Caractérisation de l’efficacité de saut d’Exon dans les échantillons de patients de DMD dans les essais cliniques d’oligonucléotides d’Antisense
1Department of Molecular Therapy, National Institute of Neuroscience,National Center of Neurology and Psychiatry, 2Clinical Research Support Office, Translational Medical Center,National Center of Neurology and Psychiatry, 3Department of Child Neurology, National Center Hospital,National Center of Neurology and Psychiatry
Summary
Ici, nous présentons la caractérisation moléculaire de l’expression de dystrophine 38 utilisant le séquençage de Sanger, RT-PCR, et le blotting occidental dans l’essai clinique.
Abstract
La dystrophie musculaire de Duchenne (DMD) est une maladie musculaire dégénérative qui provoque une perte progressive de masse musculaire, conduisant à la mort prématurée. Les mutations provoquent souvent un cadre de lecture déformé et des codons d’arrêt prématurés, ayant pour résultat un manque presque total de protéine de dystrophine. Le cadre de lecture peut être corrigé à l’aide d’oligonucléotides antisens (AON) qui induisent l’exon sauter. Le morploino AON viltolarsen (nom de code: NS-065/NCNP-01) a été montré pour induire exon 53 sauter, la restauration du cadre de lecture pour les patients atteints de suppressions exon 52. Nous avons récemment administré ns-065/NCNP-01 par voie intraveineuse aux patients de DMD dans un essai exploratoire de investigateur-initié, premier-humain de NS-065/NCNP-01. Dans cet article de méthodes, nous présentons la caractérisation moléculaire de l’expression de dystrophine utilisant le séquençage de Sanger, RT-PCR, et le blotting occidental dans l’essai clinique. La caractérisation de l’expression de dystrophine était fondamentale dans l’étude pour montrer l’efficacité puisqu’aucun essai fonctionnel de résultat n’a été exécuté.
Introduction
La dystrophie musculaire de Duchenne (DMD) est une maladie musculaire dégénérative causant la perte progressive de masse musculaire, l’insuffisance respiratoire, et la cardiomyopathie, et il conduit à la mort prématurée1. La maladie est causée par un manque de la grande dystrophine de protéine structurelle de muscle2. Les mutations dans le gène DMD sur le chromosome X sont récessives, et la maladie affecte 1 dans 3500-5000 mâles nouveau-nés3,4,5. Les mutations sont souvent de grandes suppressions dans une région de hotspot entre les exons 44 et 55 qui conduisent à un cadre de lecture déformé et codons d’arrêt prématuré, causant la décomposition absurde-médiée et un manque presque total de protéine de dystrophine6,7,8. Le cadre de lecture peut être corrigé à l’aide d’oligonucléotides antisens (AON) qui induisent exon sauter et restaurer le cadre de lecture, en restaurant partiellement l’expression de la dystrophine et en retardant la progression de la maladie9,10,11. Le morplono AON eteplirsen, qui a été récemment approuvé par l’Agence fédérale des médicaments (FDA), induit sauter de l’exon 51 et peut restaurer le cadre de lecture chez les patients atteints d’exon 52 suppressions12,13. Cependant, exon 53 sauter restaure le cadre de lecture pour les patients avec exon 52 suppressions, et il peut potentiellement traiter environ 10% des patients atteints de DMD14. Le médicament morploino AON NS-065/NCNP-01 a été montré pour induire l’exon 53 sauter dans les cellules humaines, et nous avons récemment administré NS-065/NCNP-01 aux patients atteints de DMD dans le cadre d’un essai clinique de phase 1 à forte dose-escalade (ci-après, appelé « ‘étudi ») (enregistré sous le nom d’UMIN: 000010964 et ClinicalTrials.gov : NCT02081625)14. L’étude a montré une augmentation dose-dépendante de l’exon 53 sauter basé sur les niveaux de protéines de RT-PCR et de dystrophine basée sur le blotting occidental, et aucun événement indésirable grave ou abandon n’a été observé14.
Dans tous les essais cliniques, l’analyse des résultats est d’une importance capitale. Pour les essais cliniques de DMD, un débat est toujours en cours concernant la meilleure méthode pour montrer un avantage de traitement. Les tests cliniques tels que le test de marche de 6 minutes présentent certains inconvénients. La caractérisation moléculaire de l’expression de la dystrophine peut être effectuée à l’aide de plusieurs méthodes, telles que RT-PCR, qPCR, digital-PCR, western blotting, et immunohistochemistry. Cependant, l’étendue de la restauration d’expression de protéine qui est exigée pour donner un avantage clinique demeure peu claire. Dans cet article de méthodes, nous décrivons en détail les méthodes de lottage RT-PCR et occidentales utilisées pour déterminer les niveaux d’exon et de protéines, respectivement, dans l’essai de phase 1 du médicament À SAUT AON NS-065/NCNP-0114.
