高病原性H5N1および鳥類H7N9ウイルス由来のエンベロープ糖タンパク質を用いた高力性インフルエンザ擬似型粒子の生産
Summary
このプロトコルは、2つのインフルエンザA株からエンベロープ糖タンパク質を有する高力性ウイルス性偽型粒子(pp)を生成する実験プロセスと、その感染性を決定する方法を記述する。このプロトコルは、異なるエンベロープ糖タンパク質を持つエンベロープウイルスの他のタイプのppsを開発するために非常に適応性があります。
Abstract
高病原性鳥インフルエンザA型ウイルスH5N1(HPAI H5N1)及びH7N9のヒト及びその致死性の時折の直接感染は、深刻な公衆衛生上の問題であり、流行の可能性を示唆している。しかし、ウイルスの分子理解は初歩的であり、そのエンベロープタンパク質の生物学的性質を治療標的として研究し、感染を制御する戦略を開発する必要があります。ヘマグルチニン(HA)およびノイラミニダーゼ(NA)エンベロープ糖タンパク質の機能解析、HAおよびNAの再種化特性を含む鳥インフルエンザウイルスを研究するための固体ウイルス擬似型粒子(pp)プラットフォームを開発し、受容体は、栄養、中和抗体、診断、感染性、薬剤開発およびワクチン設計の目的で。ここでは、2つのインフルエンザA型(HAPI H5N1および2013鳥類H7N9)からエンベロープ糖タンパク質(HA,NA)を用いてppsを確立するための実験手順について説明する。彼らの世代は、マウス白血病ウイルス(MLV)のようないくつかのウイルスの容量に基づいて、エンベロープ糖タンパク質をppに組み込む。さらに、これらのppsをRT-qPCRで定量化する方法、およびHとNの起源に応じてネイティブおよび不一致のウイルスppsの感染性検出についても詳しく説明します。このシステムは非常に柔軟で適応性があり、エンベロープドコードタンパク質を持つウイルスppsを確立するために使用することができます。したがって、このウイルス粒子プラットフォームは、多くの研究研究で野生ウイルスを研究するために使用することができます。
Introduction
ウイルス粒子の使命は、感染した宿主細胞から非感染宿主細胞にそのゲノムを輸送し、それを複製能力のある形態1の細胞質または核に送達することである。このプロセスは、最初は宿主細胞受容体への結合によって引き起こされ、続いてビリオンと細胞膜の融合が続く。インフルエンザウイルスのようなエンベロープウイルスの場合、スパイク糖タンパク質は受容体結合および融合1、2を担う。ウイルスエンベロープ糖タンパク質(例えば、パイロゲン、抗原)は、ウイルスライフサイクル開始(結合および融合)、ウイルス病因、免疫原性、宿主細胞アポトーシスおよび細胞トロピズム、細胞内分泌経路、ならびに種間の伝染および再分類など、多くの重要な特性および事象に関与している。ウイルスエンベロープ糖タンパク質に関する研究は、ウイルス感染プロセスの多くの側面を理解するのに役立ちます。擬似型ウイルス粒子(pp)は、擬似ウイルスまたは擬似粒子とも呼ばれ、擬似タイピング技術8、9、10を介して生成することができる。この技術は、C型肝炎11、12、B型肝炎13、小胞性口内炎ウイルス(VSV)14、15、およびインフルエンザウイルス16、17、18、19を含む多くのウイルスの擬似型粒子を開発するために使用されている。この技術は、レンチウイルスまたは他のレトロウイルスのGag-Polタンパク質に基づいています。
擬似型ウイルス粒子は、ウイルスエンベロープ糖タンパク質発現プラスミドをコトランスフェクションすることにより3プラスミド系を用いて得ることができ、エンベロープenv遺伝子を欠損させるレトロウイルス包装プラスミド、およびppプロデューサー細胞に別のレポータープラスミドを得ることができる。レトロウイルスは、そのGagタンパク質によって組み立てられ、ウイルスエンベロープタンパク質1を発現する感染細胞膜から芽を出す。従って、レトロウイルスギャグタンパク質を用いて高力インフルエンザppsを得て、インフルエンザHAおよびNAを発現する細胞膜上に芽を生成することができる。これまでの研究では、すべての組み合わせにおけるHA/NAは機能的であり、ウイルスライフサイクル16、17、18、20、21で対応する機能を実行することができました。これらのppsは、ヘマグルチン酸、ノイラミニダーゼ活性、HA受容体結合トロピズム、および感染性を含むインフルエンザの生物学的特性を調べるために使用されます。HAとNAはいずれもウイルスのライフサイクルにおいて重要な表面機能タンパク質であるため、異なるインフルエンザに由来するHAとNAの不一致は、それらの間の再分け合いを部分的に示すことができる。ここでは、3プラスミド擬似タイピングシステムを用いて、2つのHAと2つのNA(HPAI H5N1株とH7N9染色に由来する)を組み合わせて8種類のインフルエンザppsを生成します。ppsのこれらの8つのタイプは、2つのネイティブpps、H5N1pp、H7N9ppが含まれています。2 つの不一致の pps, (H5+N9)pp, (H7+N1)pp;1つの糖タンパク質(HAまたはNA)のみを収容する4つのpps、H5pp、N1pp、H7pp、N9pp.インフルエンザウイルスに関する研究、H5N1およびH7N9などの、バイオセーフティ要件によって制限される。野生インフルエンザウイルス株のすべての研究は、バイオセーフティレベル3(BSL-3)実験室で行われるべきである。擬似型ウイルス粒子技術は、バイオセーフティレベル2(BSL-2)設定で人工ビリオンをパッケージ化するために使用することができます。したがって、ppsは、ヘマグルチニン(HA)とノイラミニダーゼ(NA)の2つの主要な糖タンパク質に応じてインフルエンザウイルスプロセスを研究するためのより安全で有用なツールを表します。
このプロトコルは、3プラスミドコトランスフェクション戦略(図1で概観)を用いたこれらのppsの生成、ppsの定量方法、および感染性検出について説明する。ppの生産には3種類のプラスミドが含まれます(図1)。レトロウイルスGag-Polタンパク質をコードするgag-pol遺伝子をレトロウイルス包装キットからクローニングし、pcDNA 3.1プラスミドに挿入し、pcDNA-Gag-Polと名付けました。緑色蛍光タンパク質をコードする強化された緑色蛍光タンパク質(eGFP)遺伝子をpTRE-EGFPベクターからクローニングし、pcDNA 3.1プラスミドに挿入し、pcDNA-GFPと呼んだ。クローニング中に、プライマーを介して包装シグナル(ƒ)配列を追加した。HA遺伝子およびNA遺伝子を、それぞれpVRC-HAおよびpVRC-NAと名付けられたpVRCプラスミドにクローニングした。最後のプラスミドは融合タンパク質をコードし、目的の他の融合タンパク質と置き換えることができます。当社の擬似タイピングプラットフォームには、pVRC-HAとpVRC-NAの2つの糖タンパク質発現プラスミドが含まれています。これにより、BSL-2設定における異なるウイルス株間の再種合けに関する研究を簡素化することができます。
Protocol
Representative Results
Discussion
このプロトコルでは、BSL-2設定でインフルエンザウイルス擬似型粒子(pp)を生成する方法について説明する。レポータープラスミドpcDNA-GFPはppsに組み込まれ、感染性アッセイでFACSによってppsを定量するために使用することができる。インフルエンザの研究に広く用いられているため、2種類の影響を受けやすい細胞株を選びました。MDCK細胞は、これらの研究で使用される可変不死化ヒト細胞に?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は浙江省医学・健康科学技術計画(グラント番号、2017KY538)、杭州市立医科医療技術計画(グラント番号、OO20190070)、杭州医科、及び杭州医科大学の助成金によって支えられた。技術キープロジェクト(グラント番号、2014Z11)と杭州自治体の自律的な社会開発と科学研究のアプリケーションプロジェクト(グラント番号、20191203B134)。
Materials
