Производство высокотитерных инфекционных частиц гриппа Псевдотипированные с конвертами гликопротеинов из высокопатогенных вирусов H5N1 и Avian H7N9
Summary
Этот протокол описывает экспериментальный процесс по производству высокотитра инфекционных вирусных псевдотипированных частиц (pp) с оболочкой гликопротеинов из двух штаммов гриппа А и как определить их инфекционность. Этот протокол очень адаптируется к разработке pps любого другого типа окутанных вирусов с различными гликопротеины оболочки.
Abstract
Случайная прямая передача высокопатогенного вируса птичьего гриппа А H5N1 (HPAI H5N1) и H7N9 людям и их летальности являются серьезными проблемами общественного здравоохранения и указывают на возможность эпидемии. Тем не менее, наше молекулярное понимание вируса является рудиментарным, и необходимо изучить биологические свойства его оболочки белков в качестве терапевтических целей и разработать стратегии по борьбе с инфекцией. Мы разработали твердую вирусную псевдотипированную частицу (pp) платформу для изучения вируса птичьего гриппа, включая функциональный анализ его гемагглютинина (HA) и нейраминидаза (NA) конвертгликопротеинов, реассортировызные характеристики HAs и NAs, рецепторы, тропизмы, нейтрализация антител, диагностика, инфекционность, для целей разработки лекарств и разработки вакцин. Здесь мы описываем экспериментальную процедуру по установлению pps с оболочкой гликопротеинов (HA, NA) из двух штаммов гриппа А (HAPI H5N1 и 2013 птичьи H7N9). Их генерация основана на способности некоторых вирусов, таких как вирус мурин лейкемии (MLV), включать конверт гликопротеинов в pp. Кроме того, мы также подробно, как эти pps количественно с RT-qPCR, и инфекционность обнаружения родной и несовместимые вирусpps в зависимости от происхождения HAs и NAs. Эта система является очень гибкой и адаптируемой и может быть использована для создания вирусных pps с конвертом гликопротеинов, которые могут быть включены в любой другой тип окутанного вирусом. Таким образом, эта платформа вирусных частиц может быть использована для изучения диких вирусов во многих исследованиях.
Introduction
Миссия вирусной частицы состоит в том, чтобы транспортировать ее геном из инфицированной клетки-хозяина в неинфицированную клетку-хозяина и доставить ее в цитоплазму или ядро в рецифицируемой форме1. Этот процесс первоначально вызван связыванием с рецепторами клеток-хозяев, а затем слиянием вирионных и клеточных мембран. Для окутанных вирусов, таких как вирусы гриппа, шип гликопротеинов отвечают за связывание рецепторов и слияние1,2. Вирусные гликопротеины конверта (например, пирогенны, антигены), участвуют во многих важных свойствах и событиях, таких как инициирование жизненного цикла вируса (связывание и слияние), вирусный патогенез, иммуногенность, апоптоз клеток-хозяев и клеточный тропизм, клеточный эндоцитарный путь, а также межвидовая передача и реассортициция1,3,4,5,6. Исследования вирусных гликопротеинов конверт поможет нам понять многие аспекты процесса вирусной инфекции. Псевдотипированные вирусные частицы (pp), также называемые псевдовирии или псевдочастицы, могут быть получены с помощью псевдотипирования техники8,9,10. Эта технология была использована для разработки псевдотипированных частиц многих вирусов, в том числе гепатита С11,12, гепатита В13,везикулярный стоматит вирус (VSV)14,15, и вирус гриппа16,17,18,19. Эта технология основана на протеине Gag-Pol лентивирусов или других ретровирусов.
