إعداد SNS Cobalt (II) المجمعات نموذج بينسر من الكبد الكحول ديهيدروجيناز
Summary
يتم تقديم إعداد SNS pincer الكوبالت (II) نماذج المجمعات من الكبد الكحول ديهيدروجيناز هنا. يمكن إعداد المجمعات عن طريق التفاعل مع السلائف ligand CoCl2· 6H2O ويمكن بعد ذلك إعادة تبلورها عن طريق السماح للأثير الديثيل لنشر ببطء في حل الأسيتونتريل الذي يحتوي على مجمع الكوبالت.
Abstract
المجمعات النموذجية الكيميائية مستعدة لتمثيل الموقع النشط للإنزيم. في هذا البروتوكول، يتم تثبيت عائلة من السلائف الليزوية المنجلة المنجلة (كل منها تمتلك اثنين من الكبريت وواحد وظائف ذرة متبرع النيتروجين (SNS) واستنادًا إلى مركبات bis-imidazole أو bis-triazole) مع CoCl2· 6H2O لتحمل مركبات ترايدنتت SNS pincer Cobalt (II). إعداد المجمعات نموذج الكوبالت (II) لdehydrogenase الكحول الكبد هو سهل. استنادا إلى تغيير اللون السريع عند إضافة CoCl2· 6H2O إلى حل الأسيتونتريل الذي يحتوي على السلائف ligand، وأشكال معقدة بسرعة. اكتمال تشكيل المجمع المعدني بعد السماح للمحلول بالجزر بين عشية وضحاها. هذه المجمعات الكوبالت (II) بمثابة نماذج لموقع الزنك النشط في الكبد الكحول ديهيدروجيناز (LADH). تتميز المجمعات باستخدام حيود الأشعة السينية الكريستالية المفردة ، وقياس الطيف الكتلي الكهربائي ، والطيف المرئي فوق البنفسجي ، والتحليل الأولي. لتحديد بنية المجمع بدقة ، يجب تحديد هيكلها البلوري الواحد. ثم تزرع بلورات واحدة من المجمعات التي هي مناسبة لحيود الأشعة السينية عن طريق نشر بخار بطيء من الأثير الديثيل في محلول الأسيتونتريل الذي يحتوي على مجمع الكوبالت (II). بالنسبة للبلورات عالية الجودة ، عادة ما تتم إعادة التبلور على مدى فترة أسبوع واحد ، أو أكثر. ويمكن تطبيق هذه الطريقة على إعداد مجمعات التنسيق النموذجية الأخرى ويمكن استخدامها في مختبرات التدريس الجامعية. وأخيرا، يعتقد أن الآخرين قد تجد هذه الطريقة إعادة التبلور للحصول على بلورات واحدة مفيدة لأبحاثهم.
Introduction
الغرض من الطريقة المعروضة هو إعداد القياس جزيء صغير من LADH لمزيد من فهم النشاط الحفاز للإنزيمات المعدنية. LADH هو إنزيم خافت يحتوي على مجال ربط عامل مساعد ومجال حفاز يحتوي على الزنك (II) مع المعادن1. LADH، في وجود NADH العامل المشارك، يمكن أن تقلل من الكيتونات والألدهيدات لمشتقات الكحول الخاصة بهم2. في وجود NAD+، LADH يمكن أن تؤدي الحفز العكسي من أكسدة الكحول إلى الكيتونات والألدهيدات2. يظهر الهيكل البلوري لموقع LADH النشط أن مركز الزنك (II) المعدني مرتبط بذرة نتروجين واحدة ، مقدمة من سلسلة جانب الهستيدين وذرتي كبريت ويقدمه اثنان من السيستين ليغاند3. وقد أظهرت أبحاث أخرى أن مركز الزنك المعدني هو رباط مع جزيء الماء اللابيلي، مما أدى إلى هندسة رباعية زائفة حول مركز المعدن4.
لقد أبلغنا في وقت سابق ونستخدم SNS pincer ligand السلائف وكذلك metallated السلائف ligand مع ZnCl2 لتشكيل Zn (II) المجمعات التي تحتوي على السلائف الليغاند tridentate5،6،7. وترد هذه السلائف ligand في الشكل 1. أظهرت هذه المجمعات الزنك (II) نشاط للحد من الألدهيدات الفقراء الإلكترونوبالتالي هي مجمعات نموذجية لLADH. في وقت لاحق، تم الإبلاغ عن توليف وتوصيف سلسلة من النحاس (I) والنحاس (II) المجمعات التي تحتوي على سلائف الليغاند SNS8،9،10.
