Antisense Oligonükleotidlerin Klinik Çalışmalarında DMD Hasta Örneklerinde Exon Atlama Etkinliğinin Karakterize Edilmesi
1Department of Molecular Therapy, National Institute of Neuroscience,National Center of Neurology and Psychiatry, 2Clinical Research Support Office, Translational Medical Center,National Center of Neurology and Psychiatry, 3Department of Child Neurology, National Center Hospital,National Center of Neurology and Psychiatry
Summary
Burada klinik çalışmada Sanger sıralama, RT-PCR ve batı lekeleme kullanarak distrofin 38 ekspresyonunun moleküler karakterizasyonunu satMaktadır.
Abstract
Duchenne musküler distrofi (DMD) kas kütlesinin ilerleyici kaybına neden olan dejeneratif bir kas hastalığıdır, erken ölüme yol açan. Mutasyonlar genellikle bozuk bir okuma çerçevesi ve erken durdurma kodonneden, distrofin protein neredeyse toplam eksikliği ile sonuçlanan. Okuma çerçevesi ekson atlama neden antisense oligonükleotidler (AONs) kullanılarak düzeltilebilir. Morpholno AON viltolarsen (kod adı: NS-065/NCNP-01) ekson 53 atlama neden gösterilmiştir, ekson 52 silme olan hastalar için okuma çerçevesi geri. Yakın zamanda NS-065/NCNP-01’i araştırmacı araştırmacı tarafından başlatılan, ilk insan-in-insan denemesinde DMD hastalarına intravenöz olarak uyguladık. Bu yöntem makalesinde klinik çalışmada Sanger sıralama, RT-PCR ve batı lekeleme kullanılarak distrofin ekspresyonunun moleküler karakterizasyonu sunmaktadır. İşlevsel sonuç testi yapılmadığından, distrofin ekspresyonunun karakterizasyonu çalışmada etkinliğin gösterilmesi açısından temel bir neden diyara yaydı.
Introduction
Duchenne musküler distrofi (DMD) kas kütlesi, solunum yetmezliği ve kardiyomiyopati ilerleyici kaybına neden olan bir dejeneratif kas hastalığıdır ve erken ölüme yol açar1. Hastalık büyük yapısal kas protein distrofin eksikliği neden olur2. X kromozomu üzerindeki DMD-genmutasyonları çekinik tir ve hastalık 3500-5000 yeni doğan erkeklerde 1 etkiler3,4,5. Mutasyonlar genellikle exons 44 ve 55 arasında bir hotspot bölgede büyük deletions bir bozuk okuma çerçevesi ve erken stop kodonları yol, saçma aracılı çürüme ve distrofin protein6neredeyse toplam eksikliği neden,7,8. Okuma çerçevesi, ekson atlama ve okuma çerçevesi geri neden antisense oligonükleotidler (AONs) kullanılarak düzeltilebilir, kısmen distrofin ekspresyonu geri ve hastalık ilerlemesini geciktiren9,10,11. Morpholino AON eteplirsen, son zamanlarda Federal İlaç Ajansı (FDA) tarafından onaylandı, ekson 51 atlama neden olur ve ekson 52 silme12olan hastalarda okuma çerçevesi geri yükleyebilirsiniz,13. Ancak, exon 53 atlama ekson 52 silme olan hastalar için okuma çerçevesi geri yüklenir, ve potansiyel dmd hastalarının yaklaşık% 10 tedavi edebilirsiniz14. Morpholno AON ilacı NS-065/NCNP-01’in insan hücrelerinde ekson 53 atlanmasına neden olduğu gösterilmiştir. ve yakın zamanda NS-065/NCNP-01’i DMD hastalarına faz 1 açık etiketli doz yükseltme klinik çalışması (bundan böyle “çalışma” olarak anılacaktır) uyguladık (UMIN: 000010964 ve ClinicalTrials.gov: NCT02081625)14. Çalışma, batı lekelenmedayalı RT-PCR ve distrofin protein düzeylerine dayalı ekson 53 atlama doza bağlı bir artış gösterdi, ve hiçbir ciddi advers ilaç olayları veya dropouts gözlendi14.
Tüm klinik çalışmalarda, sonuçların analizi son derece önemlidir. DMD klinik çalışmalar için, bir tartışma hala bir tedavi yararı göstermek için en iyi yöntem ile ilgili devam etmektedir. 6 dakikalık yürüme testi gibi klinik testlerin bazı sakıncaları vardır. Distrofin ekspresyonunun moleküler karakterizasyonu RT-PCR, qPCR, digital-PCR, western blotting ve immünohistokimya gibi çeşitli yöntemler kullanılarak yapılabilir. Ancak, klinik fayda sağlamak için gerekli olan protein ekspresyonu restorasyon ölçüde belirsizliğini koruyor. Bu yöntem makalesinde, aon atlama ilacı NS-065/NCNP-0114faz 1 denemede, sırasıyla, ekson atlama ve protein düzeylerini belirlemek için kullanılan RT-PCR ve batı lekeleme yöntemleri ayrıntılı olarak açıklanmıştır.
