アンチセンスオリゴヌクレオチドの臨床試験におけるDMD患者サンプルにおけるエキソンスキップ効率の特徴付け

調査官が開始した試験の運用手順は、NCNP倫理委員会(承認ID:A2013-019)によって承認されました。 1. 筋肉サンプルの調製 注:上腕二頭筋や四頭筋はしばしば生検部位として選択されます。しかし、チバアリス前房は臨床試験で使用された。 患者からの筋肉生検 皮膚の準備前に切開部位をマークします。 生検標本のために生理的に湿らせたガーゼを準備しなさい。ガーゼをよく絞ります。 皮膚および皮下組織に局所麻酔を注入するが、筋肉には注入しない。皮痛の欠如によって麻酔の深さを確認してください。注:全身麻酔は、一般的に15歳未満の小児科患者に使用されます。 皮膚から皮下組織への切開を行います。切開部を開き、皮下脂肪を分離するために小さなレトラクターを使用してください。注:このステップでは、皮膚の一部を線維芽細胞培養のために切断することができます。 鼻隠しにもう一つの小さな切開を行い、さらに鼻隠しをカットします。筋肉を露出させるために蚊の鉗子を使用してエッジをクランプします。 縫合糸を使用して、筋肉の選択した部分を引き上げろ。アイリスはさみを使って小さなトンネルを作り、蚊の鉗子をトンネルに挿入します。 鉗子を使用して筋束を分離し、ターゲット部分の両端を切断します。注:筋肉生検標本は、成人患者のための鉛筆のサイズの周りでなければなりません(長さ1.0-1.5 cm、直径0.8-1.0 cm)。検体は小児科患者では約1cm、直径5mm程度であるべきである。 試料を生理食い物に覆ったガーゼで包み、新鮮な筋肉を室温(RT)で直ちに、試料を更なる分析のために準備できる施設に運ぶ。注:輸送期間が1時間を超える場合は、試料を4°Cで輸送する必要があります。 2. 筋肉サンプルの準備 ガムが柔らかく粘着性になるまで、トラガカンスガムと水の等しい量を混ぜます。混合物を25 mLの注射器に入れます。注射器は冷蔵庫に保管できます。 コルクディスクに約0.5〜1cmのトラガカンスガムを置きます。反対側のディスクにラベルを付けます。 液体の一部が凍結するまで液体窒素中にイセペンタンの容器を入れます。 トラガカンスガムに標本を入れる。各筋肉の縦軸はコルクに対して垂直であるべきである。適切な配置を助けるために、各筋肉の底の周りにガムを配置します。 ピンセットを使用して、筋肉/コルク標本をステップ2.3で調製した冷たいイポペンタンに入れて凍結します。試料を1分間、または完全に凍結するまで絶えず動かし、一時的にドライアイスの上に置きます。 ガラスバイアルに試料を入れ、-80°Cに保管してください。 3. 筋肉の切り離し -25 °Cの動作温度で切り離し用のクライオスタットを設定します。 コルク/筋肉ブロックをマウントし、平らなセクションが達成されるまでトリム. RT-PCRおよびウェスタンブロッティングには、10 μmの断面厚さを使用してください。免疫検査、ヘマトキシリン、エオシン染色には、それぞれ6~8μm、10~12μmの厚さを使用してください。2.0 mLチューブにスライスしたセクションを入れ、RT-PCRおよびウェスタンブロッティングのために-80 °Cで保管してください。 4. RNA抽出および逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(RT-PCR) 凍結した筋肉から、約10枚の厚さをクライオスタットで抽出します。メーカーの指示に従って、全RNAの精製キットを使用して精製された全RNAを回収します。 分光光度計を用いてRNA濃度を測定します。 表 1に従って、RT-PCR 反応に必要な試薬を PCR チューブに組み合わせます。プライマーシーケンスについては、表 2を参照してください。注:前方プライマーは患者NS-03のための44Fおよび患者NS-07のための46Fであった。リバースプライマーは、デフォルトとして54/55Rでした。非特異的な製品が明らかな場合、54Rが代替として使用されました。 混合物を含むPCRチューブをサーモサイクラーに入れます。 表 3に従ってサーモサイクラーを実行します。 PCR製品は、短期保存用に4°C、長期保存用に-20 °Cに保存してください。 5. マイクロチップ電気泳動とエキソンスキップ計算 メモ:多くの場合、マイクロチップ電気泳動(MCE)システムは、エキサクのスキップ効率を分析するために選択されます。