Псевдотипированные вирусные частицы могут быть получены с помощью трех плазмидной системы путем котрансфектации вирусного конверта гликопротеина экспрессии плазмида, ретровирусной упаковки плазмид отсутствует конверт env гена, и отдельный репортер плазмид в pp клеток производителя. Ретровирус собран его протеином Gag, и он бутоны от зараженной мембраны клетки который выражает протеин конверта вируса1. Таким образом, можно получить высокий титр гриппа pps с помощью ретровирусного белка Gag для производства почек на клеточной мембране, выражающей гриппHA и NA. В наших предыдущих исследованиях, HAs / NAs во всех комбинациях были функциональными и в состоянии выполнять свои соответствующие функции в вирусном жизненном цикле16,17,18,20,21. Эти pps использованы для того чтобы исследовать характеристики гриппа биологически, включая hemagglutination, деятельность neuraminidase, tropism связывания HA-рецептора, и infectivity. Поскольку HA и NA являются важными поверхностными функциональными белками в вирусном жизненном цикле, несоответствие HAs и NAs, полученных из различных штаммов гриппа, может частично продемонстрировать реассортивность между ними. Здесь мы создаем восемь типов гриппа pps, объединяя два HAs и два NAs (производные от штамма HPAI H5N1 и h7N9 пятно), используя три плазмидной псевдотипирования системы. Эти восемь типов pps включают в себя два родного pps, H5N1pp, H7N9pp; два несовпадающих pps, (H5’N9)pp, (H7’N1)pp; и четыре pps только укрывательство одного гликопротеина (HA или NA), H5pp, N1pp, H7pp, N9pp. Исследования вируса гриппа, такие как H5N1 и H7N9, ограничены требованиями биобезопасности. Все исследования штаммов вируса дикого гриппа должны проводиться в лаборатории биобезопасности 3 (BSL-3). Псевдотипированная технология вирусных частиц может быть использована для упаковки искусственного вириона в условиях биобезопасности 2 (BSL-2). Таким образом, pps представляют собой более безопасный и полезный инструмент для изучения процессов вируса гриппа в зависимости от двух основных гликопротеинов: гемагглютинина (HA) и нейраминидаза (NA).
Этот протокол описывает генерацию этих pps с трехплазмидной стратегией котрансфекции (см. рисунок 1),как количественно pps, и обнаружение инфекции. PP производства включает в себя три вида плазмидов(Рисунок 1). Ген кляп-пол, который кодирует ретровирусный белок Gag-Pol, был клонирован из комплекта упаковки ретровирусов и вставлен в плазмид pcDNA 3.1 и назван pcDNA-Gag-Pol. Улучшенный зеленый флуоресцентный белок (eGFP) ген, который кодирует зеленый флуоресцентный белок, был клонирован из вектора pTRE-EGFP, вставлен в плазмид pcDNA 3.1 и называется pcDNA-GFP. Во время клонирования последовательность упаковочного сигнала (яп. ) была добавлена через грунтовку. Гены HA и NA были клонированы в плазмид pVRC, названный pVRC-HA и pVRC-NA, соответственно. Последний плазмид кодирует белок синтеза и может быть заменен любым другим интересуемым белком синтеза. Наша псевдотипивная платформа включает в себя два гликопротеина экспрессии плазмиды: pVRC-HA и pVRC-NA. Это может упростить исследования по реассортиции между различными штаммами вируса в условиях BSL-2.
Protocol
Representative Results
Discussion
В этом протоколе мы описываем метод производства псевдотипированных частиц вируса гриппа (pp) в условиях BSL-2. Репортер плазмид pcDNA-GFP включен в pps и может быть использован для количественной оценки pps FACS в анализе инфекции. Мы выбрали два типа восприимчивых клеточных линий, потому что они ш…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана грантами от провинции Чжэцзян медицины и здравоохранения науки и техники плана (Грант Номера, 2017KY538), Ханчжоу муниципальной медицины и здравоохранения науки и техники плана (Грант Номера, OO20190070), Ханчжоу медицинской науки и Проект “Технологический ключевой проект” (Grant Numbers, 2014-11) и муниципальный проект автономного применения в Ханчжоу социального развития и научных исследований (Grant Numbers, 20191203B134).