Protocol
Araştırmacı tarafından başlatılan davanın operasyonel prosedürü NCNP etik komitesi tarafından onaylanmıştır (onay kimliği: A2013-019). 1. Kas örneklerinin hazırlanması NOT: Biceps brachii veya kuadriseps kasları genellikle biyopsi siteleri olarak seçilir. Ancak klinik çalışmada tibialis anterior kullanıldı. Hastalardan kas biyopsisi Cilt hazırlamadan önce kesi bölgesini işaretleyin. Biyopsi numunesi için tuzlu sönümlü gazlı bez hazırlayın. Gazlı bezi iyice sıkın. Deri ve deri altı doku içine lokal anestezi enjekte, ama kas içine değil. Kutanöz ağrı yokluğunda anestezi derinliği emin olun.NOT: Genel anestezi genellikle 15 yaşın altındaki pediyatrik hastalarda kullanılır. Deriden deri altı dokuya bir kesi yapın. Kesi açmak ve deri altı yağ ayırmak için küçük retractors kullanın.NOT: Bu adımda fibroblast kültürü için cildin bir kısmı kesilebilir. Fasya başka bir küçük kesi yapmak ve daha fazla fasya kesti. Kas ortaya çıkarmak için sivrisinek forceps kullanarak kenarları kelepçe. KasSeçilen kısmını yukarı çekmek için bir dikiş kullanın. Iris makas kullanarak küçük bir tünel yapmak ve tüneliçine sivrisinek forceps yerleştirin. Forseps kullanarak kas demeti ayırın ve hedef kısmının her iki ucunu kesti.NOT: Kas biyopsisi örnekleri erişkin hastalar için kalem büyüklüğünde olmalıdır (uzunluk 1.0-1.5 cm, çap 0.8-1.0 cm). Pediyatrik hastalarda numune nin uzunluğu 1 cm ve çapı 5 mm olmalıdır. Numuneyi tuzlu sönümlü gazlı bezle sarın ve taze kası oda sıcaklığında (RT) hemen numunenin daha fazla analiz için hazırlanabileceği bir tesise taşıyın.NOT: Taşıma süresi 1 saati aşarsa numuneler 4 °C’de taşınmalıdır. 2. Kas numunesi hazırlama Sakız yumuşak ve yapışkan hale gelene kadar tragacanth sakız ve su eşit hacimlerde karıştırın. Karışımı 25 mL şırıngaya yükleyin. Şırıngalar buzdolabında saklanabilir. Mantar diskler üzerinde tragacanth sakız yaklaşık 0,5-1 cm yerleştirin. Diskleri karşı tarafa etiketle. Bazı sıvı dondurulana kadar sıvı azot içinde isopentane bir kap yerleştirin. Örneği tragacanth sakızına yerleştirin. Her kasın uzunlamasına ekseni mantara dik olmalıdır. Uygun yerleştirme yardımcı olmak için her kas ın alt etrafında sakız yerleştirin. Cımbız kullanarak, dondurucu ya da dondurmak için 2.3 adımda hazırlanan soğuk isopentane kas/mantar örneğini yerleştirin. Numuneyi 1 dk veya tamamen donana kadar sürekli olarak hareket ettirin ve geçici olarak kuru buzun üzerine yerleştirin. Numuneyi cam şişelere yerleştirin ve -80 °C’de saklayın. 3. Kas kesiti -25 °C çalışma sıcaklığıile kesit için kriyostat ayarlayın. Düz bölümler elde edilene kadar mantar / kas bloğu ve trim monte. RT-PCR ve batı lekeleme için 10 μm’lik bir kesit kalınlığı kullanın. İmmünohistokimya veya hematoksilin ve eozin boyama için sırasıyla 6-8 μm ve 10-12 m kalınlığında kullanın. Dilimlenmiş bölümleri 2,0 mL tüplere koyun ve RT-PCR ve batı lekeleme için -80 °C’de saklayın. 4. RNA ekstraksiyonu ve ters transkripsiyon polimeraz zincir reaksiyonu (RT-PCR) Dondurulmuş kastan 10 μm kalınlığında yaklaşık 10 dilim iğozat la ayıklayın. Üreticinin talimatlarına göre toplam RNA arıtma kiti kullanarak saflaştırılmış toplam RNA toplamak. RNA konsantrasyonu bir spektrofotometre kullanarak ölçün. PCRtüplerde RT-PCR reaksiyonu için gerekli reaktifleri Tablo 1’e göre birleştirin. Astar dizileri için Tablo 2’ye bakınız.NOT: İleri astar hasta NS-03 için 44F ve hasta NS-07 için 46F idi. Ters astar varsayılan olarak 54/55R idi. Spesifik olmayan ürünler belirginse, alternatif olarak 54R kullanılmıştır. Karışımı içeren PCR tüplerini bir termo-cycler’a yerleştirin. Termo-cycler’ı Tablo 3’egöre çalıştırın. PCR ürünlerini kısa süreli depolama için 4 °C’de veya uzun süreli depolama için -20 °C’de saklayın. 5. Mikroçip elektroforez ve ekson atlama hesaplaması NOT: Bir mikroçip elektroforez (MCE) sistemi genellikle ekson atlama verimliliğini analiz etmek için seçilir. Bu protokolde, üretici A’nın yanı sıra b üreticisi tarafından mce sistemi kullanılarak ekson atlama verimliliğini analiz etmek için gerekli adımları açıklarız, bundan böyle sistem A ve B olarak adlandırılır. Klinik çalışma sırasında ekson atlama verimi A sisteminde analiz edildi. Ancak, Sistem A artık satılık değildir ve b sisteminin ekson atlama verimliliğini analiz etmesini öneririz. Her iki sistem için protokoller dahil ettik (bkz. Bölüm 5.1 sistem A ve 5.2 sistem B için). A ve B sistemi ile ilgili bilgi için Malzeme Tablosu’na bakınız. Ayrıca, bu adım da normal agarose jel elektroforez ile yapılabilir, ancak duyarlılık belirgin azalır. A Sistemi kullanılarak mikroçip elektroforeziNOT: Sistem A’nın iki tür yongası vardır. Burada DNA çipinin adımlarını anlatıyoruz. Kit reaktiflerini (leke tamponu, yükleme tamponu, merdiven ve jel tamponu) RT, girdap ve aşağı doğru döndürün. Jel-leke tamponu (GS) hazırlamak için 12,5 l leke tamponu ekleyin 250 μL jel tampon ve girdap 10 s için. Çözeltiyi 15 dk boyunca 2.400 x g’de bir spin filtre tüpüne ve santrifüje taşıyın. Filtreyi atın.NOT: Filtrelenmiş GS 4 °C’de 1 ay saklanabilir. Numuneler yüksek konsantrasyondaysa, TE tamponu veya DNase içermeyen su ile yaklaşık 50 ng/μL’ye seyreltin.NOT: Numuneler tuz