本プロトコルでは、メーカーAとメーカーB(以下、システムAおよびB)によるMCEシステムを用いて、エキソンスキップ効率を分析するために必要なステップを説明する。臨床試験の間、エキソンスキップ効率をシステムAで分析した。しかし、システムAはもはや売り物ではなく、エキサクスキップ効率を分析するシステムBを推奨します。両方のシステムのプロトコルが含まれています(システムAの場合は5.1、システムBの場合は5.2を参照)。システム A および B に関する情報については、 資料表 を参照してください。さらに、この工程は、通常のアガロースゲル電気泳動で行うこともできますが、感度は著しく低下します。 システムAを用いたマイクロチップ電気泳動注: システム A には 2 種類のチップがあります。ここでは、DNAチップの手順について説明します。 キット試薬(染色バッファ、ローディングバッファ、ラダー、ゲルバッファ)をRT、ボルテックス、スピンダウンに平衡化します。 ゲル染色バッファー (GS) を調製するには、12.5 μL の汚れバッファーを 250 μL のゲルバッファーと渦を 10 秒に加えます。溶液をスピンフィルターチューブに、遠心分離機を2,400 x g で15分間動かします。フィルタを破棄します。注:フィルターしたGSは1ヶ月間4°Cで保存することができます。 サンプルが高濃度の場合は、TEバッファーまたはDNaseフリー水で約50 ng/μLに希釈します。注:サンプルが塩濃度200 mM KCl(またはNaCl)および/または15 mM MgCl2である場合は、バッファーを交換します。 DNAチップのゲルプライミングウェル(強調表示され、ラベル付けされたGS)にGS溶液12 μLを加え、チップをプライミングステーションに配置します。注:気泡を避けるために、ピペットチップを塗布時に垂直に、ウェルの底に挿入します。ピペットの最初の停留所までゆっくりと分配し、ピペットステップの終わりに空気を排出しないでください。 C3モードを選択し、 スタート ボタンを押します。プライミングが完了したら、チップを取り外します。 マイクロチャネルに閉じ込められた気泡や不完全なプライミングがないかを視覚的に検査します。 以下のように、準備したサンプルとラダーをチップに積み込みます。 ピペット9 μLのGS溶液を他の3 GSウェルに取り込みます。 Lウェルおよび各サンプルに負荷バッファーのピペット5 μL(1-11)。 ピペット1 μLのラダーをLウェルに入る。 11個のサンプルウェルのそれぞれに1μLのDNAサンプルをピペットします。 TEまたはDNaseフリーの水のピペット1 μLは、未使用の井戸に入ります。キットのクイックガイドはチップレイアウトの図を示しています。注:チップを軽く着色した背景の上に保持して、すべてのウェルに気泡がないか調べます。きれいなピペットチップで、または溶液を取り外して再ロードすることによって、井戸の底に閉じ込められた気泡を取り外します。 渦ステーションにチップを置き、ミックスを押 します。渦のステーションは1分後に自動的に停止します。 負荷から5分以内に電気泳動ステーションでチップを実行します。 ソフトウェアツールバーで[新規実行]を選択します。[新規実行]画面で、アッセイプルダウンリストからDNAとDNA1Kを選択します。 [プロジェクト]プルダウン リストから実行するプロジェクト フォルダを選択するか、[ プロジェクト ]フィールドに名前を入力して新しい プロジェクト フォルダを作成します。 [ 実行プレフィックス ] フィールドに実行の名前を入力し、[ 実行開始] をクリックします。 解析が完了すると音源がビープ音を鳴り、実行の終了を示すウィンドウが開きます。 [OK] を 選択し、チップ プラットフォームからチップを取り外します。 ファイルの選択 |データをエクスポートしてデータをエクスポートします。エクスポートダイアログで必要なオプションを選択します。 電極を洗浄するには、800 μLの脱イオン水でクリーニングチップを充填し、チッププラットフォーム上に置き、蓋を閉めて1分間閉じたままにします。1分後、蓋を開け、クリーニングチップを取り外し、電極を1分間乾燥させます。 システムBを用いたマイクロチップ電気泳動 オペレーティング・ソフトウェアを開き、サンプル情報を入力します。情報を入力すると、ソフトウェアは分離バッファとマーカーソリューションの量を自動的に計算します。 ソフトウェアによって計算された分離バッファの必要量を準備します。