Protocol
La procédure opérationnelle de l’essai initié par l’enquêteur a été approuvée par le comité d’éthique du NCNP (id d’approbation : A2013-019). 1. Préparation d’échantillons musculaires REMARQUE : Les muscles de biceps brachii ou de quadriceps sont souvent choisis comme sites de biopsie. Cependant, le tibialis antérieur a été employé dans l’essai clinique. Biopsie musculaire des patients Marquez le site d’incision avant la préparation de la peau. Préparer de la gaze saline pour le spécimen de biopsie. Presser la gaze bien. Injecter l’anesthésie locale dans la peau et les tissus sous-cutanés, mais pas dans les muscles. Assurez-vous de la profondeur de l’anesthésie par l’absence de douleur cutanée.REMARQUE : L’anesthésie générale est généralement utilisée chez les patients pédiatriques de moins de 15 ans. Faire une incision de la peau au tissu sous-cutané. Utilisez de petits rétractateurs pour ouvrir l’incision et séparer la graisse sous-cutanée.REMARQUE : À cette étape, une partie de la peau peut être coupée pour la culture du fibroblaste. Faire une autre petite incision dans le fascia et couper le fascia plus loin. Pincez les bords à l’aide de forceps de moustiques pour exposer le muscle. Utilisez une suture pour tirer vers le haut la partie sélectionnée du muscle. Faire un petit tunnel à l’aide de ciseaux Iris et insérer des forceps de moustiques dans le tunnel. Séparez le faisceau musculaire à l’aide de forceps et coupez les deux extrémités de la partie cible.REMARQUE : Les échantillons de biopsie musculaire doivent être de la taille d’un crayon pour les patients adultes (longueur 1,0-1,5 cm, diamètre 0,8-1,0 cm). Le spécimen doit avoir une longueur d’environ 1 cm et 5 mm de diamètre chez les patients pédiatriques. Enveloppez le spécimen dans de la gaze saline et transportez immédiatement le muscle frais à température ambiante (RT) jusqu’à une installation où le spécimen peut être préparé pour une analyse plus approfondie.REMARQUE : Les spécimens doivent être transportés à 4 °C si la durée du transport dépasse 1 heure. 2. Préparation de l’échantillon musculaire Mélanger des volumes égaux de gomme tragacanthe et de l’eau jusqu’à ce que la gomme devienne molle et collante. Charger le mélange dans des seringues de 25 mL. Les seringues peuvent être conservées au réfrigérateur. Déposer environ 0,5 à 1 cm de gomme tragacanthe sur des disques de liège. Étiqueter les disques sur le côté opposé. Placer un contenant d’isopentane dans de l’azote liquide jusqu’à ce qu’une partie du liquide gèle. Placez le spécimen dans la gomme tragacanth. L’axe longitudinal de chaque muscle doit être perpendiculaire au liège. Placez la gomme autour du fond de chaque muscle pour aider à un bon placement. À l’aide de pinces à épiler, placez le spécimen de muscle/liège dans l’isopentane froid préparé à l’étape 2.3 pour geler. Déplacer le spécimen constamment pendant 1 min ou jusqu’à ce qu’il soit complètement congelé et le placer temporairement sur la glace sèche. Placez le spécimen dans des flacons en verre et rangez-le à -80 °C. 3. Section de muscle Mettre en place le cryostat pour la section avec une température de travail de -25 °C. Monter le bloc liège/muscle et couper jusqu’à ce que des sections plates soient atteintes. Utilisez une épaisseur de section de 10 μm pour le RT-PCR et le blotting occidental. Utiliser une épaisseur de 6-8 μm et 10-12 μm pour l’immunohistochimie ou l’hématoxyline et la coloration de l’éosine, respectivement. Mettre les sections tranchées dans des tubes de 2,0 mL et conserver à -80 °C pour rt-PCR et blotting occidental. 4. Extraction de l’ARN et réaction en chaîne de polymérase de transcription inverse (RT-PCR) Extraire environ 10 tranches d’épaisseur de 10 μm du muscle congelé par un cryostat. Recueillir l’ARN total purifié à l’aide du kit de purification de l’ARN total selon les instructions du fabricant. Mesurer la concentration d’ARN à l’aide d’un spectrophotomètre. Combinez les réactifs requis pour une réaction RT-PCR dans les tubes PCR selon le tableau 1. Voir tableau 2 pour les séquences d’amorce.NOTE : L’amorce avant était 44F pour le patient NS-03 et 46F pour le patient NS-07. L’amorce inverse était 54/55R par défaut. Si des produits non spécifiques étaient évidents, le 54R a été utilisé comme solution de rechange. Placer les tubes PCR contenant le mélange dans un thermocycler. Exécutez le thermocycler selon le tableau 3. Stockez le produit PCR à 4 °C pour le stockage à court terme ou à -20 °C pour le stockage à long terme. 5. Électrophorèse de micropuce et calcul de saut d’exon REMARQUE : Un système d’électrophorèse micropuce (MCE) est souvent choisi pour analyser l’efficacité du saut exon. Dans ce protocole, nous décrivons les étapes nécessaires pour analyser l’efficacité de saut exon à l’aide d’un système MCE par le fabricant A ainsi que du fabricant B, ci-après appelé système A et B. Pendant l’essai clinique, l’efficacité de saut d’exon a été analysée sur le système A. Cependant, le système A n’est plus à vendre, et nous recommandons le système B pour analyser l’efficacité de saut exon. Nous avons inclus des protocoles pour les deux systèmes (voir la section 5.1 pour le système A et 5.2 pour le système B). Voir Tableau des matériaux pour obtenir de l’information sur les systèmes A et B. En outre, cette étape peut également être effectuée avec l’électrophorèse normale de gel d’agarose, mais la sensibilité diminue nettement. Électrophorèse micropuce utilisant le système AREMARQUE : Le système A a deux types de puces. Ici, nous décrivons les étapes de la puce d’ADN. Réactifs du kit d’équilibre (tampon de tache, tampon de chargement, échelle et tampon de gel) à RT, vortex, et spin vers le bas. Pour préparer le tampon gel-tache (GS), ajoutez 12,5 μL de tampon de tache à 250 μL de tampon de gel et vortex pour 10 s. Déplacez la solution vers un tube de filtre à spin et une centrifugeuse à 2 400 x g pendant 15 min. Jetez le filtre.REMARQUE : Le GS filtré peut être stocké à 4 °C pendant 1 mois. Si les échantillons sont fortement concentrés, diluer à environ 50 ng/μL avec tampon TE ou eau exempte de DNase.REMARQUE : Si les échantillons sont dans une concentration