Materials
| Benzonase Nuclease | Millipore | 70664 | Effective viscosity reduction and removal of nucleic acids from protein solutions |
| Clear Flat Bottom Polystyrene TC-treated Microplates (96-well) | Corning | 3599 | Treated for optimal cell attachment Sterilized by gamma radiation and certified nonpyrogenic Individual alphanumeric codes for well identification |
| Clear TC-treated Multiple Well Plates (6-wells) | Costar | 3516 | Individual alphanumerical codes for well identification Treated for optimal cell attachment Sterilized by gamma irradiation |
| Dulbecco's modified essential medium (DMEM) | Gibco | 11965092 | A widely used basal medium for supporting the growth of many different mammalian cells |
| Fetal bovine serum | Excell | FND500 | fetal bovine sera that can offer excellent value for basic cell culture, specialty research, and specific assays |
| Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) | Beckman coulter | cytoflex | |
| Human alveolar adenocarcinoma A549 cells | ATCC | CRM-CCL-185 | |
| Human embryonic kidney (HEK) HEK-293T/17 cells | ATCC | CRL-11268 | A versatile transfection reagent that has been shown to effectively transfect the widest variety of adherent and suspension cell lines |
| Inverted fluorescent biological microscope | Olympus | BX51-32P01-FLB3 | |
| Inverted light microscope | Olympus | CKX31-12PHP | |
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Invitrogen | 11668019 | Rapid, sensitive and precise probe-based qPCR detection and quantitation of target RNA targets. |
| Luna Universal Probe One-Step RT-qPCR Kit | NEB | E3006L | Will withstand up to 14,000 RCF RNase-/DNase-free Nonpyrogenic |
| Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) cells | ATCC | CCL-34 | |
| MaxyClear Snaplock Microcentrifuge Tube (1.5 mL) | Axygen | MCT-150-C | 33 mm, gamma sterilized |
| Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45 µm, PVDF | Millipore | SLHV033RS | an improved Minimal Essential Medium (MEM) that allows for a reduction of Fetal Bovine Serum supplementation by at least 50% with no change in cell growth rate or morphology. Opti-MEM I medium is also recommended for use with cationic lipid transfection reagents, such as Lipofectamine reagent. |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Gibco | 11058021 | The antibiotics penicillin and streptomycin are used to prevent bacterial contamination of cell cultures due to their effective combined action against gram-positive and gram-negative bacteria. |
| penicillin-streptomycin | Gibco | 15140122 | Maximum RCF is 12,500 xg Temperature range from -80 °C to 120 °C RNase-/DNase-free Sterile |
| PP Centrifuge Tubes (15 mL) | Corning | 430791 | a stable and highly reactive serine protease |
| Proteinase K | Beyotime | ST532 | Treated for optimal cell attachment Sterilized by gamma radiation and certified nonpyrogenic |
| TC-treated Culture Dish (60mm) | Corning | 430166 | Trypsin from bovine pancreas TPCK Treated, essentially salt-free, lyophilized powder, ≥10,000 BAEE units/mg protein |
| TPCK-trypsin | Sigma | T1426 | This liquid formulation of trypsin contains EDTA and phenol red. Gibco Trypsin-EDTA is made from trypsin powder, an irradiated mixture of proteases derived from porcine pancreas. Due to its digestive strength, trypsin is widely used for cell dissociation, routine cell culture passaging, and primary tissue dissociation. The trypsin concentration required for dissociation varies with cell type and experimental requirements. |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Gibco | 25200056 |
References
- Knipe, D. M., Howley, P. M. . Fields Virology (6th). , (2013).
- White, J. M., Delos, S. E., Brecher, M., Schornberg, K. Structures and mechanisms of viral membrane fusion proteins: multiple variations on a common theme. Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology. 43 (3), 189-219 (2008).
- Bright, R. A., et al. Cross-clade protective immune responses to influenza viruses with H5N1 HA and NA elicited by an influenza virus-like particle. PLoS One. 3 (1), 1501 (2008).
- Yang, J., et al. Reliability of pseudotyped influenza viral particles in neutralizing antibody detection. PLoS One. 9 (12), 113629 (2014).