على الرغم من أن LADH هو إنزيم الزنك (II) ، فإننا مهتمون بإعداد مجمعات نموذج الكوبالت (II) من LADH من أجل الحصول على مزيد من المعلومات الطيفية حول نظائر الكوبالت (II) من LADH. المجمعات الكوبالت (II) ملونة، في حين أن مجمعات الزنك (II) هي خارج الأبيض. وبما أن مجمعات الكوبالت (II) ملونة، يمكن الحصول على أطياف الأشعة فوق البنفسجية المرئية للمجمعات، حيث يمكن أيضًا جمع معلومات حول قوة حقل ليغاند في مجمعات الكوبالت (II). باستخدام المعلومات من الحسابات غاوسي والأطياف المرئية فوق البنفسجية التي تم الحصول عليها تجريبيا، يمكن استنتاج المعلومات حول قوة حقل ليغاند. الكوبالت (II) هو بديل جيد للزنك (II) ، لأن كلا الأيونات تحتوي على إشعاعي أيوني مماثل وحمضيات لويس مماثلة11،12.
الأسلوب المعروض ينطوي على توليف ووصف المجمعات نموذج في محاولة لتقليد السلوك الحفاز الطبيعي من LADH5,6. لقد قمنا في السابق بإنشاء مجموعة من السلائف مع ZnCl2 لتشكيل مجمعات نموذج الزنك (II) من LADH ، والتي تم تشكيلها على غرار بنية وتفاعل موقع الزنك النشط في LADH4. من خلال تجارب متعددة ، أثبتت هذه اللجان أن تكون قوية في ظل ظروف بيئية مختلفة وظلت مستقرة مع مجموعة متنوعة من مجموعات R المرفقة. 5،6
Tridentate ligands هي الأفضل بالمقارنة مع ligands monodentate ، لأنه تم العثور على أن تكون أكثر نجاحا مع metalation بسبب آثار chelate قوية من الليغاندات ترايدنتت. هذه الملاحظة يرجع إلى إنتروبيا أكثر تفضيلا من تشكيل الليغاند الكمرة ترايدنتت بالمقارنة مع ليغاند monodentate13. وعلاوة على ذلك، tridentate الكماشة ليغاند من المرجح أن تمنع التمممن من المجمعات المعدنية، وهو المفضل لأن الخافتة من المرجح أن تبطئ النشاط الحفاز للمجمع14. وهكذا، فإن استخدام الليغاندات المعسرة المنقطة قد أثبتت نجاحها في الكيمياء العضوية المعدنية في إعداد المجمعات النشطة والقوية الحفازة. وقد تم أقل SNS المجمعات الكماشة درس من أنظمة pincer الأخرى، كما المجمعات pincer عادة ما تحتوي على ثاني وثالث المعادن الانتقالالصف 15.
هذا البحث على المعادنالانزيمات يمكن أن تساعد على زيادة فهم نشاطها الأنزيمي، والتي يمكن تطبيقها على مجالات أخرى في علم الأحياء. هذه الطريقة في توليف المجمعات النموذجية مقارنة مع الطريقة البديلة (توليف البروتين بأكمله من LADH) مواتية لعدد من الأسباب. الميزة الأولى هي أن المجمعات النموذجية منخفضة في الكتلة الجزيئية ولا تزال قادرة على تمثيل النشاط الحفاز والظروف البيئية للموقع النشط للإنزيم الطبيعي بدقة. ثانياً، المجمعات النموذجية أبسط للعمل مع البيانات الموثوقة والقابلة للربط وإنتاجها.
تصف هذه المخطوطة الإعداد الصناعي وتوصيف مجمعين نموذج الكاسر الكوبالت (II) من LADH. كلا المجمعين ميزة ليغاند الكماشة التي تحتوي على ذرات المتبرع الكبريت والنيتروجين والكبريت. ويستند المجمع الأول(4)على سلائف imidazole، والثاني(5)ويستند على سلائف تريازول. تظهر المجمعات التفاعل للحد من قياس التقويات للإلكترونات الألدهيدات الفقيرة في وجود متبرع بالهيدروجين. سيتم الإبلاغ عن نتائج التفاعل هذه في مخطوطة لاحقة.