de sel ≥ 200 mM KCl (ou NaCl) et/ou 15 mM MgCl2, échangez le tampon. Ajoutez 12 μL de solution GS au puits d’amorçage du gel (GS mis en évidence et étiqueté) de la puce d’ADN et placez la puce dans la station d’amorçage.REMARQUE : Pour éviter les bulles d’air, insérez la pointe de la pipette verticalement et au fond du puits lors de la distribution. Distribuez lentement au premier arrêt sur la pipette et n’expulsez pas l’air à l’extrémité de l’étape de tuyauterie. Sélectionnez le mode C3 et appuyez sur le bouton Démarrer. Une fois l’amorçage terminé, retirez la puce. Inspectez visuellement les microcanaux pour les bulles d’air emprisonnées ou l’amorçage incomplet. Chargez les échantillons préparés et l’échelle sur la puce comme ci-dessous. Pipette 9 μL de solution GS dans les 3 autres puits GS. Pipette 5 μL de tampon de chargement dans le puits L et chaque échantillon bien (1-11). Pipette 1 μL d’échelle dans le puits L. Pipette 1 μL d’échantillon d’ADN dans chacun des 11 puits d’échantillon. Pipette 1 μL d’eau exempte d’E.P. ou dnase dans les puits inutilisés. Le guide rapide du kit montre une figure de la disposition des puces.REMARQUE : Inspectez tous les puits pour les bulles d’air en maintenant la puce au-dessus d’un fond légèrement coloré. Déloger les bulles d’air emprisonnées au fond d’un puits à l’aide d’une pointe de pipette propre ou en enlevant et en rechargeant la solution. Placez la puce dans la station vortex et appuyez sur Mix. La station vortex s’arrête automatiquement après 1 min. Exécutez la puce dans la station d’électrophorèse dans les 5 min suivant le chargement. Sélectionnez Nouvelle exécution dans la barre d’outils logiciel. Sur l’écran New Run, sélectionnez L’ADN et l’ADN 1K dans la liste de retrait d’Essai. Sélectionnez un dossier de projet pour l’exécution de la liste de retrait du projet ou créez un nouveau dossier de projet en entrant un nom dans le champ Projet. Entrez un nom pour l’exécution dans le champ Exécuter le préfixe, puis cliquez sur Démarrer l’exécution. L’instrument bipe lorsque l’analyse est terminée et qu’une fenêtre s’ouvre indiquant la fin de la course. Sélectionnez OK et retirez la puce de la plate-forme de puce. Sélectionner le fichier | Exporter des données pour exporter les données. Sélectionnez les options souhaitées dans le dialogue Exporter. Pour nettoyer les électrodes, remplissez une puce de nettoyage de 800 μL d’eau déionisée et placez-la sur la plate-forme de copeaux, fermez le couvercle et laissez-la fermée pendant 1 min. Après 1 min, ouvrir le couvercle, retirer la puce de nettoyage et laisser sécher les électrodes pendant 1 min. Électrophorèse micropuce utilisant le système B Ouvrez le logiciel d’exploitation et entrez l’exemple d’informations. Après avoir saisi les informations, le logiciel calcule automatiquement la quantité de solutions tampon et marqueur de séparation. Préparer la quantité nécessaire de tampon de séparation calculée par le logiciel. Tout d’abord, préparez la solution de tache de gel acide nucléique 100x en diluant la solution 10 000x avec la quantité appropriée de tampon TE. La solution 100x peut être stockée à -20 °C. Mélanger une quantité appropriée de 100x nucléique gel acide tache avec tampon de séparation dans le tube spécifique fourni par la société pour préparer une solution 1x. Vortex la solution. Préparer la quantité requise de solution de marqueur dans le tube. Démarrez le programme de lavage de sonde. Démarrez le programme de lavage des micropuces une fois terminé. Simultanément, pipette les échantillons à une multiplaque PCR (96 puits, clair) et diluer 4 fois avec de l’eau déionisée. Le volume minimum que la machine peut gérer est de 6 μL, et le maximum est de 30 μL. Nous suggérons un volume total de 10 μL (2,5 μL d’échantillon et 7,5 μL d’eau/TE-buffer). Couvrir les plaques de feuilles de papier d’étanchéité pcr adhésif et faire tourner les échantillons. Réglez la plaque, la solution de marqueur et le tampon de séparation 1x dans la machine en fonction du placement indiqué par la machine. Appuyez sur le bouton Démarrer. Lorsque l’exécution est terminée, exportez les données de résultat sous forme de fichier .csv à partir du logiciel et calculez l’efficacité du saut exon à l’aide de la concentration molaire comme suit :Exon sautant l’efficacité (%) = (bande sautée / (bande sautée + bande non sautée) X 100 6. Séquençage complémentaire de l’ADN (ADD) Préparation de gel d’Agarose Mesurer 1,5 g de poudre d’agarose et mélanger la poudre avec 100 ml de tampon TAE 1x dans une fiole microwavable (résultant en un gel agarose de 1,5 %). Cuire au micro-ondes de 1 à 3 min jusqu’à ce que l’agarose soit complètement dissoute.REMARQUE : Ne pas surevoir la solution, car une partie du tampon s’évapore et modifie le pourcentage final d’agarose du gel. Laisser refroidir la solution agarose à environ 50 °C. Ajouter 10 μL 10 000 x colorant acide nucléique fluorescent à la solution agarose. Verser l’agarose dans un plateau de gel avec le peigne bien en place. Laisser à RT pendant 20-30 min jusqu’à ce qu’il ait complètement solidifié. Séquençage Mélanger 5 μL de produit RT-PCR (à partir de l’étape 4.4) et 1 μL de tampon de chargement 6x. Chargez-les dans les puits du gel agarose à 1,5 %. Faire couler le gel à 135 V pendant 5 min et 120 V pendant 20 min. Visualisez les bandes à l’aide d’un transilluminateur selon le protocole du fabricant. Bandes d’accise d’intérêt du gel et utiliser un gel et kit de nettoyage PCR pour récupérer les produits RT-PCR. Mesurer la concentration à l’aide d’un spectrophotomètre.REMARQUE : La bande purifiée peut être envoyée pour le séquençage dans une entreprise ou une installation de séquençage si aucun équipement de séquençage Sanger n’est disponible à l’interne. Préparer les réactifs requis pour un kit de séquençage du cycle et une pipette dans une plaque PCR multiplaque selon le tableau 4. Voir tableau 2 pour les séquences d’amorce. Sceller la plaque avec un film adhésif transparent. Vortex de la plaque pendant 2 à 3 s. Centrifugeuse brièvement dans une centrifugeuse de seau balançante de sorte que le contenu se dépose au fond des puits (5 à 10 s) à 1.000 x g.REMARQUE : Des bulles d’air peuvent être présentes dans les puits, mais elles n’affectent pas négativement la réaction. Placer le mélange dans un thermocycler et courir selon le tableau 5. Purifier les réactions de séquençage avec des plaques selon les instructions du fabricant. Utilisez un analyseur d’ADN pour déterminer les séquences selon le protocole du fabricant. Comparez la séquence obtenue à la séquence attendue du patient. 