1000) | Gilson Pipetman | Cat: F123602 | Pipette reagents |
| Single Channel Pipette (p200) | Gilson Pipetman | Cat: F123601 | Pipette reagents |
| Sodium bicarbonate | Sigma Aldrich | Cat: S6297 | Cell culture medium supplement |
| Streptomycin sulfate salt | Sigma Aldrich | Cat: S9137 | Cell culture medium supplement |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | Cat: T9284 | Permeabilization for immunofluorescence |
| Trypsin | Gibco | Cat: 27250-018 | Digestive enzyme |
| Tweezers | ABC stainless | Cat: L28-P4-172 | Surgical material |
| Water Bath | Novatecnica | Model: 09020095 | Digeste tissue at 37 ºC with trypsin |
References
- Azevedo, F. A. C., et al. Equal numbers of neuronal and nonneuronal cells make the human brain an isometrically scaled-up primate brain. Journal of Comparative Neurology. 513 (5), 532-541 (2009).
- Herculano-Houzel, S. The glia/neuron ratio: How it varies uniformly across brain structures and species and what that means for brain physiology and evolution. Glia. 62 (9), 1377-1391 (2014).
- Jäkel, S., Dimou, L. Glial Cells and Their Function in the Adult Brain: A Journey through the History of Their Ablation. Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 1-17 (2017).
- Streit, W. J. Microglia as neuroprotective, immunocompetent cells of the CNS. Glia. 40 (2), 133-139 (2002).
- Sofroniew, M. V. Molecular dissection of reactive astrogliosis and glial scar formation. Trends in Neuroscience. 32 (12), 638-647 (2009).
- Virchow, R. Die Cellularpathologie in ihrer Begründung auf physiologische and pathologische Gewebelehre. Verlag von August Hirschfeld, Berlin. , (1858).
- Nimmerjahn, A., Kirchhoff, F., Helmchen, F. Resting Microglial Cells Are Highly Dynamic Surveillants of Brain Parenchyma in vivo. Science. 308 (5726), 1314-1318 (2005).
- Samartino, C. G., et al. Brucella abortus induces the secretion of proinflammatory mediators from glial cells leading to astrocyte apoptosis. American Journal of Pathology. 176 (3), 1323-1338 (2010).
- Jamilloux, Y., et al. Inflammasome activation restricts Legionella pneumophila replication in primary microglial cells through flagellin detection. Glia. 61 (4), 539-549 (2013).
- Freeman, L., et al. NLR members NLRC4 and NLRP3 mediate sterile inflammasome activation in microglia and astrocytes. Journal of Experimental Medicine. 214 (5), 1351-1370 (2017).
- Pacheco, A. L., et al. The impairment in the NLRP3-induced NO secretion renders astrocytes highly permissive to T. cruzi replication. Journal of Leukocyte Biology. 160 (1), 201-207 (2019).
- Stansley, B., Post, J., Hensley, K. A comparative review of cell culture systems for the study of microglial biology in Alzheimer’s disease. Journal of Neuroinflammation. 9 (1), 115 (2012).
- Lian, H., Roy, E., Zheng, H. Protocol for Primary Microglial Culture Preparation. Bio-Protocol. 6 (21), 1-10 (2016).
- Lüder, C. G. K., Giraldo-Velásquez, M., Sendtner, M., Gross, U. Toxoplasma gondii in primary rat CNS cells: Differential contribution of neurons, astrocytes, and microglial cells for the intracerebral development and stage differentiation. Experimental Parasitology. 92 (1), 23-32 (1999).
- Chagas, C. Nova tripanozomiaze humana: estudos sobre a morfolojia e o ciclo evolutivo do Schizotrypanum cruzi n. gen., n. sp., ajente etiolojico de nova entidade morbida do homem. Memorias do Instituto Oswaldo Cruz. 1 (2), (1909).
- Berkowitz, A. L., Raibagkar, P., Pritt, B. S., Mateen, F. J. Neurologic manifestations of the neglected tropical diseases. Journal of Neurological Sciences. 349 (1), 20-32 (2015).
- Jones, J. L., et al. Toxoplasmic encephalitis in HIV-infected persons: risk factors and trends. The Adult/Adolescent Spectrum of Disease Group. AIDS. 10 (12), 1393-1399 (1996).
- Luft, B. J., et al. Toxoplasmic Encephalitis in Patients with the Acquired Immunodeficiency Syndrome. New England Journal of Medicine. 329 (14), 995-1000 (1993).
- Madalosso, G., et al. Chagasic meningoencephalitis: Case report of a recently included AIDS-defining illness in Brazil. Revista do Instituto de Medicina Tropical de Sao Paulo. 46 (4), 199-202 (2004).
- Rocha, A., et al. Pathology of patients with Chagas’ disease and acquired immunodeficiency syndrome. American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 50 (3), 261-268 (1994).
- Yasukawa, K., et al. Case report: Trypanosoma cruzi meningoencephalitis in a patient with acquired immunodeficiency syndrome. American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 91 (1), 84-85 (2014).
- Bennett, M. L., et al. New tools for studying microglia in the mouse and human CNS. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), 1738-1746 (2016).
- Roederer, M. Compensation in Flow Cytometry. Current Protocols in Cytometry. 22 (1), (2002).
- Silva, A. A., et al. Priming astrocytes with TNF enhances their susceptibility to Trypanosoma cruzi infection and creates a self-sustaining inflammatory milieu. Journal of Neuroinflammation. 14 (182), (2017).
- Tsacopoulos, M., Evêquoz-Mercier, V., Perrottet, P., Buchner, E. Honeybee retinal glial cells transform glucose and supply the neurons with metabolic substrate. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 85 (22), 8727-8731 (1988).
- Nagase, M., Takahashi, Y., Watabe, A. M., Kubo, Y., Kato, F. On-site energy supply at synapses through monocarboxylate transporters maintains excitatory synaptic transmission. Journal of Neuroscience. 34 (7), 2605-2617 (2014).
- Buckman, L. B., Thompson, M. M., Moreno, H. N., Ellacott, K. L. J. Regional astrogliosis in the mouse hypothalamus in response to obesity. Journal of Comparative Neurology. 521 (6), 1322-1333 (2013).
- Vesce, S., Bezzi, P., Volterra, A. The active role of astrocytes in synaptic transmission. Cellular and Molecular Life Sciences. 56 (11-12), 991-1000 (1999).
- Arcuri, C., Mecca, C., Bianchi, R., Giambanco, I., Donato, R. The Pathophysiological Role of Microglia in Dynamic Surveillance, Phagocytosis and Structural Remodeling of the Developing CNS. Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 191 (2017).
- Floden, A. M., Combs, C. K. Microglia repetitively isolated from in vitro mixed glial cultures retain their initial phenotype. Journal of Neuroscience Methods. 164 (2), 218-224 (2007).
- Schildge, S., Bohrer, C., Beck, K., Schachtrup, C. Isolation and culture of mouse cortical astrocytes. Journal of Visualized Experiments. (71), e50079 (2013).
- Sarkar, S., et al. Rapid and refined CD11b magnetic isolation of primary microglia with enhanced purity and versatility. Journal of Visualized Experiments. (122), e55364 (2017).
- Tamashiro, T. T., Dalgard, C. L., Byrnes, K. R. Primary microglia isolation from mixed glial cell cultures of neonatal rat brain tissue. Journal of Visualized Experiments. (66), e3814 (2012).