Protocol
Representative Results
Discussion
إعداد المجمعات 4 و 5 سهل. الخطوة الرئيسية هي إضافة CoCl الصلبة2· 6H2O إلى حل الأسيتونتريل الذي يحتوي على السلائف ligand ذات الصلة. يتحول الحل إلى اللون الأخضر الداكن في غضون ثوان بعد إضافة CoCl2·6H2O لتشكيل مجمع 4. يتحول الحل إلى اللون الأزرق الساطع بع?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تلقى جون ميتشينيكوفسكي الدعم المالي من ما يلي لهذا المشروع: تحالف منحة الفضاء في وكالة ناسا في كونيتيكت (جائزة رقم P-1168)، معهد العلوم بجامعة فيرفيلد، صندوق نشر كلية الآداب والعلوم، فيرفيلد جامعة كلية البحوث الصيفية الراتب، والمؤسسة الوطنية للعلوم – برنامج البحوث الرئيسية الأجهزة (منحة رقم CHE-1827854) للحصول على الأموال للحصول على مطياف NMR 400 ميغاهرتز. كما يشكر تيرينس وو (جامعة ييل) للمساعدة في الحصول على أطياف كتلة البخاخة الكهربائية. جيري جاسينسكي يعترف المؤسسة الوطنية للعلوم – برنامج الأجهزة البحثية الرئيسية (منحة رقم CHE-1039027) للحصول على أموال لشراء مقياس diffractometer الأشعة السينية. شيلا بونيتيبوس، إميلسي المانزا، رامي خاربوش، وسامانثا زيغمونت يعترفون ببرنامج دارسي هارديمان لتقديم رواتبهم البحثية الصيفية.
Materials
| 100 mL Round Bottomed Flask | Chem Glass | CG150691 | 100mL Single Neck Round Bottomed Flask, 19/22 Outer Joint |
| Acetonitrile | Fisher | HB9823-4 | HPLC Grade |
| Chiller for roto-vap | Lauda | L000638 | Alpha RA 8 |
| Cobalt Chloride hexahydrate | Acros Organics | AC423571000 | Acros Organics |
| Diethyl Ether | Fisher | E-138-1 | Diethyl Ether Anhydorus |
| graduated cylinder | Fisher | S63456 | 25 mL graduated cylinder |
| hotplate | Fisher | 11-100-49SH | Isotemp Basic Stirring Hotplate |
| jars | Fisher | 05-719-481 | 250 mL jars |
| Ligand | —– | —– | Synthezied previously by Professor Miecznikowski |
| medium cotton balls | Fisher | 22-456-80 | medium cotton balls |
| one dram vials | Fisher | 03-339 | one dram vials with TFE Lined Cap |
| pipet | Fisher | 13-678-20B | 5.75 inch pipets |
| pipet bulbs | Fisher | 03-448-21 | Fisher Brand Latex Bulb for pipet |
| recrystallizing dish for sand bath | Fisher | 08-741 D | 325 mL recrystallizing dish for sand bath |
| reflux condensor | Chem Glass | CG-1218-A-22 | Condenser with 19/22 inner joint |
| Rotovap | Heidolph Collegiate | 36000090 | Brinkmann; Heidolph Collegiate Rotary Evaporator with Heidolph WB eco bath Heidolph Rotary Evaporator |
| sea sand for sandbath | Acros Organics | 612355000 | washed sea sand for sand bath |
| Stir bar | Fisher | 07-910-23 | Egg-Shaped Magnetic Stir Bar |
| Vacum grease | Fisher | 14-635-5D | Dow Corning High Vacuum Grease |
| vacuum pump for rotovap | Heidolph Collegiate | 36302830 | Heidolph Rotovac Valve Control |
References
- Holm, R. H., Kennepohl, P., Solomon, E. I. Structural and Functional Aspects of Metal Sites in Biology. Chemical Reviews. 96 (7), 2239-2314 (1996).
- Ibers, J. A., Holm, R. H. Modeling coordination sites in metallobiomolecules. Science. 209 (4453), 223-235 (1980).