7. Ballonnement occidental Préparation de l’échantillon Préparer un tampon d’échantillon SDS (4 % de SDS, 4 M d’urée, 10 % 2 mercaptoéthanol, 10 % de glycérol, 70 mM Tris-HCl pH 6,4, 0,001 % bleu bromophénol et inhibiteur de la protéase). Placer environ 100 tranches des 10 sections musculaires de μm recueillies à partir de cryo-sectionnement dans 150 μL de tampon SDS. Homogénéiser brièvement les échantillons de protéines sur la glace pendant 30 s à l’aide d’un micro homogénéisant pratique. Centrifugeuse à 16 500 x g pendant 15 min et transfert du supernatant dans un tube frais. Procéder à l’analyse ou au stockage à -80 °C. SDS-PAGE pour la mesure de la concentration de protéinesREMARQUE : Une tache fluorescente de gel a été employée pour déterminer la concentration de protéine. Déterminer le poids normal de l’échantillon de contrôle sain et la concentration à l’aide du kit d’analyse des protéines BCA selon les instructions du fabricant. Préparer les échantillons pour l’électrophorèse de gel. Pipette 10 μg de protéine totale du contrôle sain et 5 μL des échantillons du patient, 5 μL de tampon d’échantillon 4x, 2 μL d’agent réducteur d’échantillon de 10x. Une fois que celles-ci ont été mélangées, ajoutez de l’eau déionisée à un volume final de 20 μL dans chaque échantillon. Chauffer les échantillons à 70 °C pendant 10 min. Préparez 2 000 mL de tampon sds 1x en cours d’exécution à l’aide de 50 mL de tampon sds en cours d’exécution 40x. Diluer avec 1 950 mL d’eau déionisée.REMARQUE : À ce stade, 1 000 mL de tampon en cours d’exécution suffisent. La mémoire tampon restante de 1 000 mL est utilisée à l’étape 7.3.1. Bien mélanger et réserver 800 mL de la mémoire tampon 1x SDS en cours d’exécution pour une utilisation dans la chambre tampon inférieure (externe) de la boîte de gel. Immédiatement avant l’électrophorèse, ajoutez 500 μL de tampon antioxydant à 200 mL de tampon de fonctionnement SDS 1x à utiliser dans la chambre tampon supérieure (intérieure) de la boîte de gel. Préparez-vous à l’électrophorèse de gel en mettant en place un gel de Tris-acétate de 3-8% selon le protocole du fabricant. Chargez 20 μL de chaque échantillon sur le gel. Effectuer l’électrophorèse à 150 V pendant 75 min. Après l’électrophorèse, placez le gel directement dans un plateau propre contenant 50 mL de solution de tache de gel fluorescent. Couvrir le plateau, placer sur un shaker, et agiter sans éclabousser le liquide ou endommager le gel pendant 90 min. Transférer le gel dans l’eau avant l’imagerie dans un système de fluorescence à 312 nm d’éclairage avec filtre d’émission de bromure d’éthidium pour détecter la fluorescence. Mesurer les concentrations des échantillons de patients en fonction d’une courbe analytique construite à l’aide du lysate de contrôle normal avec une concentration connue. SDS-PAGE pour le blotting occidental Préparer la boîte de gel selon les étapes 7.2.4-7.2.6. D’après la mesure de la concentration obtenue à l’étape 7.2.11, chargez 100 μg par voie de lysate de contrôle sain et 300 μg par voie de l’échantillon patient. Électrophorèse utilisant les mêmes réglages que l’étape 7.2.7. Transfert de protéines Préparez la mémoire tampon de transfert. Faire tremper une membrane PVDF pendant 20 s dans du méthanol. Déplacez-le vers la mémoire tampon B jusqu’à l’utilisation. Tremper un papier blotting extra-épais dans le tampon A, B et C pendant au moins 30 min par tampon. Après l’électrophorèse, faire tremper le gel dans le tampon B pendant 5 min. Placez les papiers, la membrane PVDF et le gel sur la machine de transfert semi-sèche selon le dessin de la figure 1. Déployer des bulles d’air entre le gel et la membrane à l’aide d’un rouleau. Transférer à 2 mA/cm2 membrane pendant 1 h à RT.REMARQUE : Après transfert, il est recommandé d’effectuer une tache de protéine totale semblable à la coloration de Ponceau pour confirmer le transfert réussi des grandes protéines de poids moléculaire. Blocage et coloration des anticorps Rincer la membrane deux fois avec pbst (1x PBS avec 0,1% Tween 20). Placez la membrane dans un agent de blocage de 1% et faites cuire doucement pendant 1 h à RT pour bloquer. Incuber la membrane avec un anticorps anti-dystrophine dans la solution de blocage (1:125) et l’anticorps anti-spectrotrine (1:25,000) pendant 1 h à RT ou la nuit à 4 °C. Laver la membrane trois fois pendant 10 min chacun avec PBST à RT. Incuber la membrane avec de la peroxydase de raifort (HRP)-conjuguée anticorps secondaires anti-souris/lapin dans PBST (1:100) pendant 40 min à RT. Laver la membrane à nouveau trois fois pendant 10 min avec PBST à RT. Détection Mélanger les solutions de détection A et B dans un rapport de 1:1. Le volume final de réactif de détection requis est de 0,1 mL/cm2 membrane. Retirez l’excédent de PBST de la membrane lavée et placez-le avec le côté protéique sur une feuille de pellicule plastique ou d’autres surfaces propres appropriées. Ajouter le réactif de détection mixte sur la membrane et incuber pendant 5 minutes à RT. Retirez l’excès de réactif de détection en maintenant la membrane doucement dans les forceps et en touchant le bord contre un tissu. Placez le côté protéine tache vers le haut sur un plateau d’échantillon. Actionnez le système fluorescent selon la documentation de l’utilisateur. Réglez la machine comme suit. Type d’exposition : Incrément, Durée d’intervalle : 10 s, Sensibilité/Résolution : élevé.REMARQUE : Les zones mesurées ont été recouvertes d’un rectangle bleu (Figure 4a-b): BG : arrière-plan; D: dystrophine 427 kDa, SL: spectronque bêta isoforme longue (274 kDa); SS: isoforme courte (253 kDa). Le rapport de signal de dystrophine/spectrorine a été calculé comme (D-BG)/[(SL-BG) + (SS-BG)]. Le rapport de contrôle normal a été fixé comme 100%.