| Benzonase Nuclease | Millipore | 70664 | Effective viscosity reduction and removal of nucleic acids from protein solutions |
| Clear Flat Bottom Polystyrene TC-treated Microplates (96-well) | Corning | 3599 | Treated for optimal cell attachment Sterilized by gamma radiation and certified nonpyrogenic Individual alphanumeric codes for well identification |
| Clear TC-treated Multiple Well Plates (6-wells) | Costar | 3516 | Individual alphanumerical codes for well identification Treated for optimal cell attachment Sterilized by gamma irradiation |
| Dulbecco's modified essential medium (DMEM) | Gibco | 11965092 | A widely used basal medium for supporting the growth of many different mammalian cells |
| Fetal bovine serum | Excell | FND500 | fetal bovine sera that can offer excellent value for basic cell culture, specialty research, and specific assays |
| Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) | Beckman coulter | cytoflex | |
| Human alveolar adenocarcinoma A549 cells | ATCC | CRM-CCL-185 | |
| Human embryonic kidney (HEK) HEK-293T/17 cells | ATCC | CRL-11268 | A versatile transfection reagent that has been shown to effectively transfect the widest variety of adherent and suspension cell lines |
| Inverted fluorescent biological microscope | Olympus | BX51-32P01-FLB3 | |
| Inverted light microscope | Olympus | CKX31-12PHP | |
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Invitrogen | 11668019 | Rapid, sensitive and precise probe-based qPCR detection and quantitation of target RNA targets. |
| Luna Universal Probe One-Step RT-qPCR Kit | NEB | E3006L | Will withstand up to 14,000 RCF RNase-/DNase-free Nonpyrogenic |
| Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) cells | ATCC | CCL-34 | |
| MaxyClear Snaplock Microcentrifuge Tube (1.5 mL) | Axygen | MCT-150-C | 33 mm, gamma sterilized |
| Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45 µm, PVDF | Millipore | SLHV033RS | an improved Minimal Essential Medium (MEM) that allows for a reduction of Fetal Bovine Serum supplementation by at least 50% with no change in cell growth rate or morphology. Opti-MEM I medium is also recommended for use with cationic lipid transfection reagents, such as Lipofectamine reagent. |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Gibco | 11058021 | The antibiotics penicillin and streptomycin are used to prevent bacterial contamination of cell cultures due to their effective combined action against gram-positive and gram-negative bacteria. |
| penicillin-streptomycin | Gibco | 15140122 | Maximum RCF is 12,500 xg Temperature range from -80 °C to 120 °C RNase-/DNase-free Sterile |
| PP Centrifuge Tubes (15 mL) | Corning | 430791 | a stable and highly reactive serine protease |
| Proteinase K | Beyotime | ST532 | Treated for optimal cell attachment Sterilized by gamma radiation and certified nonpyrogenic |
| TC-treated Culture Dish (60mm) | Corning | 430166 | Trypsin from bovine pancreas TPCK Treated, essentially salt-free, lyophilized powder, ≥10,000 BAEE units/mg protein |
| TPCK-trypsin | Sigma | T1426 | This liquid formulation of trypsin contains EDTA and phenol red. Gibco Trypsin-EDTA is made from trypsin powder, an irradiated mixture of proteases derived from porcine pancreas. Due to its digestive strength, trypsin is widely used for cell dissociation, routine cell culture passaging, and primary tissue dissociation. The trypsin concentration required for dissociation varies with cell type and experimental requirements. |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Gibco | 25200056 |
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