konsantrasyonunda ≥ 200 mM KCl (veya NaCl) ve/veya 15 mM MgCl2ise tamponu değiştirin. DNA çipinin jel astarına 12 μL GS çözeltisi ekleyin (vurgulanmış ve etiketli GS) ve çipi astar istasyonuna yerleştirin.NOT: Hava kabarcıklarından kaçınmak için pipet ucunu dikey olarak ve dağıtım yaparken kuyunun dibine takın. Pipetteki ilk durdurmaya yavaşça dağıtın ve pipetleme adımının sonunda ki havayı dışarı atmayın. C3 modunu seçin ve Başlat düğmesine basın. Astarlama tamamlandıktan sonra, çipi çıkarın. Mikro kanalları sıkışmış hava kabarcıkları veya eksik astarlar için görsel olarak inceleyin. Hazırlanan numuneleri ve merdiveni aşağıdaki gibi çipe yükleyin. Pipet 9 μL GS çözeltisi diğer 3 GS kuyuya. Pipet 5 μL yükleme tampon l kuyusu ve her örnek iyi (1-11). Pipet 1 μL merdivenle L kuyuya. Pipet 1 μL DNA örneği 11 örnek kuyunun her birine. Kullanılmayan kuyulara 1°L TE veya DNase içermeyen su pipet. Kit hızlı kılavuz fiş düzeni bir rakam gösterir.NOT: Çipi açık renkli bir arka plan üzerinde tutarak tüm kuyuları hava kabarcıkları için inceleyin. Bir kuyunun dibinde ki sıkışmış hava kabarcıklarını temiz bir pipet ucuyla veya çözeltiyi çıkararak ve yeniden yükleyerek yerinden çıkar. Çipi girdap istasyonuna yerleştirin ve Mixtuşuna basın. Girdap istasyonu 1 dk sonra otomatik olarak durur. Çipi yüklemeden sonraki 5 dakika içinde elektroforez istasyonunda çalıştırın. Yazılım araç çubuğunda Yeni Çalıştır’ı seçin. Yeni Çalıştırma ekranında, Tsay çekme listesinden DNA ve DNA 1K’yı seçin. Proje çekme listesinden çalıştırmak için bir proje klasörü seçin veya Proje alanına bir ad girerek yeni bir proje klasörü oluşturun. Çalıştır Öneki alanına çalıştır ın bir adı girin ve Çalıştır’ı başlat’ıtıklatın. Analiz tamamlandığında alet biş olur ve çalıştırmanın sonunu gösteren bir pencere açılır. Tamam’ı seçin ve çipi yonga platformundan çıkarın. Dosya Yı Seçin | Verileri dışa aktarmak için veri aktar. Dışa Aktarma iletişiminde istenen seçenekleri seçin. Elektrotları temizlemek için, bir temizleme yongasını 800 μL deiyonize su ile doldurun ve talaş platformuna yerleştirin, kapağı kapatın ve 1 dakika kapalı bırakın. 1 dakika sonra kapağı açın, temizleme çipini çıkarın ve elektrotların 1 dk kurumasını bekleyin. B sistemini kullanan mikroçip elektroforezi Çalışma yazılımını açın ve örnek bilgileri girin. Bilgileri girdikten sonra, yazılım arabellek ve işaretçözümleri ayırma miktarını otomatik olarak hesaplar. Yazılım tarafından hesaplanan gerekli miktarda ayırma arabelleği hazırlayın. İlk olarak, 10.000 x çözeltiyi uygun miktarda TE tamponu ile seyrelterek 100x nükleik asit jel leke çözeltisi hazırlayın. 100x çözelti -20 °C’de saklanabilir. 1x çözeltisi hazırlamak için şirket tarafından sağlanan belirli tüpte uygun miktarda 100x nükleik asit jel lekesi ile ayırma tamponunu karıştırın. Çözeltiyi girdap. Tüpte gerekli miktarda marker çözeltisi hazırlayın. Sonda yıkama programını başlatın. Bittiğinde mikroçip yıkama programını başlatın. Aynı anda, pipet bir PCR multiplate (96-iyi, açık) ve deiyonize su ile 4 kez seyreltmek için örnekleri. Makinenin işleyebilir minimum hacmi 6 μL ve maksimum 30 μL olduğunu. Toplam hacmi 10 μL (2,5 μL numune ve 7,5 μL su/TE-tampon) öneririz. Plakaları yapışkan PCR sızdırmazlık folyo levhalarla kaplayın ve numuneleri ters çevirin. Makinetarafından gösterilen yerleşime göre plaka, marker çözeltisi ve 1x ayıran arabelleği makineye ayarlayın. Başlat düğmesine basın. Çalıştırma tamamlandığında, sonuç verilerini yazılımdan .csv dosyası olarak dışa aktarın ve azı zrvetini kullanarak ekson atlama verimliliğini aşağıdaki gibi hesaplayın:Exon atlama verimliliği (%) = (Atlanan bant / (Atlanan bant + atlanan bant) X 100 6. Tamamlayıcı DNA (cDNA) dizilimi Agarose jel hazırlama Ölçü 1.5 g agarose tozu ve mikrowavable bir şişe de 100 mL 1x TAE tampon ile toz karıştırın (%1.5 agarose jel ile sonuçlanan). Mikrodalga 1-3 dk agarose tamamen çözülene kadar.NOT: Tamponun bir kısmı buharlaşacağı ve jelin son agarose yüzdesini değiştireceği için çözeltiyi aşırı kaynatmayın. Agarose çözeltisi yaklaşık 50 °C’ye soğumaya bırakın. Agarose çözeltisine 10 μL 10.000 x floresan nükleik asit boyası ekleyin. Yerinde iyi tarak ile bir jel tepsiye agarose dökün. Tamamen katılanına kadar 20-30 dk RT’de bekletin. Sıralama 5 μL RT-PCR ürün (adım 4.4’ten) ve 1 μL 6x yükleme tamponu karıştırın. % 1.5 agarose jel kuyuları içine yükleyin. Jeli 135 V’de 5 dk ve 120 V’da 20 dk çalıştırın. Üreticinin protokolüne göre bir transilluminator kullanarak bantları görselleştirin. Jel ilgi tüketim bantları ve RT-PCR ürünleri almak için bir jel ve PCR temizleme kiti kullanın. Bir spektrofotometre kullanarak konsantrasyonu ölçün.NOT: Saflaştırılmış bant, şirket içinde sanger sıralama ekipmanı yoksa, bir şirkette veya sıralama tesisinde sıralama için gönderilebilir. Tablo 4’egöre çok plakalı bir PCR plakaiçine bir döngü sıralama kiti ve pipet için gerekli reaktifleri hazırlayın. Astar dizileri için Tablo 2’ye bakınız. Plakayı açık yapışkan filmle kapatın. 