ייצור של שפעת מדבקת גבוהה-Titer חלקיקים מוקלדים עם מעטפה גליקורופנס מH5N1 פתוגניים מאוד H7N9 וירוסים העופות
Summary
פרוטוקול זה מתאר תהליך ניסיוני כדי לייצר מעטפת מדבקת ויראלי מידבקת (עמ’) עם גליקורופנים מעטפות משתי שפעת זנים וכיצד לקבוע את הנגועים. פרוטוקול זה מאוד להתאמה כדי לפתח pps של כל סוג אחר של וירוסים עטוף עם מעטפה שונה גליקורופנס.
Abstract
השידור הישיר מדי פעם של שפעת העופות פתוגניים מאוד וירוס H5N1 (HPAI H5N1) ו H7N9 לבני אדם הקשה שלהם הם בעיות חמורות בריאות הציבור ולהציע את האפשרות של מגיפה. עם זאת, ההבנה המולקולרית שלנו של הנגיף היא בסיסית, ויש צורך ללמוד את המאפיינים הביולוגיים של חלבונים המעטפה שלה כמטרות טיפוליות ולפתח אסטרטגיות כדי לשלוט בזיהום. פיתחנו חלקיק ויראלי מוצק שהוקלדו חלקיקים (pp) פלטפורמת ללמוד וירוס שפעת העופות, כולל ניתוח פונקציונלי של hemagglutinin (HA) ו-נוירואמינידאז (NA) מעטפות מאפיינים, המאפיינים של ובתאום מראש של ונאס, קולטנים, הטרופיאמים, נטרול נוגדנים, אבחון, הנגועים, למטרות פיתוח התרופה ועיצוב החיסון. כאן, אנו מתארים הליך ניסיוני כדי ליצור pps עם מעטפה גליקורופטנס (HA, NA) משתי שפעת זנים (HAPI H5N1 ו 2013 H7N9 העופות). הדור שלהם מבוסס על היכולת של וירוסים מסוימים, כגון וירוס לוקמיה murine (MLV), לשלב גליקורופנים מעטפה לתוך pp. בנוסף, אנו גם פירוט כיצד pps אלה הם כימות עם RT-qPCR, ואת זיהוי הנגועים של pps וירוס לא תואם בהתאם למקור של יש ו-NAs. מערכת זו היא גמישה מאוד וישימה וניתן להשתמש בה כדי ליצור pps ויראלי עם גליקורופנים מעטפות שניתן לשלב בכל סוג אחר של וירוס עטוף. כך, פלטפורמת חלקיקים ויראלית זו ניתן להשתמש כדי ללמוד וירוסים פראי בחקירות מחקר רבות.
Introduction
המשימה של חלקיק נגיפי היא להעביר את הגנום שלה מתא מארח נגוע לתא מארח לא נגוע, כדי להעביר אותו לתוך הציטופלסמה או הגרעין בצורה המוסמכת לשכפול1. תהליך זה מופעל בתחילה על ידי קשירה של קולטני תאים מארחים, ולאחריו פיוז’ן של וריריון וקרומים סלולריים. עבור וירוסים עטופים, כמו וירוסי שפעת, גליקורופורינים ספייק הם אחראים על כריכת קולטן ופיוז’ן1,2. מעטפה נגיפית גליקורופנס (למשל, פירוגנס, אנטיגנים), מעורבים בתכונות ואירועים חשובים רבים, כגון מחזור חיים של וירוס (איגוד והיתוך), פתוגנזה ויראלי, חיסוני, מארח תאים אפופטוזיס ו הסלולר tropism, מסלול endocytic הסלולר, כמו גם הילוכים הבינמינים והקצאה1,3,4,5,6,7. מחקר על מעטפה נגיפית גליקורופנס יסייע לנו להבין היבטים רבים של תהליך הזיהום הנגיפי. חלקיקים ויראליות מסוג פסבדו (pp), הנקראת גם פסבדו-מאמרים או פסבדו-מוצרים, ניתן ליצור דרך טכניקת הקלדה מדומה8,9,10. טכנולוגיה זו שימש לפיתוח חלקיקים מוקלדים של וירוסים רבים, כולל צהבת C11,12, צהבת B13, vesicular stomatitis וירוס (vsv)14,15, וירוס שפעת16,17,18,19. טכנולוגיה זו מבוססת על חלבון מחסום-פול של וירוסים או הרטרוירוסים אחרים.