Representative Results
Pour utiliser RT-PCR pour détecter le saut exon, les amorces de chaque côté de l’exon qui seront ignorés ont été conçues et évaluées pour ne produire que des bandes spécifiques (voir la figure 2 pour un diagramme schématique de l’exon sauter et de la position d’amorce). Les amorces devraient générer des produits qui peuvent facilement être distingués par la taille sur un système MCE ou l’électrophorèse normale de gel d’agarose si MCE n’est pas disponible. La figure 3a montredes images de gel du système MCE A des réactions de RT-PCR et des résultats de séquençage de la bande sautée des patients NS-03 et NS-07 avant et après le traitement avec NS-065/NCNP-01 dans l’essai de phase 1 dose-escalade. NS-03 et NS-07 port suppressions qui couvrent exons 45-52 et 48-52, respectivement. NS-03 a reçu 5 mg/kg et NS-07 20 mg/kg de NS-065/NCNP-01 par semaine pendant 12 semaines. Comme prévu avant le traitement, les deux patients n’ont montré aucun saut, et seulement une bande non-sautée a pu être visualisée. Après 12 semaines de traitement, une bande inférieure claire sautée a été visualisée pour NS-07. Cependant, il était encore difficile de détecter n’importe quel produit sauté pour le patient NS-03. Les résultats du séquençage ont montré une concaténation des exons 47 et 54 pour NS-07, ainsi que des exons 44 et 54 pour NS-03. Selon la séquence, ceux-ci pourraient théoriquement produire un isoforme fonctionnel mais raccourci de dystrophine. Pour calculer le pourcentage de saut indiqué à la figure 3b, la concentration molaire de la bande sautée a été divisée par la bande sautée et non sautée. Pour le patient NS-07, le pourcentage après traitement était de 72%, et il était de 3,4% pour NS-03. Les données occidentales de tache (en triple licence) des patients NS-03, NS-07, et un contrôle sain sont indiquées dans la figure 4a. On s’attendait à ce qu’aucune bande de dystrophine n’ait été détectée avant traitement. Après traitement une bande du patient NS-07 a été détectée avec un poids moléculaire inférieur comparé au contrôle sain (la dystrophine de type sauvage a un poids moléculaire de 427 kDa, et la dystrophine de NS-07 a un poids moléculaire de 389 kDa). En raison de la suppression d’exon et du saut, l’isoforme de dystrophine du patient NS-07 a manqué plusieurs exons, et on s’attendait à ce qu’il ait un poids moléculaire inférieur. Le patient NS-03 n’a montré aucun niveaux détectables de dystrophine après traitement. Dans la figure 4b, la quantité de dystrophine comparée à un contrôle sain pour le patient NS-07 est montrée. L’emplacement où les intensités de signal ont été mesurées pour le calcul de la restauration de dystrophine sont indiqués avec des carrés bleus. Le rapport de spectron de dystrophine a été employé pour calculer la quantité de dystrophine comparée à celle du contrôle sain. À cette fin, le signal de la dystrophine moins fond a été divisé par la somme des deux isoformes de spectron (long et court) moins arrière-plan (voir étape 8.6.5). Le ratio pour un contrôle sain a été fixé à 100%. La quantité de dystrophine comparée au contrôle sain dans le patient NS-07 après traitement était 9.1%. Cependant, le pourcentage n’a pas pu être calculé pour le patient NS-03 en raison d’une bande de dystrophine faible, qui semblable à ceux obtenus pour des échantillons de traitement antérieurs pour les deux patients. Figure 1 : Diagramme schématique de la pile de transfert pour l’analyse des taches occidentales. Assemblage de la pile de transfert de taches occidentales avec du papier blotting trempé dans le tampon A blotting dans le fond suivi par le papier blotting trempé dans le tampon B, membrane PVDF, le gel de Tris-Acetate 3-8% et sur le dessus 2 papiers blotting trempés dans le tampon de blotting C est montré. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre. Figure 2 : Dessin schématique de saut d’exon de l’exon 53 dans un patient avec la suppression d’exon 45-52 dans le gène DMD. Par exemple, le patient NS-03 dans l’essai clinique dose-escalade a eu cette suppression. Si l’exon 53 est conservé, l’ARNm sera hors cadre puisque la jonction exon-exon entre l’exon 44 et 53 perturbe le cadre de lecture, provoquant un codon d’arrêt dans l’exon 53. Le cadre de lecture est restauré lorsque l’exon 53 est ignoré, et un isoforme plus court de la dystrophine est produit. Pour détecter l’exon 53-saut par RT-PCR, les amorces dans exon 44 et 54 sont utilisées de sorte que le produit PCR entre sauté et non-sauté ARNm peut facilement être détecté. FWD: amorce avant, REV: amorce inversée, PMO: phosphorodiamidate morpholino oligomer. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre. Figure 3 : Ignorer l’efficacité pour les patients NS-03 et NS-07 à partir d’échantillons de biopsie musculaire antérieure tibialis. a) Image de gel générée par le système d’électrophorèse A d’échantillons RT-PCR d’échantillons non traités et traités des patients NS-03 et NS-07. Le panneau supérieur montre NS-03 et le panneau inférieur NS-07 en triple. Pour NS-03, la bande non sautée est de 422 pb, et la bande sautée est de 212 pb. Pour NS-07, les bandes sont respectivement de 836 pb et de 624 pb. L’analyse de séquence a montré une concaténation de l’exon 44 et de l’exon 54 pour NS-03 et de l’exon 47 à l’exon 54 pour NS-07. b) L’efficacité de saut avant et après le traitement est montrée pour les patients NS-03 et NS-07, calculée à partir de la concentration molaire des deux bandes fournies par le système A en tant que bande sautée/(bande sautée + bande non sautée) x 100. L’efficacité de saut pour NS-03 était très faible après le traitement; pour NS-07, l’efficacité de saut était de plus de 70%. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre. Figure 4 : Quantification protéique des isoformes de dystrophine avant et après la thérapie de saut d’exon. a) Quantification protéique des isoformes de dystrophine avant et après la thérapie de saut d’exon. Tache occidentale de biopsie de muscle du tibialis antérieur des patients NS-03 et NS-07 avant et après traitement et de contrôle sain dans le triplement. La dystrophine peut être vue à 427 kDa pour le contrôle sain et à 389 kDa pour NS-07 après traitement. Aucune dystrophine n’a pu être détectée pour l’un ou l’autre patient avant le traitement, ou aucun n’a pu être détecté après traitement pour le patient NS-03. La zone de la boîte noire est indiquée à la figure 4b. À gauche dans chaque tache, le marqueur est affiché. b) La quantité de dystrophine rétablie après traitement pour le patient NS-07. La restauration de la dystrophine a été calculée en fonction de l’intensité des bandes pour la dystrophine, l’arrière-plan, et l’isoforme longue et courte de la spectrorine selon la formule : (dystrophine – arrière-plan)/(spectrin L -arrière-plan) + (spectron S – fond) où le rapport pour un contrôle sain est fixé à 100%. L’intensité de chaque bande a été mesurée à l’intérieur des boîtes bleues indiquées dans la figure. La restauration de dystrophine pour NS-07 était 9.1% après traitement. Le signal de dystrophine était trop faible pour mesurer dans les échantillons non traités. Les tailles de marqueur sont indiquées dans les kilodaltons. Dys: Dystrophine, BG: fond, SL: Spectrin isoforme longue, SS: Spectrin isoforme courte, My: Myosin type 1. Les tailles de marqueur sont indiquées dans les kilodaltons. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre. Solution Volume/Réaction (μl) Concentration finale Eau sans RNase (fournie) Variable – 5x Tampon QIAGEN OneStep RT-PCR 5.0 1x mix dNTP (contenant 10 mM de chaque dNTP) 1.0 400 μM de chaque dNTP Amorce avant (10 μM) 1.5 0,6 μM Amorce inversée (10 μM) 1.5 0,6 μM QIAGEN OneStep RT-PCR Enzyme Mix 1.0 – Inhibiteur de RNase (facultatif) Variable 5–10 unités/réaction ARN de modèle 50 ng Total 25 Tableau 1 : réactifs RT-PCR. Les composés nécessaires pour une réaction de la RT-PCR. Amorce Séquence 44F 5′-CCTGAGAATTGGGAACATGC-3′ 46F 5′-AACCTGGAAAGAGAGCACAA-3′ 48F 5′-CCAAGAAGGACCATTTTGGACG-3′ 54/55R 5′-TCTCGCCTACTCACCTTTTTT-3′ 54R 5′-GTGGACTTTTUGGTATCAT-3′ Tableau 2 : Liste d’amorces. Séquences pour les amorces utilisées dans cette étude. F: Avant, R: Revers. 1 cycle Transcription inversée 30 min 50 °C 1 cycle Étape initiale d’activation du PCR 15 min 95 °C 35 cycles Dénaturation 1 min 94 °C Recuit 1 min 60 °C Extension 1 min 72 °C 1 cycle Prolongation finale 7 min 72 °C Tenir ∞ 4 °C Tableau 3 : PCR conditionné utilisé. Afficher les conditions PCR pour la réaction RT-PCR. Solution Volume/Réaction (μl) Eau sans RNase Variable BigDye Terminator 3.1 Ready Reaction Mix 3.5 Amorce avant/amorce inversée (3,2 μM) 2.0 ARN de modèle 20 ng Total 20 Tableau 4 : Réactifs nécessaires à la réaction de séquençage. Utilisez l’amorce vers l’avant ou l’inversion dans la configuration, pas les deux en même temps. 1 cycle 1 min 96 °C 25 cycles 10 s 96 °C 5 s 50 °C 4 min 60 °C Tenir ∞ 4 °C Tableau 5 : Conditions pcr pour le séquençage sanger.