- Kannan, K. K., et al. Crystal structure of human erythrocyte carbonic anhydrase B. Three-dimensional structure at a nominal 2.2-A resolution. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 72 (1), 51-55 (1975).
- Eklund, H., Brändén, C. I. Structural differences between apo- and holoenzyme of horse liver alcohol dehydrogenase. Journal of Biological Chemistry. 254, 3458-3461 (1979).
- Miecznikowski, J. R., et al. Syntheses, Characterization, Density Functional Theory Calculations and Activity of Tridentate SNS Zinc Pincer Complexes. Inorganica Chimica Acta. 376, 515-524 (2011).
- Miecznikowski, J. R., et al. Syntheses, Characterization, Density Functional Theory Calculations, and Activity of Tridentate SNS Zinc Pincer Complexes Based on Bis-Imidazole or Bis-Triazole Precursors. Inorganica Chimica Acta. 387, 25-36 (2012).
- Sunderland, J. R., et al. Investigation of liver alcohol dehydrogenase catalysis using an NADH biomimetic and comparison with a synthetic zinc model complex. Polyhedron. 114, 145-151 (2016).
- Miecznikowski, J. R., et al. Synthesis and characterization of three- and five-coordinate copper(II) complexes based SNS ligand precursors. Polyhedron. 80, 157-165 (2014).
- Miecznikowski, J. R., et al. Synthesis, Characterization, and Computational Study of Three-Coordinate SNS Copper(I) Complexes based on Bis-Thione Ligand Precursors. Journal of Coordination Chemistry. 67, 29-44 (2014).
- Lynn, M. A., et al. Copper(I) SNS Pincer Complexes: Impact of Ligand Design and Solvent Coordination on Conformer Interconversion from Spectroscopic and Computational Studies. Inorganica Chimica Acta. 495, (2019).
- . Web Elements Available from: https://www.webelements.com/zinc/atom_sizes.html (2019)
- . Web Elements Available from: https://www.webelements.com/cobalt/atom_sizes.html (2019)
- Caballero, A., Díez-Barra, E., Jalón, F. A., Merino, S., Tejeda, J. 1,1′-(pyridine-2,6-diyl)bis(3-benzyl-2,3-dihydro-1H-imidazol-2-ylidine), a new multidentate N-heterocyclic bis-carbene and its silver(I) complex derivative. Journal of Organometallic Chemistry. 617-618, 395-398 (2001).
- Albrecht, M., van Koten, G. Platinum Group Organometallics Based on “Pincer” Complexes: Sensors, Switches, and Catalysis. Angewandte Chemie International Edition. 40 (20), 3750-3781 (2001).
- Peris, E., Crabtree, R. H. Key factors in pincer ligand design. Chemistry Society Reviews. 47, 1959-1968 (2018).
- Dolomanov, O. V., Bourhis, L. J., Gildea, R. J., Howard, J. A. K., Puschmann, H. A complete structure, solution, refinement, and analysis program. Journal of Applied Crystallography. 42, 339-341 (2009).
- Sheldrick, G. M. Integrated Space Group and Crystal Structure Determination. Acta Crystallography. 71, 3-8 (2015).
- Sheldrick, G. M. Crystal Structure Refinement with SHELXL. Acta Crystallography. 71, 3-8 (2015).
- Pauling, L. Metal-metal bond lengths in complexes of transition metals. Proceedings of the National Academies of the Sciences of the United States of America. 73, 4290-4293 (1976).
- Trzhtsinskaya, B. V., Abramova, N. D. Imidazole-2-Thiones: Synthesis, Structure, Properties. Sulfur Reports. 10 (4), 389 (1991).
- Schneider, G., Eklund, H., Cedergren-Zeppezauer, E., Zeppezauer, M. Crystal structure of the active site in specifically metal-depleted and cobalt substituted horse liver alcohol dehydrogenase derivatives. Proceedings of the National Academies of the Sciences of the United States of America. 80, 5289-5293 (1983).
- Yang, L., Powell, D. R., Houser, R. P. Structural variation in copper(I) complexes with pyridylmethylamide ligands: structural analysis with a new four-coordinate geometry index, τ4. Dalton Transactions. , 955-964 (2007).