חלקיקי חלקיקים מוקלדים ניתן להשיג באמצעות מערכת שלוש-פלמיד על ידי הפרדת מעטפה נגיפית גליקופרוטאין ביטוי פלבאריבאמצע, אריזה retroviral יעיל החסר המעטפה עטפה גן, ו כתבת נפרדת בתוך pp מפיק תאים. הרטרו וירוס מורכב על ידי חלבון מחסום שלו, והוא ניצנים מקרום התא נגוע המבטא את מעטפת וירוס חלבון1. לכן, אפשר להשיג שפעת סיכוייו גבוה pps באמצעות וירוס מחסום חלבון לייצר ניצנים על קרום הסלולר המבטא שפעת HA ו-NA. במחקרים הקודמים שלנו, יש/NAs בכל השילובים היו פונקציונליים מסוגל לבצע את הפונקציות המתאימות שלהם במחזור החיים הנגיפי16,17,18,20,21. Pps אלה משמשים כדי לחקור מאפיינים ביולוגיים שפעת, כולל hemagglutination פעילות עצבית, מחייב הקולטן הפאיזם, והנגועים. בגלל HA ו-NA הם שניהם משטח חשוב חלבונים פונקציונליים במחזור החיים הנגיפי, לא תואם יש NAs נגזר זנים שונים של שפעת יכול בחלקו להפגין הקצאה מחדש ביניהם. כאן, אנו מייצרים שמונה סוגים של pps שפעת על ידי שילוב 2 יש ושתי NAs (נגזר המתח HPAI H5N1 ואת הכתם H7N9), באמצעות מערכת שלושה פלמיד הקלדה מדומה. אלה שמונה סוגים של pps כוללים שני pps מקורית, H5N1pp, H7N9pp; שני pps לא תואמים, (H5 + N9) pp, (H7 + N1) עמ’; ו 4 pps רק מחסה גליקופרוטאין יחיד (HA או NA), H5pp, N1pp, H7pp, N9pp. מחקרים על וירוס שפעת, כגון H5N1 ו H7N9, מוגבלים על ידי דרישות אבטחה טיחות. כל המחקרים של זנים וירוס שפעת הבר צריך להתבצע ברמה אבטחה טיחות 3 (bsl-3) המעבדה. ניתן להשתמש בטכנולוגיית חלקיקים מסוג ויראלי לאריזת וירוס מלאכותי בקביעת רמת בטיחות 2 (BSL-2). לכן, pps מייצגים כלי בטוח ושימושי כדי ללמוד את תהליכי וירוס שפעת בהתאם לשני הגליקורופנים העיקריים שלה: hemagגלוטין (HA) ו נוירואמינידדאז (NA).
פרוטוקול זה מתאר את הדור של ה-pps האלה עם אסטרטגיית שלוש-פלאמטר (מוצג מראש באיור 1), כיצד לכמת pps וזיהוי הנגועים. הייצור pp כולל שלושה סוגים של פלמידים (איור 1). הגן מחסום-פול , אשר מקודד את החלבון מחסום וירוס-פול, שוכפל מערכת אריזה רטרווירוס והוכנס לתוך pcdna 3.1 פלאמיד ונקרא pcdna-מחסום-פול. חלבון פלורסנט ירוק משופר (eGFP) גן, אשר מקודד חלבון פלורסנט ירוק, שוכפל מ pTRE-EGFP וקטור, הוכנס לתוך pcDNA 3.1 פלאמיד, וקרא pcDNA-GFP. במהלך השכפול, התווסף אות אריזה (ענבל) באמצעות צבע. הגנים HA ו-NA שוכללו לתוך פלאמבאמצע pVRC, בשם pVRC-HA ו pVRC-NA, בהתאמה. הפלסטיות האחרון מקודד את חלבון ההיתוך והוא יכול להיות מוחלף עם חלבון פיוז’ן אחר של ריבית. פלטפורמת ההקלדה המדומה שלנו כוללת שני ביטויים גליקופרוטאין: pVRC-HA ו-pVRC-NA. זה יכול לפשט את המחקר על הסדר מחדש בין זנים וירוסים שונים בהגדרה BSL-2.