- Wyatt, R., Sodroski, J. The HIV-1 envelope glycoproteins: fusogens, antigens, and immunogens. Science. 280 (5371), 1884-1888 (1998).
- Joe, A. K., Foo, H. H., Kleeman, L., Levine, B. The transmembrane domains of Sindbis virus envelope glycoproteins induce cell death. Journal of Virology. 72 (5), 3935-3943 (1998).
- Albecka, A., Laine, R. F., Janssen, A. F., Kaminski, C. F., Crump, C. M. HSV-1 Glycoproteins Are Delivered to Virus Assembly Sites Through Dynamin-Dependent Endocytosis. Traffic. 17 (1), 21-39 (2016).
- Huang, A. S., Palma, E. L., Hewlett, N., Roizman, B. Pseudotype formation between enveloped RNA and DNA viruses. Nature. 252 (5485), 743-745 (1974).
- Rubin, H. Genetic Control of Cellular Susceptibility to Pseudotypes of Rous Sarcoma Virus. Virology. 26, 270-276 (1965).
- Steffen, I., Simmons, G. Pseudotyping Viral Vectors With Emerging Virus Envelope Proteins. Current Gene Therapy. 16 (1), 47-55 (2016).
- Bartosch, B., Dubuisson, J., Cosset, F. L. Infectious hepatitis C virus pseudo-particles containing functional E1-E2 envelope protein complexes. Journal of Experimental Medicine. 197 (5), 633-642 (2003).
- Bian, T., Zhou, Y., Bi, S., Tan, W., Wang, Y. HCV envelope protein function is dependent on the peptides preceding the glycoproteins. Biochemical and Biophysical Research Communications. 378 (1), 118-122 (2009).
- Gudima, S., Meier, A., Dunbrack, R., Taylor, J., Bruss, V. Two potentially important elements of the hepatitis B virus large envelope protein are dispensable for the infectivity of hepatitis delta virus. Journal of Virology. 81 (8), 4343-4347 (2007).
- Yoshida, Y., Emi, N., Hamada, H. VSV-G-pseudotyped retroviral packaging through adenovirus-mediated inducible gene expression. Biochemical and Biophysical Research Communications. 232 (2), 379-382 (1997).
- Burns, J. C., Friedmann, T., Driever, W., Burrascano, M., Yee, J. K. Vesicular stomatitis virus G glycoprotein pseudotyped retroviral vectors: concentration to very high titer and efficient gene transfer into mammalian and nonmammalian cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (17), 8033-8037 (1993).
- Zhang, F., et al. Characterization of pseudoparticles paired with hemagglutinin and neuraminidase from highly pathogenic H5N1 influenza and avian influenza A (H7N9) viruses. Virus Research. 253, 20-27 (2018).
- Zhang, F., et al. Infectivity of Pseudotyped Particles Pairing Hemagglutinin of Highly Pathogenic Avian Influenza a H5N1 Virus with Neuraminidases of The 2009 Pandemic H1N1 and a Seasonal H3N2. Journal of Bioterrorism & Biodefense. 2, 104 (2011).
- Wu, J., et al. Characterization of neuraminidases from the highly pathogenic avian H5N1 and 2009 pandemic H1N1 influenza A viruses. PLoS One. 5 (12), 15825 (2010).
- Nefkens, I., et al. Hemagglutinin pseudotyped lentiviral particles: characterization of a new method for avian H5N1 influenza sero-diagnosis. Journal of Clinical Virology. 39 (1), 27-33 (2007).
- Zhang, Y., et al. Hemagglutinin and neuraminidase matching patterns of two influenza A virus strains related to the 1918 and 2009 global pandemics. Biochemical and Biophysical Research Communications. 387 (2), 405-408 (2009).
- Lin, X., et al. Oseltamivir boosts 2009 H1N1 virus infectivity in vitro. Biochemical and Biophysical Research Communications. 390 (4), 1305-1308 (2009).
- McKay, T., Patel, M., Pickles, R. J., Johnson, L. G., Olsen, J. C. Influenza M2 envelope protein augments avian influenza hemagglutinin pseudotyping of lentiviral vectors. Gene Therapy. 13 (8), 715-724 (2006).