まず、適量のTEバッファーで10,000x溶液を希釈して100x核酸ゲル染色液を調製する。100x溶液は-20°Cで保存することができます。 会社が提供する特定のチューブに100x核酸ゲル染色剤を適量混合し、1x溶液を調製する特定のチューブ内で分離緩衝液を配合する。溶液を渦。 チューブ内のマーカー溶液の必要量を準備します。 プローブ洗浄プログラムを開始します。 完了したら、マイクロチップの洗浄プログラムを開始します。 同時に、サンプルをPCRマルチプレート(96ウェル、クリア)にピペットし、脱イオン水で4回希釈します。機械が扱える最小容積は6 μLで、最大は30 μLです。総体積は10μL(2.5μLサンプル、水/TEバッファ7.5μL)を推奨します。 粘着PCRシールホイルシートでプレートを覆い、サンプルをスピンダウンします。 機械で示される配置に従って、プレート、マーカー溶液、および1x分離バッファを機械にセットします。 [スタート ]ボタンを押します。 実行が完了したら、ソフトウェアから結果データを .csv ファイルとしてエクスポートし、次のようにモル濃度を使用してエキサクスキップ効率を計算します。エキサシスキップ効率(%)=(スキップバンド/(スキップバンド+非スキップバンド) X 100 6. 相補DNA (cDNA) シーケンシング アガロースゲル製剤 アガロース粉末1.5gを測定し、マイクロウェーブ可能なフラスコ(1.5%アガロースゲルをもたらす)に1x TAEバッファーの100 mLと粉末を混合します。 アガロースが完全に溶解するまで1〜3分間の電子レンジ。注:バッファーの一部が蒸発し、ゲルの最終的なアガロースパーセントを変更するので、溶液をオーバーボイルしないでください。 アガロース溶液を約50°Cに冷却させる。 アガロース溶液に10μL 10,000x蛍光核酸染料を加えます。 アガロースをウェルコームを所定の位置に置いてゲルトレイに注ぎます。完全に固まるまでRTで20〜30分間放置します。 シーケンス RT-PCR製品の5 μL(ステップ4.4から)と6xローディングバッファの1 μLを混合します。1.5%アガロースゲルの井戸にロードします。 ゲルを135 Vで5分間、120 Vで20分間動かします。 メーカーのプロトコルに従ってトランスイルミエータを使用してバンドを視覚化します。 ゲルから目的の物品切れバンドを使用し、ゲルと PCR のクリーンアップ キットを使用して RT-PCR 製品を取得します。 分光光度計を用いて濃度を測定します。注: 精製バンドは、Sanger シーケンシング装置が社内で使用できない場合、会社またはシーケンシング施設でシーケンシングのために送信できます。 サイクルシーケンシングキットとピペットに必要な試薬を、 表4に従ってマルチプレートPCRプレートに準備する。プライマーシーケンスについては 、表 2 を参照してください。 透明な粘着フィルムでプレートを密封します。 プレートを2~3sに渦する。遠心分離機は、1,000 x gでウェルの底(5~10 s)に落ち着くように、振るバケツ遠心分離機で短時間。注:気泡は井戸に存在する可能性がありますが、反応に悪影響を及ぼすものではありません。 混合物をサーモサイクラーに入れ、 表5に従って実行します。 メーカーの指示に従ってプレートでシーケンシング反応を浄化します。 DNA分析装置を使用して、製造業者のプロトコルに従って配列を決定します。 得られた配列を患者の期待される順序と比較する。 7. ウェスタンブロッティング サンプル準備 SDSサンプルバッファー(4%SDS、4 M尿素、10%2-メルカプトエタノール、10%グリセロール、70 mM Tris-HCl pH 6.4、0.001%ブロモフェノールブルー、プロテアーゼ阻害剤)を調製します。 150 μL の SDS バッファーに、クライオセクショニングから採取した 10 μm の筋肉セクションの約 100 スライスを配置します。 便利なマイクロホモジナイザーを使用して、氷上のタンパク質サンプルを30s分の一に均質化します。 16,500 x g で15分間遠心分離機を、上清を新鮮なチューブに移します。-80°Cで分析または保存を進めます。 タンパク質濃度測定用のSDS-ページ注:蛍光ゲル染色剤を使用してタンパク質濃度を決定しました。 メーカーの指示に従って、BCAタンパク質アッセイキットを使用して、正常な健康な対照サンプルの重量と濃度を決定します。 ゲル電気泳動用サンプルを準備します。