Protocol
Representative Results
Discussion
בפרוטוקול זה, אנו מתארים שיטה לייצר חלקיקים מוקלדים וירוס שפעת (pp) בהגדרה BSL-2. הכתב פלבאמצע pcDNA-GFP משולבים pps והוא יכול לשמש לכמת pps על ידי FACS בתוך שיטת הנגועים. בחרנו שני סוגים של קווי תאים רגישים כי הם נמצאים בשימוש נרחב במחקר שפעת. התאים MDCK יספק שליטה טובה על המשתנה התאים האנושיים המשמשים במ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכת על ידי מענקים של הרפואה המחוזית ג’ה-ג’יאנג ומדעי הבריאות תוכנית טכנולוגיה (גרנט מספרים, 2017ky538), האנגג רפואה עירונית ומדעי הבריאות תוכנית טכנולוגיה (גרנט מספרים, OO20190070), האנגג מדע רפואי ו מפתח טכנולוגיה פרויקט (גרנט מספרים, 2014Z11) ו האנגג העירוני היישומים האוטונומית פרויקט של התפתחות חברתית מחקר מדעי (גרנט מספרים, 20191203B134).
Materials
| Benzonase Nuclease | Millipore | 70664 | Effective viscosity reduction and removal of nucleic acids from protein solutions |
| Clear Flat Bottom Polystyrene TC-treated Microplates (96-well) | Corning | 3599 | Treated for optimal cell attachment Sterilized by gamma radiation and certified nonpyrogenic Individual alphanumeric codes for well identification |
| Clear TC-treated Multiple Well Plates (6-wells) | Costar | 3516 | Individual alphanumerical codes for well identification Treated for optimal cell attachment Sterilized by gamma irradiation |
| Dulbecco's modified essential medium (DMEM) | Gibco | 11965092 | A widely used basal medium for supporting the growth of many different mammalian cells |
| Fetal bovine serum | Excell | FND500 | fetal bovine sera that can offer excellent value for basic cell culture, specialty research, and specific assays |
| Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) | Beckman coulter | cytoflex | |
| Human alveolar adenocarcinoma A549 cells | ATCC | CRM-CCL-185 | |
| Human embryonic kidney (HEK) HEK-293T/17 cells | ATCC | CRL-11268 | A versatile transfection reagent that has been shown to effectively transfect the widest variety of adherent and suspension cell lines |
| Inverted fluorescent biological microscope | Olympus | BX51-32P01-FLB3 | |
| Inverted light microscope | Olympus | CKX31-12PHP | |
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Invitrogen | 11668019 | Rapid, sensitive and precise probe-based qPCR detection and quantitation of target RNA targets. |
| Luna Universal Probe One-Step RT-qPCR Kit | NEB | E3006L | Will withstand up to 14,000 RCF RNase-/DNase-free Nonpyrogenic |
| Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) cells | ATCC | CCL-34 | |
| MaxyClear Snaplock Microcentrifuge Tube (1.5 mL) | Axygen | MCT-150-C | 33 mm, gamma sterilized |
| Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45 µm, PVDF | Millipore | SLHV033RS | an improved Minimal Essential Medium (MEM) that allows for a reduction of Fetal Bovine Serum supplementation by at least 50% with no change in cell growth rate or morphology. Opti-MEM I medium is also recommended for use with cationic lipid transfection reagents, such as Lipofectamine reagent. |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Gibco | 11058021 | The antibiotics penicillin and streptomycin are used to prevent bacterial contamination of cell cultures due to their effective combined action against gram-positive and gram-negative bacteria. |
| penicillin-streptomycin | Gibco | 15140122 | Maximum RCF is 12,500 xg Temperature range from -80 °C to 120 °C RNase-/DNase-free Sterile |
| PP Centrifuge Tubes (15 mL) | Corning | 430791 | a stable and highly reactive serine protease |
| Proteinase K | Beyotime | ST532 | Treated for optimal cell attachment Sterilized by gamma radiation and certified nonpyrogenic |
| TC-treated Culture Dish (60mm) | Corning | 430166 | Trypsin from bovine pancreas TPCK Treated, essentially salt-free, lyophilized powder, ≥10,000 BAEE units/mg protein |
| TPCK-trypsin | Sigma | T1426 | This liquid formulation of trypsin contains EDTA and phenol red. Gibco Trypsin-EDTA is made from trypsin powder, an irradiated mixture of proteases derived from porcine pancreas. Due to its digestive strength, trypsin is widely used for cell dissociation, routine cell culture passaging, and primary tissue dissociation. The trypsin concentration required for dissociation varies with cell type and experimental requirements. |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Gibco | 25200056 |
References
- Knipe, D. M., Howley, P. M. . Fields Virology (6th). , (2013).