Discussion
Les essais cliniques de DMD ont produit à la fois des succès et des échecs au cours des dernières années. Le RT-PCR et le blotting occidental sont des techniques communes pour évaluer l’efficacité de saut générée par les composés exon-saut administrés aux patients. Cependant, RT-PCR a été signalé à surestimer l’efficacité de saut par rapport à PCR numérique15. Bien que cela soit dû à un certain nombre de raisons, il est principalement causé par l’amplification plus efficace des petits fragments sautés pendant les cycles PCR. Il semble que RT-PCR utilisé dans cet essai clinique a également généré des gains d’efficacité plus élevés sauter par rapport à l’expression de protéine estimée par l’ouest blotting. Selon la FDA, il s’agit d’un moyen plus fiable de quantifier la restauration de la dystrophine12. Par conséquent, il faut faire preuve de prudence lors de l’interprétation des résultats de saut RT-PCR; toutefois, les échantillons peuvent encore être comparés. Les échantillons montrant des gains d’efficacité plus élevés en sautant basés sur les résultats de RT-PCR exhbitent généralement des niveaux plus élevés d’expression de protéine dans les analyses occidentales de tache.
Puisque tous les patients dans les essais cliniques de DMD n’ont pas le même modèle de suppression, il peut être difficile de concevoir des amorces et des sondes qui sont adéquatement spécifiques pour exécuter numérique ou qPCR sur tous les échantillons. Par conséquent, RT-PCR est toujours une bonne alternative pour une première évaluation de l’efficacité de saut. Avant le début de l’essai clinique de NS-065/NCNP-01, il était fastidieux d’évaluer l’efficacité du saut pour chaque patient in vitro puisqu’une biopsie musculaire ou cutanée était obligatoire pour générer des myoblastes spécifiques au patient. Cependant, nous avons récemment publié une nouvelle technique pour générer des cellules spécifiques à l’urine (UDC) converties par le patient myod1 comme nouveau modèle de cellules musculaires DMD16. Ainsi, seule l’urine recueillie auprès du patient est nécessaire pour générer les myoblastes, et aucune procédure invasive n’est nécessaire. Nous croyons que cette méthode peut être utilisée pour dépister différents AON dans les cellules spécifiques au patient. En outre, différentes amorces et sondes peuvent être testées avant que le patient commence n’importe quel essai clinique. Cela peut faciliter l’utilisation de qPCR ou PCR numérique pour la mesure exon sauter dans les essais cliniques DMD à l’avenir.
Pour effectuer l’analyse occidentale de tache dans cet essai clinique, un anticorps simple contre la dystrophine a été employé, et un seul contrôle sain a été employé comme échantillon de référence. Par conséquent, la spécificité de l’anticorps n’a pas été validée de manière appropriée. Ceci, avec le fait que l’anticorps ne reconnaît que le domaine C-terminal de la dystrophine, est une limitation du protocole. Des contrôles et des anticorps plus sains dirigés contre différents domaines de la molécule de dystrophine sont conseillés à l’avenir.
Ici, nous avons résumé les protocoles qui ont été utilisés dans le récent essai exploratoire initié par l’enquêteur et le premier essai humain de NS-065/NCNP-01. NS-065/NCNP-01 est potentiellement applicable à 10,1% des patients atteints de DMD.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous sommes reconnaissants au Dr Takashi Saito, au Dr Tetsuya Nagata, à M. Satoshi Masuda et au Dr Eri Takeshita pour discussion scientifique.
Materials
| 100 bp DNA Ladder | Takara | 3407A | marker solution for MultiNA |
| 1mol/l-Tris-HCl Buffer Solution(pH 7.6) | Nacalai | 35436-01 | |
| 2-mercaptoethanol | Nacalai | 21418-42 | |
| 2-Methylbutane (Isopentane) | Sigma-Aldrich | 15-2220 | |
| 5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube | Falcon | 352235 | |
| 6× Loading Buffer | Takara | 9156 | |
| Agarose ME | Iwai chemical | 50013R | |
| Applied Biosystems 3730 DNA Analyzer | Applied Biosystems | A41046 | |
| BD Matrigel Matrix | BD Biosciences | 356234 | |
| BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit | Applied Biosystems | 4337455 | |
| Bovine Serum Albumin solution | Sigma-Aldrich | A8412 | |
| Bromophenol blue | Nacalai | 05808-61 | |
| Centri-Sep 96-Well Plates | Applied Biosystems | 4367819 | |
| cOmplete Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 4693116001 | |
| DMEM/F-12 | Gibco | 11320033 | |
| ECL Prime Blocking Reagent | GE healthcare | RPN418 | |
| ECL Prime Western Blotting Detection Reagent | GE healthcare | RPN2232 | |
| Endo-Porter | GeneTools | 2922498000 | |
| Experion Automated Electrophoresis Station | Bio-Rad | 7007010 | Microchip electrophoresis system A |
| Experion DNA 1K Analysis Kit for 10 Chips | Bio-Rad | 7007107JA | |
| Experion Priming Station | Bio-Rad | 7007030 | |
| Experion Vortex Station II | Bio-Rad | 7007043 | |
| Extra Thick Blot Filter Paper | Bio-Rad | 1703965 | |
| EzBlot | Atto | AE-1460 | |
| GelRed Nucleic Acid Gel Stain | Biotium | 41003 | |
| glass vial | Iwaki | 1880 SV20 | |
| Glycerol | Nacalai | 17045-65 | |
| Histofine Simple Stain MAX PO | Nichirei | 424151 | |
| Horse Serum | Gibco | 16050122 | |