2-3 s için plaka girdap. İçeriği 1.000 x gde kuyuların (5-10 s) altına yerleşmek böylece bir sallanan kova santrifüj kısaca santrifüj .NOT: Hava kabarcıkları kuyularda mevcut olabilir, ancak reaksiyonu olumsuz etkilemez. Karışımı bir termo-çevrimciye yerleştirin ve Tablo 5’egöre çalıştırın. Üreticinin talimatlarına göre plakalar ile sıralama reaksiyonları arındırın. Üreticinin protokolüne göre dizileri belirlemek için bir DNA analizörü kullanın. Elde edilen diziyi hastanın beklenen diziyle karşılaştırın. 7. Batı lekeleme Numune hazırlama Hazırlamak SDS örnek tampon (4% SDS, 4 M üre, 10% 2-mercaptoetanol, 10% gliserol, 70 mM Tris-HCl pH 6.4, 0.001% bromofenol mavi, ve proteaz inhibitörü). 150 μL SDS tamponunda kriyo kesitten toplanan 10 μm kas bölümlerinin yaklaşık 100 dilimini yerleştirin. Kısaca kullanışlı bir mikro homojejen kullanarak 30 s için buz üzerinde protein örnekleri homojenize. 15 dakika boyunca 16.500 x g’de santrifüj edin ve süpernatantı taze bir tüpe aktarın. -80 °C’de analiz edin veya depolayın. Protein konsantrasyonu ölçümü için SDS-PAGENOT: Protein konsantrasyonunu belirlemek için floresan jel lekesi kullanıldı. Normal sağlıklı kontrol numunesi ağırlığını ve BCA protein test kitini kullanarak konsantrasyonu üreticinin talimatlarına göre belirleyin. Jel elektroforez için örnekleri hazırlayın. Pipet 10 g sağlıklı kontrol ve 5 μL hasta numunesi, 5 μL 4x numune tampon, 2 μL 10x numune azaltma ajanı. Bunlar karıştırıldıktan sonra, her numunede 20 μL’lik son bir hacme deiyonize su ekleyin. Isı örnekleri 70 °C’de 10 dk. 50 mL 40x SDS çalışan tampon kullanarak 2.000 mL 1x SDS çalışan arabellek hazırlayın. 1.950 mL deiyonize su ile seyreltin.NOT: Bu noktada, 1.000 mL çalışan arabellek yeterlidir. Kalan 1.000 mL arabellek adım 7.3.1 kullanılır. Iyice karıştırın ve jel kutusunun alt (dış) tampon odasında kullanılmak üzere 1x SDS çalışan tampon 800 mL bir kenara koyun. Elektroforezden hemen önce, jel kutusunun üst (iç) tampon haznesinde kullanmak üzere 200 mL 1x SDS çalışan 500 μL antioksidan tampon ekleyin. Üreticinin protokolüne göre %3-8 Tris-asetat jel kurarak jel elektroforezine hazırlanın. Her numunenin 20 μL’sini jelüzerine yükleyin. 75 dk için 150 V elektroforez gerçekleştirin. Elektroforezden sonra, jeli doğrudan 50 mL floresan jel leke çözeltisi içeren temiz bir tepsiye yerleştirin. Tepsinin üzerini kapatın, bir shaker üzerine yerleştirin ve sıvı sıçraması veya 90 dakika boyunca jel zarar vermeden çalkalayın. Floresan tespit etmek için 312 nm illumination ethidium bromür emisyon filtresi ile bir floresan sisteminde görüntüleme önce suya jel aktarın. Bilinen konsantrasyonile normal kontrol lysate kullanılarak inşa analitik bir eğri dayalı hasta örneklerinin konsantrasyonlarını ölçün. Batı lekeleme için SDS-PAGE 7.2.4-7.2.6 adımlarına göre jel kutusunu hazırlayın. Adım 7.2.11’de elde edilen konsantrasyon ölçümüne göre, sağlıklı kontrol lysate şerit başına 100 μg ve hasta numunesinin şerit başına 300 μg yükleyin. Adım 7.2.7 ile aynı ayarları kullanan elektrofor. Protein transferi Aktarım arabelleği hazırlayın. Metanol 20 s için bir PVDF membran ıslatın. Kullanıma kadar blotlama arabelleği B’ye taşıyın. Tampon başına en az 30 dakika boyunca ekstra kalın bir lekeleme kağıdını a, b ve C’de ıslatın. Elektroforezden sonra jeli 5 dakika boyunca blotting tampon B’de bekletin. Şekil 1’dekiçizime göre lekeleme kağıtları, PVDF membran ve jeli yarı kuru transfer makinesine yerleştirin. Bir rulo ile jel ve membran arasında hava kabarcıkları dışarı rulo. RT’de 1 saat için 2 mA/cm2 membrandan aktarın.NOT: Transferden sonra, büyük molekül ağırlıklı proteinlerin başarılı transferini doğrulamak için Ponceau boyamabenzer toplam protein lekesi yapmak tavsiye edilir. Bloke ve antikor boyama PBST ile membranı iki kez durula (%0.1 Tween 20 ile 1x PBS). Membranı %1 blokaj maddesine yerleştirin ve rt’de 1 saat boyunca hafifçe kayayı bloke edin. Membranı bloklama çözeltisinde anti-distrofin antikor (1:125) ve anti-spectrin antikor (1:25,000) ile 1 saat boyunca RT’de veya gece boyunca 4 °C’de inkübe edin. Membranı RT’de PBST ile her biri 10 dakika boyunca üç kez yıkayın. PBST’de (1:100) RT’de 40 dakika boyunca horseradish peroksidaz (HRP) konjuge sekonder anti-fare/tavşan antikorile membranı kuluçkaya yatırın. RT’de PBST ile 10 dakika boyunca membranı üç kez tekrar yıkayın. Algılama A ve B algılama solüsyonlarını 1:1 oranında karıştırın. Gerekli algılama reaktifinin son hacmi 0,1 mL/cm2 membrandır. Yıkanmış membran dan fazla PBST çıkarın ve plastik şal veya diğer uygun temiz yüzeylerin bir levha üzerinde protein tarafı ile yerleştirin. Karışık algılama reaktifini membrana ekleyin ve RT’de 5 dakika kuluçkaya yatırın. Membranı hafifçe forcep’lerde tutarak ve kenarı bir dokuya değdirerek fazla algılama reaktifini çıkarın. Leke proteini tarafını bir numune tepsisi üzerine yerleştirin. Floresan sistemi kullanıcı belgelerine göre çalıştırın. Makineyi aşağıdaki gibi ayarlayın. Pozlama türü: Artış, Aralık süresi: 10 s, Hassasiyet/Çözünürlük: yüksek.NOT: Ölçülen alanlar mavi dikdörtgen ile kutulandı (Şekil 4a-b): BG: arka plan; D: distrofin 427 kDa, SL: spektrin beta uzun izoform (274 kDa); SS: kısa isoform (253 kDa). Distrofin/spektrin sinyal oranı (D-BG)/[(SL-BG) + (SS-BG)] olarak hesaplandı. Normal kontrol oranı 0 olarak belirlenmiştir.