- White, J. M., Delos, S. E., Brecher, M., Schornberg, K. Structures and mechanisms of viral membrane fusion proteins: multiple variations on a common theme. Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology. 43 (3), 189-219 (2008).
- Bright, R. A., et al. Cross-clade protective immune responses to influenza viruses with H5N1 HA and NA elicited by an influenza virus-like particle. PLoS One. 3 (1), 1501 (2008).
- Yang, J., et al. Reliability of pseudotyped influenza viral particles in neutralizing antibody detection. PLoS One. 9 (12), 113629 (2014).
- Wyatt, R., Sodroski, J. The HIV-1 envelope glycoproteins: fusogens, antigens, and immunogens. Science. 280 (5371), 1884-1888 (1998).
- Joe, A. K., Foo, H. H., Kleeman, L., Levine, B. The transmembrane domains of Sindbis virus envelope glycoproteins induce cell death. Journal of Virology. 72 (5), 3935-3943 (1998).
- Albecka, A., Laine, R. F., Janssen, A. F., Kaminski, C. F., Crump, C. M. HSV-1 Glycoproteins Are Delivered to Virus Assembly Sites Through Dynamin-Dependent Endocytosis. Traffic. 17 (1), 21-39 (2016).
- Huang, A. S., Palma, E. L., Hewlett, N., Roizman, B. Pseudotype formation between enveloped RNA and DNA viruses. Nature. 252 (5485), 743-745 (1974).
- Rubin, H. Genetic Control of Cellular Susceptibility to Pseudotypes of Rous Sarcoma Virus. Virology. 26, 270-276 (1965).
- Steffen, I., Simmons, G. Pseudotyping Viral Vectors With Emerging Virus Envelope Proteins. Current Gene Therapy. 16 (1), 47-55 (2016).
- Bartosch, B., Dubuisson, J., Cosset, F. L. Infectious hepatitis C virus pseudo-particles containing functional E1-E2 envelope protein complexes. Journal of Experimental Medicine. 197 (5), 633-642 (2003).
- Bian, T., Zhou, Y., Bi, S., Tan, W., Wang, Y. HCV envelope protein function is dependent on the peptides preceding the glycoproteins. Biochemical and Biophysical Research Communications. 378 (1), 118-122 (2009).
- Gudima, S., Meier, A., Dunbrack, R., Taylor, J., Bruss, V. Two potentially important elements of the hepatitis B virus large envelope protein are dispensable for the infectivity of hepatitis delta virus. Journal of Virology. 81 (8), 4343-4347 (2007).
- Yoshida, Y., Emi, N., Hamada, H. VSV-G-pseudotyped retroviral packaging through adenovirus-mediated inducible gene expression. Biochemical and Biophysical Research Communications. 232 (2), 379-382 (1997).
- Burns, J. C., Friedmann, T., Driever, W., Burrascano, M., Yee, J. K. Vesicular stomatitis virus G glycoprotein pseudotyped retroviral vectors: concentration to very high titer and efficient gene transfer into mammalian and nonmammalian cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (17), 8033-8037 (1993).
- Zhang, F., et al. Characterization of pseudoparticles paired with hemagglutinin and neuraminidase from highly pathogenic H5N1 influenza and avian influenza A (H7N9) viruses. Virus Research. 253, 20-27 (2018).
- Zhang, F., et al. Infectivity of Pseudotyped Particles Pairing Hemagglutinin of Highly Pathogenic Avian Influenza a H5N1 Virus with Neuraminidases of The 2009 Pandemic H1N1 and a Seasonal H3N2. Journal of Bioterrorism & Biodefense. 2, 104 (2011).
- Wu, J., et al. Characterization of neuraminidases from the highly pathogenic avian H5N1 and 2009 pandemic H1N1 influenza A viruses. PLoS One. 5 (12), 15825 (2010).
- Nefkens, I., et al. Hemagglutinin pseudotyped lentiviral particles: characterization of a new method for avian H5N1 influenza sero-diagnosis. Journal of Clinical Virology. 39 (1), 27-33 (2007).
- Zhang, Y., et al. Hemagglutinin and neuraminidase matching patterns of two influenza A virus strains related to the 1918 and 2009 global pandemics. Biochemical and Biophysical Research Communications. 387 (2), 405-408 (2009).