ピペット10μgの全タンパク質の健常対照および5μLの患者サンプル、5μLの4倍サンプルバッファー、10xサンプル還元剤の2μL。これらを混合したら、各サンプルの最終容積20μLに脱イオン水を加えます。 70°Cで10分間加熱します。 40x SDS実行バッファの50 mLを使用して、1x SDSランニングバッファの2,000 mLを準備します。1,950mLの脱イオン水で希釈します。注: この時点で、1,000 mL の実行バッファで十分です。残りの 1,000 mL バッファはステップ 7.3.1 で使用されます。 十分に混合し、ゲルボックスの下部(外側)バッファチャンバーで使用するために、1x SDSランニングバッファの800 mLを確保します。 電気泳動の直前に、ゲルボックスの上部(内側)バッファチャンバーで使用する1x SDSランニングバッファの200 mLに抗酸化バッファーの500 μLを追加します。 メーカーのプロトコルに従って3-8%トリ酢酸ゲルを設定してゲル電気泳動に備えます。各サンプルの20 μLをゲルに積み込みます。 150Vで75分間電気泳動を行います。 電気泳動後、50 mLの蛍光ゲル染色液を含むクリーントレイにゲルを直接入れ、 トレイを覆い、シェーカーの上に置き、液体をはねたったり、ゲルを90分間損傷したりせずに攪拌します。 エチジウム臭化エミズエミッションフィルターを使用して、蛍光システムで蛍光システムでイメージングする前にゲルを水に移し、蛍光を検出します。 既知の濃度で通常の制御法を用いて構築された分析曲線に基づいて患者のサンプルの濃度を測定する。 ウェスタンブロッティング用 SDS ページ ステップ7.2.4-7.2.6に従ってゲルボックスを準備します。 ステップ7.2.11で得られた濃度測定に基づいて、健康な対照lysateのレーンあたり100 μgおよび患者サンプルのレーン当たり300 μgをロードする。ステップ 7.2.7 と同じ設定を使用してエレクトロフォレス。 タンパク質の転写 転送バッファを準備します。PVDF膜を20sのメタノールに浸します。使用するまでブロッティングバッファBに移動します。 余分厚いブロッティングペーパーをブロッティングバッファー A、B、C に浸して、バッファーあたり少なくとも 30 分間浸します。 電気泳動後、ゲルをブロッティングバッファーBに5分間浸します。 図1の図面に従って、ブロッティングペーパー、PVDF膜、およびゲルを半乾燥転写機に配置する。ゲルと膜の間の気泡をローラーでロールアウトします。 RTで1時間2mA/cm2膜で移動する。2注:転写後、大きな分子量タンパク質の転写に成功したことを確認するために、ポンソー染色と同様の全タンパク質染色を行うことを推奨します。 ブロッキングと抗体染色 膜をPBST(1x PBS 0.1%Tween 20)で2回リンスします。 膜を1%ブロッキング剤に入れ、RTで1時間静かに揺れ、ブロックします。 ブロッキング溶液(1:125)および抗スペクトリン抗体(1:25,000)で、RTで1時間または4°Cで一晩、抗ジストロフィン抗体で膜をインキュベートします。 膜をRTでPBSTでそれぞれ10分間3回洗浄します。 PBST(1:100)で西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)コンジュゲート二次抗マウス/ウサギ抗体をRTで40分間インキュベートします。 膜をRTでPBSTで10分間再び3回洗浄します。 検出 1:1の比で検出溶液AとBを混合する。必要な検出試薬の最終容積は、0.1 mL/cm2 膜です。 洗浄された膜から余分なPBSTを取り除き、ラップまたは他の適切なきれいな表面のシート上にタンパク質側とそれを置きます。混合検出試薬を膜に加え、RTで5分間インキュベートします。 膜を鉗子にそっと保持し、組織に対してエッジに触れることで、過剰検出試薬を除去します。 ブロットプロテイン側をサンプルトレイの上に置きます。ユーザーマニュアルに従って蛍光システムを操作します。マシンを次のように設定します。露出タイプ:増分、間隔時間:10秒、感度/解像度:高。注: 測定された領域は、青い長方形で箱詰めされました (図 4a-b):BG: 背景;D:ジストロフィン427 kDa、SL:スペクトリンベータ長いアイソフォーム(274 kDa);SS:短いアイソフォーム(253 kDa)。ジストロフィン/スペクトリンシグナル比は(D-BG)/[SL-BG]+(SS-BG)として計算した。通常制御の比率を100%とした。