Representative Results
Ekson atlamayı algılamak için RT-PCR kullanmak için, atlanacak eksyonun her iki tarafındaki astarlar yalnızca belirli bantlar verecek şekilde tasarlanmış ve değerlendirilmiştir (ekson atlama ve astar pozisyonunun şematik diyagramı için Şekil 2’ye bakınız). Astarlar, MCE yoksa, bir MCE sisteminde veya normal agarose jel elektroforezinde boyuta göre kolayca ayırt edilebilen ürünler üretmelidir. Şekil 3a, doz yükseltme fazı 1 çalışmada NS-065/NCNP-01 ile tedavi öncesi ve sonrası ns-03 ve NS-07 hastalarından atlanan bandın RT-PCR reaksiyonlarının bir jel görüntüleri ve sekans sonuçları gösterir. NS-03 ve NS-07, sırasıyla 45-52 ve 48-52’yi kapsayan silme leri barındırır. NS-03 5 mg/kg ve NS-07 20 mg/kg NS-065/NCNP-01 haftalık 12 hafta boyunca alındı. Tedaviden önce beklendiği gibi, her iki hastada da atlama yoktu ve sadece atlanamayan bir bant görüntülenemedi. 12 haftalık tedaviden sonra NS-07 için net bir alt bant görüntülendi. Ancak, hasta NS-03 için atlanan herhangi bir ürünü tespit etmek hala zordu. Sıralama sonuçları, NS-07 için 47 ve 54 ekstremitelerin, NS-03 için ise 44 ve 54’ün bir araya geldiğini gösterdi. Diziye göre, bunlar teorik olarak işlevsel ama kısaltılmış bir distrofin izoform üretebilir. Şekil 3b’degösterilen atlama yüzdesini hesaplamak için, atlanan bandın azı zıtası konsantrasyonu atlanan ve atlanmamış bant aylaklanan bant adedine bölündü. Hasta NS-07’de tedavi sonrası oran , NS-03 için %3.4 idi. NS-03, NS-07 ve sağlıklı kontrol hastalarından alınan batı leke verileri (triplicate olarak) Şekil 4a’dagösterilmiştir. Beklendiği gibi tedaviden önce distrofin bandı saptamadı. Tedaviden sonra hasta NS-07’den bir bant sağlıklı kontrole göre daha düşük molekül ağırlığı ile saptandı (yabani tip distrofin molekül ağırlığı 427 kDa, NS-07 distrofin ise 389 kDa moleküler ağırlığa sahiptir). Ekson silme ve atlama nedeniyle, hasta NS-07 distrofin izoform birkaç ekson yoktu, ve daha düşük bir molekül ağırlığı olması bekleniyordu. Hasta NS-03 tedavi den sonra tespit edilebilir distrofin düzeyleri göstermedi. Şekil 4b’dehasta NS-07 için sağlıklı bir kontrole göre distrofin miktarı gösterilmiştir. Distrofin restorasyonunun hesaplanmasında sinyal yoğunluklarının ölçüldüğü yer mavi karelerle gösterilir. Distrofin spektrin oranı, sağlıklı kontrole göre distrofin miktarını hesaplamak için kullanıldı. Bu amaçla, distrofin eksi arka plandan gelen sinyal iki spektrin isoformun toplamına bölündü (uzun ve kısa) eksi arka plan (bkz. adım 8.6.5). Sağlıklı kontrol oranı 0 olarak belirlenmiştir. Tedavi sonrası ns-07’de sağlıklı kontrole göre distrofin miktarı %9.1 idi. Ancak, her iki hasta için de önceki tedavi örnekleri için alınanlara benzer zayıf bir distrofin bandı nedeniyle hasta NS-03 için bu oran hesaplanamadı. Şekil 1: Batı leke analizi için transfer yığınının şematik diyagramı. Batı leke transfer yığınının alttabakadaki blotting tampon A ile ıslatılmış blotlama kağıdı ile montajı ve ardından blotlama arabelleği B, PVDF membran, %3-8 Tris-Asetat Jel ve üst 2 lekeleme kağıdında blotting tampon C’ye batırılmış olarak gösterilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 2: DMD geninde ekson 45-52 deleasyonu olan bir hastada ekson 53 ekson atlama şematik çizimi. Örneğin, doz yükseltme klinik çalışmada hasta NS-03 bu silme vardı. Ekson 53 korunursa, exon 44 ve 53 arasındaki ekson ekson bağlantısı okuma çerçevesini bozduğundan, ekson 53’te stop kodonuna neden olan mRNA çerçevenin dışında olacaktır. Exon 53 atlandığında okuma çerçevesi geri yüklenir ve daha kısa bir distrofin isoformu üretilir. RT-PCR tarafından exon 53 atlamatespit etmek için, ekson 44 ve 54 astarlar atlanan ve atlanmamış mRNA arasındaki PCR ürün kolayca tespit edilebilir şekilde kullanılır. FWD: ileri astar, REV: ters astar, PMO: fosforodiamiat morpholno oligomer. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 3: Tibialis anterior kas biyopsisi örneklerinden ns-03 ve NS-07 hastalarının veriminin atlanması. a)Elektroforez sistemi Tarafından oluşturulan jel görüntüsü NS-03 ve NS-07 hastalarından alınan tedavi edilmemiş ve tedavi edilmemiş örneklerden oluşan RT-PCR örneklerinin A’sı. Üst panel, NS-03 ve alt panel NS-07’yi triplicate olarak gösterir. NS-03 için atlanmamış bant 422 bp, atlanan bant ise 212 bp’dir. NS-07 için bantlar sırasıyla 836 bp ve 624 bp’dir. Dizi analizi, NS-03 için exon 44 ve exon 54 ile NS-07 için ekse 54’ün bir araya geldiğini gösterdi. b)Tedavi öncesi ve sonrası verim atlama, a sistemi tarafından sağlanan iki bandın molar konsantrasyonundan hesaplanan ns-03 ve NS-07 hastalar için gösterilir, atlanan bant/(atlanan bant + atlanmamış bant) x 100. NS-03 için atlama verimi tedaviden sonra çok düşüktü; NS-07 için atlama verimi ‘in üzerindeydi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 4: Distrofin isoformlarının ekson atlama tedavisi öncesi ve sonrası protein nicelemesi. a)Distrofin isoformlarının ekson atlama tedavisi öncesi ve sonrası protein niceliği. Tedavi öncesi ve sonrası ns-03 ve NS-07 hastalarından ve triplicate sağlıklı kontrolden tibialis anterior kas biyopsisi Batı blot. Distrofin sağlıklı kontrol için 427 kDa ve tedavi sonrası NS-07 için 389 kDa görülebilir. Tedaviden önce her iki hasta için de distrofin saptanamadı veya ns-03 için tedavi sonrası herhangi bir distrofin saptanamadı. Kara kutudaki alan Şekil 4b’degösterilmiştir. Her lekenin solunda işaretleyici gösterilir. b)Hasta NS-07 için tedavi sonrası geri yüklenen distrofin miktarı. Distrofin restorasyonu, distrofin, arka plan ve formüle göre uzun ve kısa spektrin isoform bantlarının yoğunlukları esas alınerek hesaplanmıştır: (distrofin – arka plan)/(spectrin L -background) + (spectrin S – background) sağlıklı kontrol oranı 0 olarak belirlenmiştir. Her bandın yoğunluğu, şekilde gösterilen mavi kutular içinde ölçüldü. NS-07 için distrofin restorasyonu tedavi sonrası %9.1 idi. Distrofin sinyali tedavi edilmeyen numunelerde ölçülemeyecek kadar zayıftı. Marker boyutları kilodaltons gösterilir. Dys: Distrofin, BG: arka plan, SL: SL: SS: SS: Spectrin kısa isoform, Myosin tip 1. Marker boyutları kilodaltons gösterilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Çözüm Hacim/Reaksiyon (3l) Son konsantrasyon RNase içermeyen su (sağlanan) Değişken – 5x QIAGEN OneStep RT-PCR Tampon 5.0 1 x dNTP Mix (her dNTP’den 10 mM içeren) 1.0 Her dNTP’nin 400 μM İleri Astar (10 μM) 1.5 0,6 μM Ters Astar (10 μM) 1.5 0,6 μM QIAGEN OneStep RT-PCR Enzim Karışımı 1.0 – RNase inhibitörü (isteğe bağlı) Değişken 5-10 adet/reaksiyon Şablon RNA 50 ng Toplam 25 Tablo 1: RT-PCR reaktifleri. RT-PCR bir reaksiyon için gerekli bileşikler. Astar Sıra 44F 5′-CCTGAGAATTGGGAACATGC-3′ 46F 5′-AACCTGGAAAAGAGCAGCAA-3′ 48F 5′-CCAAGAAGGACCATTTGACG-3′ 54/55R 5′-TCTCGCTCACTCACCCTTTTTT-3′ 54R 5′-GTGGACTTTTCTGGTATCAT-3’ Tablo 2: Astar listesi. Bu çalışmada kullanılan astarlar için diziler. F: İleri, R: Ters. 1 döngü Ters transkripsiyon 30 dk 50 °C 1 döngü İlk PCR etkinleştirme adımı 15 dk 95 °C 35 döngü Denatürasyon 1 dk 94 °C Tavlama 1 dk 60 °C Uzantısı 1 dk 72 °C 1 döngü Son uzatma 7 dk 72 °C Tutun ∞ 4 °C Tablo 3: PCR şartlı kullanılır. RT-PCR reaksiyonu için PCR koşullarını gösterin. Çözüm Hacim/Reaksiyon (3l) RNase içermeyen su Değişken BigDye Terminatör 3.1 Hazır Reaksiyon Karışımı 3.5 İleri Astar/Ters Astar (3,2 μM) 2.0 Şablon RNA 20 ng Toplam 20 Tablo 4: Sıralama reaksiyonu için gerekli reaktifler. Kurulumda ileri veya geri astar kullanın, her ikisini de aynı anda değil. 1 döngü 1 dk 96 °C 25 döngü 10 s 96 °C 5 s 50 °C 4 dk 60 °C Tutun ∞ 4 °C Tablo 5: Sanger dizilimi için PCR koşulları.