- Lin, X., et al. Oseltamivir boosts 2009 H1N1 virus infectivity in vitro. Biochemical and Biophysical Research Communications. 390 (4), 1305-1308 (2009).
- McKay, T., Patel, M., Pickles, R. J., Johnson, L. G., Olsen, J. C. Influenza M2 envelope protein augments avian influenza hemagglutinin pseudotyping of lentiviral vectors. Gene Therapy. 13 (8), 715-724 (2006).
- Pan, H., et al. Autophagy mediates avian influenza H5N1 pseudotyped particle-induced lung inflammation through NF-kappaB and p38 MAPK signaling pathways. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 306 (2), 183-195 (2014).
- Szecsi, J., et al. Induction of neutralising antibodies by virus-like particles harbouring surface proteins from highly pathogenic H5N1 and H7N1 influenza viruses. Virology Journal. 3, 70 (2006).
- Garcia, J. M., Lagarde, N., Ma, E. S., de Jong, M. D., Peiris, J. S. Optimization and evaluation of an influenza A (H5) pseudotyped lentiviral particle-based serological assay. Journal of Clinical Virology. 47 (1), 29-33 (2010).
- Garcia, J. M., Lai, J. C. Production of influenza pseudotyped lentiviral particles and their use in influenza research and diagnosis: an update. Expert Review of Anti-infective Therapy. 9 (4), 443-455 (2011).
- Haynes, J. R., et al. Influenza-pseudotyped Gag virus-like particle vaccines provide broad protection against highly pathogenic avian influenza challenge. Vaccine. 27 (4), 530-541 (2009).
- Schmeisser, F., et al. Production and characterization of mammalian virus-like particles from modified vaccinia virus Ankara vectors expressing influenza H5N1 hemagglutinin and neuraminidase. Vaccine. 30 (23), 3413-3422 (2012).
- Liu, Y. V., et al. Chimeric severe acute respiratory syndrome coronavirus (SARS-CoV) S glycoprotein and influenza matrix 1 efficiently form virus-like particles (VLPs) that protect mice against challenge with SARS-CoV. Vaccine. 29 (38), 6606-6613 (2011).
- Moeschler, S., Locher, S., Conzelmann, K. K., Kramer, B., Zimmer, G. Quantification of Lyssavirus-Neutralizing Antibodies Using Vesicular Stomatitis Virus Pseudotype Particles. Viruses. 8 (9), 254 (2016).
- Lai, A. L., Millet, J. K., Daniel, S., Freed, J. H., Whittaker, G. R. The SARS-CoV Fusion Peptide Forms an Extended Bipartite Fusion Platform that Perturbs Membrane Order in a Calcium-Dependent Manner. Journal of Molecular Biology. 429 (24), 3875-3892 (2017).
- Millet, J. K., et al. Middle East respiratory syndrome coronavirus infection is inhibited by griffithsin. Antiviral Research. 133, 1-8 (2016).
- Millet, J. K., et al. Production of Pseudotyped Particles to Study Highly Pathogenic Coronaviruses in a Biosafety Level 2 Setting. Journal of Visualized Experiments. (145), e59010 (2019).
- Ma, M., et al. Murine leukemia virus pseudotypes of La Crosse and Hantaan Bunyaviruses: a system for analysis of cell tropism. Virus Research. 64 (1), 23-32 (1999).
- Wool-Lewis, R. J., Bates, P. Characterization of Ebola virus entry by using pseudotyped viruses: identification of receptor-deficient cell lines. Journal of Virology. 72 (4), 3155-3160 (1998).
- Chen, C. M., et al. Production and design of more effective avian replication-incompetent retroviral vectors. Developmental Biology. 214 (2), 370-384 (1999).
- Kaku, Y., et al. Second generation of pseudotype-based serum neutralization assay for Nipah virus antibodies: sensitive and high-throughput analysis utilizing secreted alkaline phosphatase. Journal of Virological Methods. 179 (1), 226-232 (2012).
- Rudiger, D., Kupke, S. Y., Laske, T., Zmora, P., Reichl, U. Multiscale modeling of influenza A virus replication in cell cultures predicts infection dynamics for highly different infection conditions. PLOS Computational Biology. 15 (2), 1006819 (2019).
- Petiot, E., et al. Influenza viruses production: Evaluation of a novel avian cell line DuckCelt(R)-T17. Vaccine. 36 (22), 3101-3111 (2018).