- Pan, H., et al. Autophagy mediates avian influenza H5N1 pseudotyped particle-induced lung inflammation through NF-kappaB and p38 MAPK signaling pathways. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 306 (2), 183-195 (2014).
- Szecsi, J., et al. Induction of neutralising antibodies by virus-like particles harbouring surface proteins from highly pathogenic H5N1 and H7N1 influenza viruses. Virology Journal. 3, 70 (2006).
- Garcia, J. M., Lagarde, N., Ma, E. S., de Jong, M. D., Peiris, J. S. Optimization and evaluation of an influenza A (H5) pseudotyped lentiviral particle-based serological assay. Journal of Clinical Virology. 47 (1), 29-33 (2010).
- Garcia, J. M., Lai, J. C. Production of influenza pseudotyped lentiviral particles and their use in influenza research and diagnosis: an update. Expert Review of Anti-infective Therapy. 9 (4), 443-455 (2011).
- Haynes, J. R., et al. Influenza-pseudotyped Gag virus-like particle vaccines provide broad protection against highly pathogenic avian influenza challenge. Vaccine. 27 (4), 530-541 (2009).
- Schmeisser, F., et al. Production and characterization of mammalian virus-like particles from modified vaccinia virus Ankara vectors expressing influenza H5N1 hemagglutinin and neuraminidase. Vaccine. 30 (23), 3413-3422 (2012).
- Liu, Y. V., et al. Chimeric severe acute respiratory syndrome coronavirus (SARS-CoV) S glycoprotein and influenza matrix 1 efficiently form virus-like particles (VLPs) that protect mice against challenge with SARS-CoV. Vaccine. 29 (38), 6606-6613 (2011).
- Moeschler, S., Locher, S., Conzelmann, K. K., Kramer, B., Zimmer, G. Quantification of Lyssavirus-Neutralizing Antibodies Using Vesicular Stomatitis Virus Pseudotype Particles. Viruses. 8 (9), 254 (2016).
- Lai, A. L., Millet, J. K., Daniel, S., Freed, J. H., Whittaker, G. R. The SARS-CoV Fusion Peptide Forms an Extended Bipartite Fusion Platform that Perturbs Membrane Order in a Calcium-Dependent Manner. Journal of Molecular Biology. 429 (24), 3875-3892 (2017).
- Millet, J. K., et al. Middle East respiratory syndrome coronavirus infection is inhibited by griffithsin. Antiviral Research. 133, 1-8 (2016).
- Millet, J. K., et al. Production of Pseudotyped Particles to Study Highly Pathogenic Coronaviruses in a Biosafety Level 2 Setting. Journal of Visualized Experiments. (145), e59010 (2019).
- Ma, M., et al. Murine leukemia virus pseudotypes of La Crosse and Hantaan Bunyaviruses: a system for analysis of cell tropism. Virus Research. 64 (1), 23-32 (1999).
- Wool-Lewis, R. J., Bates, P. Characterization of Ebola virus entry by using pseudotyped viruses: identification of receptor-deficient cell lines. Journal of Virology. 72 (4), 3155-3160 (1998).
- Chen, C. M., et al. Production and design of more effective avian replication-incompetent retroviral vectors. Developmental Biology. 214 (2), 370-384 (1999).
- Kaku, Y., et al. Second generation of pseudotype-based serum neutralization assay for Nipah virus antibodies: sensitive and high-throughput analysis utilizing secreted alkaline phosphatase. Journal of Virological Methods. 179 (1), 226-232 (2012).
- Rudiger, D., Kupke, S. Y., Laske, T., Zmora, P., Reichl, U. Multiscale modeling of influenza A virus replication in cell cultures predicts infection dynamics for highly different infection conditions. PLOS Computational Biology. 15 (2), 1006819 (2019).
- Petiot, E., et al. Influenza viruses production: Evaluation of a novel avian cell line DuckCelt(R)-T17. Vaccine. 36 (22), 3101-3111 (2018).