Discussion
DMD’nin klinik çalışmaları son birkaç yılda hem başarılar hem de başarısızlıklar ortaya çıkarmış oldu. Hem RT-PCR hem de batı lekeleme, hastalara uygulanan ekson atlama bileşikleri tarafından oluşturulan atlama verimliliğini değerlendirmek için yaygın tekniklerdir. Ancak, RT-PCR dijital PCR15ile karşılaştırıldığında atlama verimliliği aşırı tahmin bildirilmiştir. Bunun birkaç nedeni olsa da, öncelikle PCR döngüleri sırasında atlanan küçük parçaların daha verimli amplifikasyonu neden olur. Bu klinik çalışmada kullanılan RT-PCR de batı lekelenme tarafından tahmin protein ekspresyonuna göre daha yüksek atlama verimliliği üretti görünür. FDA göre, bu distrofin restorasyon12ölçmek için daha güvenilir bir yoldur. Bu nedenle, RT-PCR atlama sonuçları yorumlarken dikkatli olmalıdır; ancak örnekler hala karşılaştırılabilir. RT-PCR’ye dayalı daha yüksek atlama verimi gösteren örnekler, batı leke analizlerinde genellikle daha yüksek protein ekspresyonu düzeylerini ortaya çıkar.
DMD klinik çalışmalardaki tüm hastalar aynı silme desenine sahip olmadığından, tüm numunelerde dijital veya qPCR yapmak için yeterli derecede özel astar ve problar tasarlamak zor olabilir. Bu nedenle, RT-PCR hala atlama verimliliği ilk değerlendirme için iyi bir alternatiftir. NS-065/NCNP-01 klinik denemesi başlamadan önce, hastaya özgü miyoblastlar oluşturmak için kas veya deri biyopsisi zorunlu olduğundan, in vitro her hasta için atlama etkinliğini değerlendirmek sıkıcı oldu. Ancak, son zamanlarda yeni bir DMD kas hücresi modeli16olarak hastaya özgü MYOD1 dönüştürülmüş, idrar türetilmiş hücreler (UDCs) oluşturmak için yeni bir teknik yayınladık. Bu nedenle, hastadan toplanan idrar sadece idrar miyoblastlar oluşturmak için gereklidir ve hiçbir invaziv prosedür gereklidir. Bu yöntemin hastaya özel hücrelerde farklı AON’leri taramak için kullanılabileceğine inanıyoruz. Ayrıca, farklı astar ve problar hasta herhangi bir klinik deneme başlamadan önce test edilebilir. Bu, gelecekte DMD klinik çalışmalarında ölçüm atlamak için qPCR veya dijital PCR kullanımını kolaylaştırabilir.
Bu klinik çalışmada batı leke analizi nin gerçekleştirilmesi için distrofine karşı tek bir antikor kullanılmış ve referans numune olarak sadece bir sağlıklı kontrol kullanılmıştır. Bu nedenle, antikor özgüllüğü uygun doğrulanmadı. Bu, antikor sadece distrofin C-terminal etki tanır gerçeği ile birlikte, protokolün bir sınırlamadır. Distrofin molekülünün farklı etki alanlarında ndaha sağlıklı kontroller ve antikorlar ileride tavsiye edilir.
Burada, NS-065/NCNP-01’in son araştırmacı araştırmacı tarafından başlatılan, ilk insan anına ait denemede kullanılan protokolleri özetledik. NS-065/NCNP-01, DMD’li hastaların %10.1’i için potansiyel olarak geçerlidir.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dr Takashi Saito, Dr Tetsuya Nagata, Bay Satoshi Masuda ve Dr Eri Takeshita’ya bilimsel tartışmalar için minnettarız.
Materials
| 100 bp DNA Ladder | Takara | 3407A | marker solution for MultiNA |
| 1mol/l-Tris-HCl Buffer Solution(pH 7.6) | Nacalai | 35436-01 | |
| 2-mercaptoethanol | Nacalai | 21418-42 | |
| 2-Methylbutane (Isopentane) | Sigma-Aldrich | 15-2220 | |
| 5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube | Falcon | 352235 | |
| 6× Loading Buffer | Takara | 9156 | |
| Agarose ME | Iwai chemical | 50013R | |
| Applied Biosystems 3730 DNA Analyzer | Applied Biosystems | A41046 | |
| BD Matrigel Matrix | BD Biosciences | 356234 | |
| BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit | Applied Biosystems | 4337455 | |
| Bovine Serum Albumin solution | Sigma-Aldrich | A8412 | |
| Bromophenol blue | Nacalai | 05808-61 | |
| Centri-Sep 96-Well Plates | Applied Biosystems | 4367819 | |
| cOmplete Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 4693116001 | |
| DMEM/F-12 | Gibco | 11320033 | |
| ECL Prime Blocking Reagent | GE healthcare | RPN418 | |
| ECL Prime Western Blotting Detection Reagent | GE healthcare | RPN2232 | |
| Endo-Porter | GeneTools | 2922498000 | |
| Experion Automated Electrophoresis Station | Bio-Rad | 7007010 | Microchip electrophoresis system A |
| Experion DNA 1K Analysis Kit for 10 Chips | Bio-Rad | 7007107JA | |
| Experion Priming Station | Bio-Rad | 7007030 | |
| Experion Vortex Station II | Bio-Rad | 7007043 | |
| Extra Thick Blot Filter Paper | Bio-Rad | 1703965 | |
| EzBlot | Atto | AE-1460 | |
| GelRed Nucleic Acid Gel Stain | Biotium | 41003 | |
| glass vial | Iwaki | 1880 SV20 | |
| Glycerol | Nacalai | 17045-65 | |
| Histofine Simple Stain MAX PO | Nichirei | 424151 | |
| Horse Serum | Gibco | 16050122 | |
| Immobilon-P Transfer Membrane | Millipore | IPVH304F0 | |
| ITS Liquid Media Supplement | Sigma-Aldrich | I3146 | |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 34860 | |
| MicroAmp Clear Adhesive Film | Applied Biosystems | 4306311 | |
| MultiNA | SHIMADZU | MCE-202 | Microchip electrophoresis system B |