| Immobilon-P Transfer Membrane | Millipore | IPVH304F0 | |
| ITS Liquid Media Supplement | Sigma-Aldrich | I3146 | |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 34860 | |
| MicroAmp Clear Adhesive Film | Applied Biosystems | 4306311 | |
| MultiNA | SHIMADZU | MCE-202 | Microchip electrophoresis system B |
| Multiplate 96-Well PCR Plates | Bio-Rad | mlp9601 | |
| NanoDrop One Microvolume UV-Vis Spectrophotometer with Wi-Fi | Thermo Scientific | ND-ONE-W | |
| NovocastraTM Lyophilized Mouse Monoclonal Antibody Dystrophin (C-terminus) | Leica biosystems | NCL-DYS2 | |
| NovocastraTM Lyophilized Mouse Monoclonal Antibody Spectrin | Leica biosystems | NCL-SPEC1 | |
| NuPAGE 3-8% Tris-Acetate Protein Gels | Invitrogen | EA03785BOX | |
| NuPAGE Antioxidant | Invitrogen | NP0005 | |
| NuPAGE LDS Sample Buffer | Invitrogen | NP0007 | |
| NuPAGE Sample Reducing Agent | Invitrogen | NP0009 | |
| NuPAGE Tris-Acetate SDS Running Buffer | Invitrogen | LA0041 | |
| Oriole Fluorescent Gel Stain | Bio-Rad | 1610496 | |
| PBS | Gibco | 10010023 | |
| Penicillin-Streptomycin Solution Stabilized | Sigma-Aldrich | P4458 | |
| Physcotron Handy micro-homogenizer | MICROTEC | NS-310E3 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23227 | |
| Polybrene Infection / Transfection Reagent | Sigma-Aldrich | TR-1003 | |
| Propidium Iodide Staining Solution | BD Pharmingen | 556463 | |
| QIAGEN OneStep RT-PCR Kit | Qiagen | 210212 | |
| RNeasy Fibrous Tissue Mini Kit | Qiagen | 74704 | |
| SDS | Nacalai | 31606-75 | |
| Semi-dry transfer machine | Bio Craft | 41-1293 | |
| SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain | Invitrogen | S11494 | for MultiNA |
| TAE Buffer | Nacalai | 35430-61 | |
| Tragacanth Gum | Wako | 200-02245 | |
| Tris-EDTA Buffer | Nippon Gene | 316-90025 | for MultiNA |
| Trypsin-EDTA (0.05%) | Gibco | 25300054 | |
| TWEEN 20 | Sigma-Aldrich | P9416 | |
| Urea | Nacalai | 35907-15 | |
| Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System | Promega | A9281 | |
| XCell SureLock Mini-Cell | Invitrogen | EI0001 |
References
- Bushby, K., et al. Diagnosis and management of Duchenne muscular dystrophy, part 2: implementation of multidisciplinary care. Lancet Neurology. 9 (2), 177-189 (2010).
- Hoffman, E. P., Brown, R. H., Kunkel, L. M. Dystrophin: the protein product of the Duchenne muscular dystrophy locus. Cell. 51 (6), 919-928 (1987).
- Mendell, J. R., et al. Evidence-based path to newborn screening for Duchenne muscular dystrophy. Annals of Neurology. 71 (3), 304-313 (2012).
- Moat, S. J., Bradley, D. M., Salmon, R., Clarke, A., Hartley, L. Newborn bloodspot screening for Duchenne muscular dystrophy: 21 years experience in Wales (UK). European Journal of Human Genetics. 21 (10), 1049-1053 (2013).
- Greenberg, C. R., et al. Gene studies in newborn males with Duchenne muscular dystrophy detected by neonatal screening. Lancet. 2 (8608), 425-427 (1988).
- Forrest, S. M., et al. Further studies of gene deletions that cause Duchenne and Becker muscular dystrophies. Genomics. 2 (2), 109-114 (1988).
- Monaco, A. P., Bertelson, C. J., Liechti-Gallati, S., Moser, H., Kunkel, L. M. An explanation for the phenotypic differences between patients bearing partial deletions of the DMD locus. Genomics. 2 (1), 90-95 (1988).
- Flanigan, K. M., et al. Mutational spectrum of DMD mutations in dystrophinopathy patients: application of modern diagnostic techniques to a large cohort. Human Mutation. 30 (12), 1657-1666 (2009).
- Aoki, Y., et al. In-frame dystrophin following exon 51-skipping improves muscle pathology and function in the exon 52-deficient mdx mouse. Molecular Therapy. 18 (11), 1995-2005 (2010).
- Lu, Q. L., et al. Functional amounts of dystrophin produced by skipping the mutated exon in the mdx dystrophic mouse. Nature Medicine. 9 (8), 1009-1014 (2003).
- Yokota, T., et al. Efficacy of systemic morpholino exon-skipping in Duchenne dystrophy dogs. Annals of Neurology. 65 (6), 667-676 (2009).
- Kesselheim, A. S., Avorn, J. Approving a Problematic Muscular Dystrophy Drug: Implications for FDA Policy. Journal of the American Medical Association. 316 (22), 2357-2358 (2016).
- Mendell, J. R., et al. Eteplirsen for the treatment of Duchenne muscular dystrophy. Annals of Neurology. 74 (5), 637-647 (2013).
- Komaki, H., et al. Systemic administration of the antisense oligonucleotide NS-065/NCNP-01 for skipping of exon 53 in patients with Duchenne muscular dystrophy. Science Translational Medicine. 10 (437), (2018).
- Verheul, R. C., van Deutekom, J. C., Datson, N. A. Digital Droplet PCR for the Absolute Quantification of Exon Skipping Induced by Antisense Oligonucleotides in (Pre-)Clinical Development for Duchenne Muscular Dystrophy. PLoS One. 11 (9), e0162467 (2016).
- Takizawa, H., et al. Modelling Duchenne muscular dystrophy in MYOD1-converted urine-derived cells treated with 3-deazaneplanocin A hydrochloride. Scientific Reports. 9 (1), 3807 (2019).
Cite This Article
Nordin, J. Z., Mizobe, Y., Nakamura, H., Komaki, H., Takeda, S., Aoki, Y. Characterizing Exon Skipping Efficiency in DMD Patient Samples in Clinical Trials of Antisense Oligonucleotides. J. Vis. Exp. (159), e60672, doi:10.3791/60672 (2020).