| Multiplate 96-Well PCR Plates | Bio-Rad | mlp9601 | |
| NanoDrop One Microvolume UV-Vis Spectrophotometer with Wi-Fi | Thermo Scientific | ND-ONE-W | |
| NovocastraTM Lyophilized Mouse Monoclonal Antibody Dystrophin (C-terminus) | Leica biosystems | NCL-DYS2 | |
| NovocastraTM Lyophilized Mouse Monoclonal Antibody Spectrin | Leica biosystems | NCL-SPEC1 | |
| NuPAGE 3-8% Tris-Acetate Protein Gels | Invitrogen | EA03785BOX | |
| NuPAGE Antioxidant | Invitrogen | NP0005 | |
| NuPAGE LDS Sample Buffer | Invitrogen | NP0007 | |
| NuPAGE Sample Reducing Agent | Invitrogen | NP0009 | |
| NuPAGE Tris-Acetate SDS Running Buffer | Invitrogen | LA0041 | |
| Oriole Fluorescent Gel Stain | Bio-Rad | 1610496 | |
| PBS | Gibco | 10010023 | |
| Penicillin-Streptomycin Solution Stabilized | Sigma-Aldrich | P4458 | |
| Physcotron Handy micro-homogenizer | MICROTEC | NS-310E3 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23227 | |
| Polybrene Infection / Transfection Reagent | Sigma-Aldrich | TR-1003 | |
| Propidium Iodide Staining Solution | BD Pharmingen | 556463 | |
| QIAGEN OneStep RT-PCR Kit | Qiagen | 210212 | |
| RNeasy Fibrous Tissue Mini Kit | Qiagen | 74704 | |
| SDS | Nacalai | 31606-75 | |
| Semi-dry transfer machine | Bio Craft | 41-1293 | |
| SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain | Invitrogen | S11494 | for MultiNA |
| TAE Buffer | Nacalai | 35430-61 | |
| Tragacanth Gum | Wako | 200-02245 | |
| Tris-EDTA Buffer | Nippon Gene | 316-90025 | for MultiNA |
| Trypsin-EDTA (0.05%) | Gibco | 25300054 | |
| TWEEN 20 | Sigma-Aldrich | P9416 | |
| Urea | Nacalai | 35907-15 | |
| Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System | Promega | A9281 | |
| XCell SureLock Mini-Cell | Invitrogen | EI0001 |
References
- Bushby, K., et al. Diagnosis and management of Duchenne muscular dystrophy, part 2: implementation of multidisciplinary care. Lancet Neurology. 9 (2), 177-189 (2010).
- Hoffman, E. P., Brown, R. H., Kunkel, L. M. Dystrophin: the protein product of the Duchenne muscular dystrophy locus. Cell. 51 (6), 919-928 (1987).
- Mendell, J. R., et al. Evidence-based path to newborn screening for Duchenne muscular dystrophy. Annals of Neurology. 71 (3), 304-313 (2012).
- Moat, S. J., Bradley, D. M., Salmon, R., Clarke, A., Hartley, L. Newborn bloodspot screening for Duchenne muscular dystrophy: 21 years experience in Wales (UK). European Journal of Human Genetics. 21 (10), 1049-1053 (2013).
- Greenberg, C. R., et al. Gene studies in newborn males with Duchenne muscular dystrophy detected by neonatal screening. Lancet. 2 (8608), 425-427 (1988).
- Forrest, S. M., et al. Further studies of gene deletions that cause Duchenne and Becker muscular dystrophies. Genomics. 2 (2), 109-114 (1988).
- Monaco, A. P., Bertelson, C. J., Liechti-Gallati, S., Moser, H., Kunkel, L. M. An explanation for the phenotypic differences between patients bearing partial deletions of the DMD locus. Genomics. 2 (1), 90-95 (1988).
- Flanigan, K. M., et al. Mutational spectrum of DMD mutations in dystrophinopathy patients: application of modern diagnostic techniques to a large cohort. Human Mutation. 30 (12), 1657-1666 (2009).
- Aoki, Y., et al. In-frame dystrophin following exon 51-skipping improves muscle pathology and function in the exon 52-deficient mdx mouse. Molecular Therapy. 18 (11), 1995-2005 (2010).
- Lu, Q. L., et al. Functional amounts of dystrophin produced by skipping the mutated exon in the mdx dystrophic mouse. Nature Medicine. 9 (8), 1009-1014 (2003).
- Yokota, T., et al. Efficacy of systemic morpholino exon-skipping in Duchenne dystrophy dogs. Annals of Neurology. 65 (6), 667-676 (2009).
- Kesselheim, A. S., Avorn, J. Approving a Problematic Muscular Dystrophy Drug: Implications for FDA Policy. Journal of the American Medical Association. 316 (22), 2357-2358 (2016).
- Mendell, J. R., et al. Eteplirsen for the treatment of Duchenne muscular dystrophy. Annals of Neurology. 74 (5), 637-647 (2013).
- Komaki, H., et al. Systemic administration of the antisense oligonucleotide NS-065/NCNP-01 for skipping of exon 53 in patients with Duchenne muscular dystrophy. Science Translational Medicine. 10 (437), (2018).
- Verheul, R. C., van Deutekom, J. C., Datson, N. A. Digital Droplet PCR for the Absolute Quantification of Exon Skipping Induced by Antisense Oligonucleotides in (Pre-)Clinical Development for Duchenne Muscular Dystrophy. PLoS One. 11 (9), e0162467 (2016).
- Takizawa, H., et al. Modelling Duchenne muscular dystrophy in MYOD1-converted urine-derived cells treated with 3-deazaneplanocin A hydrochloride. Scientific Reports. 9 (1), 3807 (2019).
Cite This Article
Nordin, J. Z., Mizobe, Y., Nakamura, H., Komaki, H., Takeda, S., Aoki, Y. Characterizing Exon Skipping Efficiency in DMD Patient Samples in Clinical Trials of Antisense Oligonucleotides. J. Vis. Exp. (159), e60672, doi:10.3791/60672 (2020).